Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1. Описание заболевания 5
1.1. Вредоносность 5
1.2.Симптомы болезни 6
1.3. Биология возбудителя заболевания 7
2. Динамика популяций P.infestans 8
2.1.Происхождение и мировое распространение патогена 8
3. Генетические маркеры в изучении популяций P.infestans 15
3.1. Селективно нейтральные маркеры: полиморфизм электрофор етически разделенных белков полиморфизм митохондриальной ДНК 16
3.2. Селективно значимые маркеры: тип спаривания и образование ооспор агрессивность и вирулентность P.infestans 22
4. Обзор лабораторных методов изучения признака агрессивности P.infestans 25
Глава 2. Основные материалы и методы 32
Глава 3. Изучение поуляций P.infestans 45
1. Изучение типов спаривания популяций P.infestans на Европейской территории Российской Федерации 47
2. Сравнение гаплотипов митохондриальной ДНК и изоферментных локусов регионально отдаленных популяций P.infestans на Европейской территории Российской Федерации 52
3. Изучение происхождения и морфологии ооспор в подмосковных популяциях P.infestans 55
4. Сравнение полевого и лабораторного методов оценки частичной устойчивости сортов картофеля к P.infestans 62
5. Сравнение степени агрессивности некоторых региональных популяций P. infestans 65
6. Сравнение показателя агрессивности с некоторыми другими признаками, характеризующими популяцию P. infestans 68
Общие выводы и рекомендации производству 69
Благодарности 72
Список опубликованных
печатных работ по теме диссертации 72
Список цитированной литературы 74
Приложение 86
- Биология возбудителя заболевания
- Селективно нейтральные маркеры: полиморфизм электрофор етически разделенных белков полиморфизм митохондриальной ДНК
- Селективно значимые маркеры: тип спаривания и образование ооспор агрессивность и вирулентность P.infestans
- Сравнение гаплотипов митохондриальной ДНК и изоферментных локусов регионально отдаленных популяций P.infestans на Европейской территории Российской Федерации
Введение к работе
Картофель принадлежит к числу важнейших сельскохозяйственных культур. В мировом производстве продукции растениеводства картофель, занимает одно из ведущих мест, наряду с пшеницей, кукурузой, рисом.
Российская Федерация занимает одно из лидирующих положений в мире по уровню валового производства картофеля. Доля России в мировом производстве этой культуры составляет около 10%. В 2002 г. в хозяйствах всех категорий Российской Федерации картофель выращивался на площади 3,2 млн. гектаров, валовой сбор составил 31,2 млн.т. (данные Министерства сельского хозяйства России).
К числу важнейших проблем в большинстве стран, производящих картофель, относятся существенные потери урожая, из-за поражения культуры различными вредителями, болезнями и, в частности, фитофто-розом.
В России потери урожая картофеля от фитофтороза колеблются от 10 до 60% в зависимости от региональных природно-климатических, агрометеорологических условий выращивания, устойчивости сортов и других факторов и составляют в среднем 4 млн. тонн в год (Наумова, 1961; Локтина, 1969; Дорожкин и др., 1976; Попкова, 1989; Филиппов и др., 2001) .
Среди основных мероприятий, направленных на сокращение потерь урожая картофеля от фитофтороза, в настоящее время наиболее эффективными являются химические методы защиты и возделывание устойчивых сортов.
Методы химической защиты позволяют существенно сократить потери урожая клубней, однако имеют существенные недостатки. С экономической точки зрения они являются дорогостоящими, так как требуют больших затрат на закупку препаратов и проведение химических обработок значительных площадей, занятых под картофелем. С биологической -могут приводить к нарушению естественных биоценозов, что имеет большое значение с точки зрения охраны окружающей среды.
Создание устойчивых сортов дает возможность существенно сократить применение химических обработок фунгицидами. Однако, как известно, устойчивость к фитофторозу новых сортов обычно недолговечна. Сложность задачи заключается, с одной стороны, в недостаточной изученности механизмов устойчивости хозяина, а с другой - в высокой изменчивости самого фитопатогена - возбудителя болезни.
Изменчивость Phytophthora infestans проявляется в образовании новых, более вирулентных и агрессивных форм патогена, способных преодолевать защитные реакции ранее устойчивых сортов, а также в приобретении устойчивости к некоторым фунгицидам.
В этой связи, изучение микроэволюционных процессов, протекающих на уровне региональных популяций, позволяет больше приблизиться к пониманию закономерностей формирования новых популяций патогена, и, на этой основе, прогнозировать динамику его свойств и, с учетом полученных сведений, планировать систему защитных мероприятий.
Цели работы
Целями наших исследований было сравнительное изучение популяций фитопатогена P. infestans в различных регионах Европейской части Российской Федерации по нескольким характеризующим популяцию маркерам (признакам), изучение ооспорообразования на примере популяций выделенных в условиях Московской области, сравнение полевого и лабораторного методов оценки частичной устойчивости сортов картофеля к P. infestans и сравнение степени агрессивности некоторых региональных популяций.
Исследования проводились в следующих направлениях: 1. Изучение динамики генотипического состава популяций на территории различных регионов Европейской части Российской Федерации за период с 1999-2002 г.г. по маркерам: тип совместимости (спаривания), полиморфизм митохондриальной ДНК, полиморфизм электрофоретически разделенных белков.
Изучение морфологии ооспор на примере популяций, выделенных в условиях Московской области.
Сравнение полевого и лабораторного методов оценки частичной устойчивости сортов картофеля к P.infestans.
Сравнение степени агрессивности некоторых региональных популяций P. infestans.
Биология возбудителя заболевания
Возбудителя болезни Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу ранее относили к царству Mycota, отделу Oomycota, классу Oomycetes, порядку Peronosporales, семейству Phytophtoraceae (Дудка, Бурдюкова, 1996). Гарибова (1999) в своих работах отмечает, что оомицеты имеют сходный с водорослями половой процесс, имеют разножгутиковые зооспоры, трубчатые, а не лентовидные, как у грибов, кристы митохондрий, не имеют хитина в клеточной стенке, но содержат целлюлозу, что не позволяет называть этот объект грибом. В своей монографии, Мюллер и Леффлер (1995) вьщеляют класс Oomycetes в порядок Oomycota и относят не к грибам, а к грибоподобным протистам. Общепринятая схема механизма заражения представлена следующим образом. Мицелий гриба бесцветный, одноклеточный и многоядерный внедряется в ткань листа через устьица, реже непосредственно врастая в эпидермис. Внутри тканей растения - хозяина мицелий распространяется в межклеточных пространствах. Характерная особенность мицелия: образующиеся на нем многочисленные боковые выросты (гаустории) проникают в клетки питающего растения, а на поверхность листа или клубня через устьица выходят ответвления мицелия - конидиеносцы со спорангиями лимонообразной формы - конидиями. Прорастая при температуре 10-15 С, они образуют обычно от 6 до 16 овальных зооспор с двумя жгутиками. Каждая из них способна прорастать в росток. Внедряясь в субстрат, она инфицирует его.
От места заражения мицелий разрастается во все стороны, разрушает в клетках хлорофилл и крахмал. Ткань теряет тургор, приобретает коричневую окраску и отмирает. Зооспоры играют основную роль в заражении растений и развитии болезни в природных условиях. При более высокой температуре конидии прорастают в ростковые трубки. При неблагоприятных условиях (температура выше 25 С) ростковые трубки утолщаются на конце и превращаются во вторичные конидии (Бордукова, 1967; Горленко, 1976; Новотельнова, 1974). Благоприятными условиями для споруляции являются относительная влажность воздуха близкая к 100% и температура от 18 до 22 С. Росы, туманы, дожди при умеренной температуре способствуют развитию заболевания (Попкова, 1972). В цикле развития гриба существуют покоящиеся зиготы - ооспоры, которые образуются в результате полового процесса. Скрещивание с обильным образованием ооспор, как правило, происходит между штаммами с разными типами совместимости (спаривания)- А1 иА2. Такие ооспоры называют гибридными. Гибридные ооспоры кроме функции возобновления инфекции могут вносить вклад в увеличение генетического разнообразия в популяции (Gallegly, Galindo, 1958; Galindo, Gallegly, 1960). Более подробно этот вопрос освещается в разделе о селективно значимых маркерах. В горных районах Мексики есть долина Тулука, которую П.М. Жуковский в свое время назвал "санаторием для фитофторы". В Тулуке длинные холодные и влажные летние ночи. Во второй половине дня почти ежедневно идут ливневые дожди. Зимы сухие и теплые. Ооспоры гриба могут сохраняться в течение всей зимы в почве. Массовое поражение наблюдается уже через 40 дней после посадки картофеля (Горленко, Соколов и др. 1976). Мексиканская популяция фитофторы представляет собой большое разнообразие генотипов, наличие в равном соотношении А1 и А2 типов спаривания, полового процесса и гибридных ооспор (Niederhauser, 1956; Tooley et al., 1985; Fry et al., 1992), всех известных аллелей изоферментов и фингерпринтов ДНК (Goodwin, Spielman, 1992). Мексиканские изоляты также содержат наибольшее количество генов вирулентности. (Mills, Niederhauser, 1953; Rivera-Репа, 1988; Tooley et al., 1986). Высокая степень генетического разнообразия популяций Центральной Мексики позволила ученым предположить этот регион в качестве центра происхождения P. infestans (Fry, Spielman, 1991а; Niederhauser, 1991). По другой теории центром происхождения гриба предлагают считать перуанские Анды (Abad Z.G., Abad J.А, 1995). В настоящее время фитопатоген встречается на всех континентах, а уровень агрессивности и генетического разнообразия отдельных популяций близок к мексиканскому. Несмотря на прорыв в методах изучения фитопатогена многие вопросы касающиеся мирового распространения P. infestans остаются предметом дискуссий и нуждаются в дополнительных фактах. На этот счет имеется несколько гипотез. Так версия У. Фрая из Корнеллского университета основывается на исследовании нейтральных признаков P. infestans и наиболее популярна. Фрай предположил, что в истории фитофтороза картофеля было несколько волн миграции из Мексики в другие районы.
Селективно нейтральные маркеры: полиморфизм электрофор етически разделенных белков полиморфизм митохондриальной ДНК
Разделение белков в электрическом поле оказалось исключительно удобным методом для установления структуры популяций различных организмов (Левонтин и др., 1984). Для его проведения на пластину полиак-риламидного или крахмального геля, помещенную в электрическое поле, наносят белковые препараты из изучаемых организмов. Скорость диффузии в геле отдельных белков зависит от заряда и молекулярной массы, поэтому в электрическом поле происходит разделение смеси белков на отдельные фракции, которые можно визуализировать с помощью специальных красителей на белок или на отдельные ферменты. Электрофоре-тические исследования белков показали, что большинство ферментов существует в организмах в виде нескольких, различающихся по электрофо-ретической подвижности фракций. Эти фракции - результат кодирования множественных форм ферментов разными локусами (изозимы) или разными аллелями одного локуса (аллозимы) (Корочкин и др., 1977; Остер-ман 1981; Дьяков, 1980; Richardson et al., 1986). Более пятидесяти различных систем энзим протестировано у P.infestans (Spielman, et al., 1990). Некоторые энзимы оказались полиморфны и удобны для анализа. К ним относятся глюкозо-6-фосфат изо-мераза (Gpi), пептидаза (Pep), малик-энзим (Me), манносефосфат изоме-раза (Мрі), и ксантин дегидрогеназа (Xdh) (Tooley, et al., 1985). Из оставшихся энзим - семь оказались полиморфными, но неудовлетворительными для интерпретации, следующие семь с большим числом полос; десять были мономорфны и двадцать две не обнаруживались в различных буферных системах (Spielman, et al., 1991). В настоящее время в популяционных исследованиях P. infestam чаще всего используют глюкозо-6-фосфат изомеразу (Gpi) и пептидазу (Pep). Семь аллелей локуса глюкозо-6-фосфат иэомеразы было выявлено и шесть охарактеризовано генетически. Также шесть аллелей было выявлено и четыре охарактеризовано по пептидазе (Shattock et al., 1986а; Spielman, 1991;Mosaetal., 1992).
Важно отметить, что при оптимально подобранных условиях и использовании нескольких буферных систем изоферментный анализ дает хорошую оценку, но, наряду с этим, множество аллельных вариаций не отличаются по мобильности исследуемого белка и поэтому не учитываются при помощи изозимного анализа (Michelmore, 1987). Из-за этих ограничений наибольший интерес представляют методы, позволяющим оценить полиморфизм на уровне ДНК. Полиморфизм митохондриальной ДНК (мтДНК) P. infestans особенно интересен в мониторинге популяций; он легко выявляется и наследуется по материнской линии. Полиморфизм был изучен ранее посредством гибридизации тотальной ДНК с меченой клонированной мтДНК (Goodwin et al., 1991; de Cock et al., 1992). Тотальная ДНК P. infestans может быть разделена на богатую аденозином и тимином, менее плотную митохондриальную фракцию и ядерную ДНК посредством обработок бисбензимидом и центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия (Carber, Yoder, 1983). Для некоторых рестриктаз была построена рестрикционная карта митохондриальной ДНК, которая представляет собой замкнутую молекулу в 36,2 kb (Klimczac, Prell, 1984). Исследование изолятов P. infestans из разных стран показало наличие 6 различных генотипов, различающихся по мтДНК (Carter et al., 1990; Goodwin, 1990; Show, 1991). Группа П(В) отличается от группы 1(A) вставкой в 0,3 кб., определяемой при обработке рестриктазой Mspl. Группа В была обнаружена в Северной Мексике, Бразилии, Калифорнии, Нидерландах, Великобритании, Египте, Израиле и Японии, но не найдена в Центральной Мексике. Goodwin (1990) выделил морфы Ш(С) (отличающаяся вставкой в 1,5 кб.) и IIII(D), имеющую 2 дополнительных Есо R1 фрагмента. Морфа Ш(С) найдена в единственном изоляте из Перу, а IIII(D) обнаружена в Центрально-мексиканских и Перуанских штаммах. Картер (Carter et al., 1990) идентифицировал варианты морфы 1(A): 1а, отличающийся на картинке электрофореграммы дополнительной полосой размером в 5,9 кб. по Mspl, и 1в, отличающийся наличием двух полос (5,35 кб + 0,6 кб). 1в тип был обнаружен в изолятах из Бразилии, США, Ирландии и Англии. Один из Калифорнийских изолятов был идентифицирован как Пв. Он не имел светящейся типичной для И(В) типа полосы 14.8 по рестриктазе Hhal, но имел две допонительные полосы (9,6кб+5,2кб). В настоящее время для выявление полиморфизма мт ДНК широко применяется метод рестрикции и амплификации полиморфных фрагментов (РФЛПи) на основе техники полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1987).
Суть метода заключается в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами в каждом из множества повторяющихся циклов. Праймеры ограничивают исследуемый участок ДНК, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы, и служат затравками, на которые садится фермент, способный к синтезу полной копии ограниченной последовательности. В процессе реакции происходит циклическое повторение трех этапов: 1. денатурации, или расплетения комплементарных нитей ДНК. 2. связывания (отжига) праймеров с матричной ДНК; 3. элонгации, или удлинения участка исследуемой ДНК Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2П, где п - число прошедших циклов амплификации.
Селективно значимые маркеры: тип спаривания и образование ооспор агрессивность и вирулентность P.infestans
Как известно, устойчивость сортов картофеля к фитофторозу контролируется двумя типами генов: R - генами, придающими зараженным клеткам сверхчувствительность к определенным расам гриба (Black, 1952) и полигенной системой, которая определяет относительную устойчивость ко всем без исключения расам (Toxopeus, 1959). Расоспецифическая или вертикальная устойчивость обеспечивается благодаря специфическим доминантными R - генам, которые были введены в Solanum tuberosum из дикорастущих видов, в частности из Solarium demissum. Механизм действия вертикальной устойчивости основывается на сверхчувствительной реакции несовместимости (Дьяков, Филиппович, 1967), обеспечивая иммунитет к определенной группе рас P.infestans. В свою очередь фитопатоген способен преодолевать тот или иной барьер устойчивости, обусловливаемый R - генами. Эту способность однородного штамма фитофторы вызывать болезнь у определенных растений - хозяев, то есть патогенность по отношению к определенным сортам принято обозначать как вирулентность расы (Эйнсуорт, Байсби, 1945; Дай, 1960; Самборский, 1963). Наиболее часто вирулентность (расовый состав) выявляется искусственным заражением исследуемой популяцией сортов картофеля имеющих известный набор R - генов (дифференциаторов) (Кирай и др., 1974). Использование R - генов для достижения стабильной устойчивости картофеля к фитофторозу не принесло успеха, и селекция на сверхчувствительность была признана безнадежной (Schick, Hopfe, 1962; Black, 1960). Расоспецифическая устойчивость показала нестабильность в связи с тем, что К - гены легко преодолеваются совместимыми вирулентными расами, которые быстро накапливаются в популяциях высокопластичного патогена и сорта теряют свойства устойчивости (Turkensteen, 1993). Полевая (полигенная) или горизонтальная расонеспецифическая устойчивость, контролируется рецессивными генами и направлена не на полное уничтожение патогена, а на сдерживание темпов его развития в растении (Black, 1970). Как правило, полевая устойчивость сопровождается низкой скоростью проникновения патогена в листья, длительным инкубационным периодом, медленным разрастанием поражений и редуцированным спороношением (Niederhauser, 1968). Такая устойчивость является результатом взаимодействия хозяина, возбудителя заболевания и факторов окружающей среды (Knutson, 1962; Kulkarni, Chopra, 1982). Горизонтальная устойчивость обычно более стабильна и одинаково активна против многих рас P. infestans (van der Plank, 1971).
По мнению Ван дер Планка (van der Plank, 1968), продолжительность и стабильность горизонтальной устойчивости достигается за счет равновесия между штаммами патогена, составляющими популяцию, так как в популяции лучше всего приспосабливаются те штаммы, которые по своим метрическим признакам близки к средней. Поэтому наиболее эффективным считается выведение и выращивание сортов с горизонтальной устойчивостью к болезни, или в сочетании ее с вертикальной. Это позволяет более продолжительное время противостоять динамичным изменениям популяций P. infestans (Malcolmson, 1976; Дьяков, Коган, 1966; Чумакова и др., 1983). Поражая сорта картофеля с различным уровнем горизонтальной устойчивости, штаммы P.infestans проявляют различие в показателях ин-фекционности, инкубационного периода и интенсивности споруляции на сортах. Это свойство обозначено термином "агрессивность" или способность патогена поражать ткани растения, развиваться и размножаться в них (Eide et al., 1954) Агрессивные и вирулентные свойства штаммов тесно связаны между собой: вирулентность может проявиться только при наличии агрессивно- сти, то есть при установлении взаимоотношений между паразитом и хозяином. Вместе с тем свойства агрессивности не зависит от вирулентных свойств, и высоковирулентные расы часто уступают по агрессивности маловирулентным (Black 1952; Дьяков 1998). Агрессивные свойства штаммов P.infestans определяют степень горизонтальной устойчивости сортов картофеля. Постепенное увеличение агрессивности патогенного организма может привести к снижению устойчивости, контролируемой многими генами. При этом особую опасность будет представлять повышение агрессивности высоковирулентных рас (Попкова, 1972; Дьяков 1969, 1971). Есть основания предположить, что время от времени, в результате каких - то до настоящего времени непонятных причин, происходят резкие структурные перестройки популяций, дестабилизирующие равновесие между штаммами в популяции патогена. Такого рода перестройки могли наблюдать в 1845 - 1847 г.г., и в 1914 - 1917 г.г. в Европе, а также в 1980 -х годах по настоящее время. Не исключено, что в указанные периоды существенно изменялись агрессивные свойства P. infestans, и, следовательно, уровни частичной устойчивости возделываемых сортов картофеля. В связи с этим, представляется важным уделить наибольшее внимание изучению свойств агрессивности, а не вирулентности популяций P.infestans в основных картофелеводческих регионах нашей страны, особенно когда речь заходит об интродукции в эти регионы новых сортов картофеля. Известно, что проведение полевых экспериментов сопряжено с определенными трудностями. Так, для оценки в полевых условиях необходимо обязательное эпифитотийное развитие болезни и независимо от самопроизвольного или искусственного начала эпифитотии, раннего или позднего, эксперимент подвержен влиянию погодных условий (Umaerus, Lihnell, 1976; Попкова 1976). При слабом или позднем развитии болезни объективно оценить уровень агрессивности популяции невозможно.
Сравнение гаплотипов митохондриальной ДНК и изоферментных локусов регионально отдаленных популяций P.infestans на Европейской территории Российской Федерации
Опыт проводили в 2002 году. Отделенные листья полевых растений картофеля инокулировали штаммами, выделенными в 4-х различных географических пунктах. Использовали инфекционный материал, выделенный в 2001 году. Места выделения тестируемых штаммов P.infestans: Московская, Брянская, Мурманская области, Ставропольский край. Из изолятов каждой региональной популяции было получено по 10 реизолятов. Тестировали 22 сорта картофеля. Опыт проводили в 2 этапа: / Этап. Ранней весной, изучаемые сорта выращивали в климатической камере до фазы развития 5-6 листьев. Изолированные с растений каждого сорта листья инокулировали смесью из 10 изолятов P. infestans, выделенных из каждой изучаемой популяции. После появления фитоф-торозных пятен и спороношения спорангии с листьев каждого сорта отдельно переносили на овсяную агаризованную питательную среду для размножения и повторного тестирования (II Этап). Таким способом из инокулюма элиминировали неэффективные части популяции, то есть штаммы, не способные развиваться на изучаемом сорте (в том числе ави-рулентные к сорту расы). // Этап. Растения изучаемых сортов и эталонного сорта выращивали в полевых условиях. В фазу развития 7-9 листьев с 30 растений каждого сорта отделяли по одному листу. Листья переносили в лабораторию и инокулировали реизолятами патогена с этого же сорта. Измеряли продуктивность спороношения, длину инкубационного периода и размер некрозов. Каждую тестируемую пару "сорт - патоген" сравнивали с эталонной парой (сорт картофеля Сайте, инокулируемый изолятом P.infestans № 161).
При заданных благоприятных для развития фитофто-роза метеорологических условиях растения указанного эталонного сорта, зараженные изолятом № 161 теряют 35% урожая. Для каждой изучаемой пары "сорт - патоген" с помощью компьютерной программы определяли индекс вредоносности, уровень частичной устойчивости и степень агрессивности. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя пакет статистических функций программы Microsoft Excel 2000. Данные о взаимовлиянии Phytophthora infestans - сорт картофеля при заражении листьев различных сортов картофеля реизолятами четырех географически отдаленных популяций патогена представлены в таблице 6. Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что штаммы популяций P. infestans, выделенные в различных регионах Европейской части России, проявляют неодинаковый уровень агрессивности на испытуемых сортах картофеля. Как видно, наиболее высокий уровень агрессивности имеют реизо-ляты Брянской популяции (высокоагрессивны на листьях 14 сортов, и умеренно агрессивны на листьях 8 сортов). Реизоляты Ставропольской, Мурманской и Московской популяций были близки по уровню агрессивности. Ставропольские реизоляты были высокоагрессивны на 9 сортах, умеренно агрессивны на 12 и слабоагрессивны на 1 сорте. Мурманские реизоляты были высокоагрессивны на 8 сортах, умеренно агрессивны на 12 и слабоагрессивны на 2 сортах.
Московские реизоляты были высокоагрессивны на 5 сортах, умеренно агрессивны на 16 и оказались неагрессивны к 1 сорту. Результаты указанного опыта дают основание считать, что сорта картофеля, проявляющие какой либо уровень частичной устойчивости к высокоагрессивной популяции патогена (например, брянской), могут проявить сходный или больший уровень устойчивости к менее агрессивным популяциям. В то же время, сорта, показавшие восприимчивость к высокоагрессивным популяциям, не обязательно будут также восприимчивы к другим популяциям. Поэтому, с практической точки зрения фитофторо-устойчивость сортов картофеля целесообразно оценивать, используя для этих целей штаммы P. infestans наиболее агрессивных популяций.
