Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Генетически модифицированные культуры: распространение и использование в сельскохозяйственном производстве 9
1.2. Генетически модифицированный картофель устойчивый к колорадскому жуку 11
1.3. Фенетическая структура популяций колорадского жука 30
1.3.1. Систематическое положение и морфологические признаки 31
1.3.2. Фены и фенетика 32
1.4. Использование методов молекулярной биологии для анализа генетического полиморфизма популяций насекомых 36
Глава 2. Материалы и методы исследований 43
2.1. Агроклиматические условия в районах исследований 43
2.2. Материалы исследований 51
2.3. Объекты и методы исследований 52
Глава 3. Результаты исследований 60
3.1 Новый комплексный подход к описанию рисунка переднеспинки имаго колорадского жука 60
3.2. Влияние Bt-картофеля и химических инсектицидов на структуру различных популяций колорадского жука 66
3.3. Прогноз формирования резистентности колорадского жука к Bt-картофелю по фенам рисунка переднеспинки имаго 74
3.4. Влияние Bt-картофеля на выживаемость личинок колорадского жука, отродившихся из яиц различной окраски 80
3.5. Молекулярно-генетический полиморфизм популяций колорадского жука по признакам пола и окраски яиц 86
3.6. Изменчивость генетической структуры популяции КЖ в зависимости от их географической удаленности 92
Выводы 101
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
Приложение 121
- Генетически модифицированный картофель устойчивый к колорадскому жуку
- Систематическое положение и морфологические признаки
- Влияние Bt-картофеля и химических инсектицидов на структуру различных популяций колорадского жука
- Влияние Bt-картофеля на выживаемость личинок колорадского жука, отродившихся из яиц различной окраски
Введение к работе
Картофель (Solanum tuberosum L) - одна из наиболее важных продовольственных культур в России, где ее называют «вторым хлебом». Однако, только из-за вредителей, среди которых наиболее опасным является
* колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) ежегодно теряется до 30 %
урожая даже при использовании химических средств защиты растений [1].
Ситуация осложняется тем, что колорадский жук (КЖ) приобрел
резистентность ко многим химическим инсектицидам, что увеличивает их
расход на полях и приводит к загрязнению окружающей среды и продуктов
урожая. Это диктует необходимость поиска новых средств защиты картофеля
от этого вредителя и управления развитием резистентности.
Трансгенный (Bt) картофель, с геном СгуЗА, устойчивый к КЖ, в определенной степени, может решить эту проблему. В то же время, остается вероятность возникновения резистентности КЖ и к самому Bt-картофелю. Решение проблемы резистентности напрямую связано со знанием механизмов этого процесса не только на организменном уровне, но и на популяционном.
Изучение генетических механизмов резистентности к инсектицидам и Bt-токсинам проводилось до настоящего времени, главным образом, на имаго и личинках насекомых. В то же время, до сих пор остаются неизвестными вопросы генотипической изменчивости структуры популяций под влиянием стрессового фактора (инсектицид). Как реагирует на стресс популяция вредителя в целом, как единая структура? Какие изменения происходят в структуре различных популяций на уровне внутрипопуляционных групп? Существуют ли общие закономерности генотипической изменчивости популяций вредителей под влиянием разных классов химических соединений и Bt-токсинов?.. Эти и другие, связанные с ними вопросы требуют своего решения.
В этой связи, задача сравнительного анализа структуры популяций колорадского жука с различной устойчивостью к инсектицидам и её
5 изменчивости в условиях взаимодействия с трансгенным картофелем (растение-инсектицид) и химическими инсектицидами составляла важное направление исследований в рамках указанной проблемы.
Оценку изменчивости структуры популяций проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данные методы научного исследования широко применимы в настоящее время в мировой практике. В этом отношении популяционный подход к оценке адаптивности колорадского жука к инсектицидам и трансгенному картофелю является оригинальным и будет способствовать более глубокому пониманию механизмов формирования резистентности вредителей к пестицидам.
Кроме того, продолжаются попытки прогноза резистентности вредителей на основе простых фенетических маркеров популяций колорадского жука. Традиционно для этих целей используют рисунок переднеспинки или надкрыльев имаго особей или окраску яиц, из которых выделяют пять визуально отличимых оттенков. Частоты распределения этих простых элементарных признаков (фенов) используются для описания фенетической структуры популяции и ее изменчивости под воздействием пестицидов или других внешних факторов среды.
Многими исследователями подтверждена взаимосвязь адаптационного полиморфизма КЖ с рисунком центральной части переднеспинки имаго. Такая взаимосвязь дает возможность индикации в популяциях этого вредителя адаптивных форм по внешним признакам взрослых особей. Отмечается также адаптивный характер изменчивости некоторых фенов в связи с действием инсектицидов и фитонцидов [39; 24; 22].
В этой связи приобретает особую актуальность изучение фенетической структуры популяций КЖ и выявление фенов-маркеров адаптивности к биотическим и абиотическим стрессам. Кроме того, некоторые авторы указывают на возможность использования в фенетическом анализе популяций колорадского жука признака «окраски яиц»; среди которых можно выделить пять визуально различных оттенков [39]. В тоже время, до конца не ясно, имеет
ли этот признак адаптивный характер и насколько велика генетическая
компонента в детерминации «окраска яиц». Таким образом, оценка
адаптивности некоторых фенов колорадского жука к инсектицидам и Bt-
картофелю и является предметом настоящих исследований.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы - выявление
* закономерностей изменчивости структуры популяций колорадского жука в
условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами и
разработка прогноза развития резистентности к Bt-токсину по фенетическим
маркерам.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
разработать новый подход к описанию рисунка преднеспинки имаго колорадского жука;
изучить влияние трансгенного картофеля и химических инсектицидов на фенетическую структуру популяций колорадского жука;
- оценить изменчивость структуры географических популяций колорадского
жука по признаку «окраска яиц»;
оценить чувствительность различных географических популяций
колорадского жука к трансгенному картофелю;
исследовать молекулярно-генетический полиморфизм популяций колорадского жука по признакам пола, окраски яиц и в зависимости от их географической удаленности;
идентифицировать фены-маркеры определяющие чувствительность колорадского жука к трансгенному картофелю. Научная новизна.
- определены новые феноформы и разработан комплексный подход к
описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго КЖ, который
может быть использован при анализе изменчивости структуры популяций;
- впервые проведена сравнительная оценка исходной чувствительности пяти
популяций КЖ Краснодарского края к трансгенному картофелю;
- разработана оригинальная методика выделения ДНК из КЖ, пригодная для
реакции амплификации;
оценен генетический полиморфизм ряда популяций КЖ по ДНК- маркерам и определена генетическая обусловленность признака «окраска яиц»;
выявлены закономерности изменчивости структуры популяций КЖ под
влиянием инсектицидов и трансгенного картофеля и феноформы
специфической и неспецифической устойчивости;
- разработана математическая модель прогноза изменения чувствительности
популяций колорадского жука к трансгенному картофелю по феноформам
рисунка переднеспинки имаго.
Практическая значимость. Разработанный новый комплексный подход к описанию рисунка центральной части переднеспинки имаго КЖ, можно использовать в генетико-популяционных исследованиях КЖ; выявлены закономерности изменчивости популяций КЖ под влиянием трансгенного картофеля и химических инсектицидов; предложен новый метод мониторинга и прогноза резистентности популяций КЖ к трансгенному картофелю по фенетическим маркерам.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на 3-ей и 5-ой региональных научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (15-16 ноября 2001г. и 18-19 декабря 2003 г. Краснодар, КГАУ); на научно-практической конференции
посвященной, 100-летию со дня рождения Е.М. Степанова (8-9 октября 2002,
Краснодар, ВНИИБЗР); на международных конференциях «Генетика в XXI
веке: современное состояние и перспективы развития» (г. Москва, 6-12 июня 2004 г) и «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (г.Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г. ВНИИБЗР); на 11-ом Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» ( г.Москва, 10-14 ноября 2003 г).
8 Основные положения, выносимые на защиту:
-система оценки структуры популяций КЖ, основанная на описании феноформ
рисунка переднеспинки имаго по СР. Фасулати, является недостаточной для
описания популяций юга России.
-структура популяций КЖ подвержена значительным изменениям под
действием инсектицидов, причем характер этой изменчивости определяется как
географическим положением популяции (ее генетическими особенностями), так
и природой пестицида.
-фенооблик структуры популяций КЖ определяется, главным образом,
соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную
неспецифическую устойчивость к стрессовым факторам среды.
-мониторинг резистентности КЖ к трансгенному картофелю можно проводить
по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве
индикатора Bt -чувствительности феноформы группы V и проводить прогноз
по разработанной формуле.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 работ.
Благодарность. Автор приносит глубокую благодарность руководителю диссертационной работы к.с-х.н. В.И. Килю, доктору с.-х. наук В.И. Терехову, доктору с.-х. наук В.Е. Болахоненкову, к.б.н. В.Я. Исмаилову за помощь, оказанную в выполнении исследований и оформлении работы.
9
* ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕКУЛЬТУРЫ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ
Генетически модифицированный организм (ГМО) или генно-инженерно-модифицированный организм (ГИМО) - это организм, способный к воспроизводству и передаче наследственного генетического материала, в который методами генной инженерии встроены гены, их фрагменты или
комбинации генов из других организмов и придающие им качественно новые
признаки. Растения, подвергшиеся такой генетической трансформации
называют трансгенными или генно-инженерно-модифицированными (ГИМР).
На сегодняшний день любой организм, включая животных и бактерий, может
быть генетически модифицирован.
В 1983 г. были опубликованы первые работы по получению трансгенных
растений табака [100, 54], содержавших в качестве чужеродных генов
селективные маркеры устойчивости к антибиотикам. Однако уже через три
года были проведены первые полевые испытания сельскохозяйственных
трансгенных растений, а спустя десять лет генетическая инженерия растений
решительно заявила о себе, предложив рынку десятки экономически важных
трансгенных растений. В 1995г в США были получены первые разрешения на
коммерциализацию трансгенных сортов растений и их продуктов [3]. Первыми
коммерческими ГМ-продуктами были томаты FlavrSavr с замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgerv", а также гербицидоустойчивая соя компании "Monsanto" [30]. Сегодня с помощью трансгенной технологии получены коммерческие сорта хлопчатника, кукурузы, сои, сахарной свеклы, рапса и других культур, устойчивые к неизбирательным гербицидам глифосату и либерти, а также к вредителям - колорадскому жуку, совкам, к болезням — ризомании, раку, вилту; сорта с улучшенным качеством продукции.
У нас, в России, созданы трансгенные растения табака, картофеля, томата, клевера, люцерны. Исследуются для этих целей другие культуры в Центре «Биоинженерия» РАН и Институте молекулярной биологии, молекулярной генетики, генетики промышленных микроорганизмов, а также во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева [45].
В мире было получено и зарегистрировано уже более 120 видов трансгенных растений. Бесспорное лидерство в производстве ТГР занимает США, а основные гены, использованные при трансгенозе - это Bt-гены (Bacillus thuringiensis) или Cry-гены, обуславливающие устойчивость к ряду вредителей и гены PAT (BAR) и CP4-EPSPS, обусловливающие устойчивость к гербицидам либерти и раундап, соответственно.
По данным Международной службы по агротехнологии (ISAAA), с 1996 по 2003 гг. площади возделывания трансгенных растений увеличились с 1,7 до 67,7 млн. га [107]. Подавляющее большинство этих площадей занимают соя, кукуруза и хлопчатник, устойчивые к гербицидам, затем идут Bt-культуры и культуры со сдвоенным признаком устойчивости к гербицидам и к насекомым.
На 41,4 млн. га (61% от общей площади, занимаемой под ГИМР) в 2003 г. в мире выращивали ГМ-сою, на 15,5 млн.га (23% от общей площади, занимаемой под ГИМР) - ГМ-кукурузу и на 7,2 млн. га (11%» от общей площади, занимаемой под ГИМР) - ГМ-хлопчатник. Именно эти три культуры сегодня лидируют в списке ГИМР (по общей площади посевов).
Трансгенные сорта все активнее сегодня вытесняют сорта традиционной селекции. Так, трансгенная соя, хлопчатник, рапс и кукуруза в 2003 г. занимали 55, 21, 16 и 11 % соответственно, от площади занятых под этими культурами [107]. Промышленными посевами трансгенных культур занимались 7 млн. фермеров в 18 странах мира, среди которых наибольшие площади под ГМ-культуры были заняты в США, Аргентине, Канаде и Китае.
В 2003 году мировой рынок ГМ-культур оценивался в 4,50-4,75 млрд. долларов США (4,0 млрд. в 2002, что составляло 15 % от 31 млрд. всего рынка
средств защиты растений и 13 % от 30 млрд.мирового рынка коммерческих семян). Делается прогноз, что рынок ГМ-культур к 2005 г возрастет до 5 млрд. долларов США [107].
Таким образом, объективность и трезвость подхода к решению этой проблемы актуально.
1.2. ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КАРТОФЕЛЬ УСТОЙЧИВЫЙ
К КОЛОРАДСКОМУ ЖУКУ
Картофель, Solarium tuberosum L. ssp. tuberorum, сегодня выращивается для коммерческих целей более, чем в 150 странах. По значимости в нашей стране картофель выходит на первое место, опередив даже пшеницу (в мире -четвертое место, после пшеницы, риса и кукурузы). Всемирная организация продовольствия FAO приводит данные по сбору картофеля в России в размере свыше 31,0 млн. т., что составляет 10,5 % от мирового урожая. В среднем Россия потребляет 122-125 кг на душу населения [44].
Основными производителями картофеля за последнее десятилетие являются фермеры и небольшие хозяйства, а также садоводы и дачники, которым хорошо известно, что среди вредителей на одном из первых мест по вредности стоит колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say). Появившись в России в 50-60 годы, колорадский жук фактически поставил под угрозу выращивание этой важной сельскохозяйственной культуры в нашей стране. Жуки и личинки повреждают листья картофеля, а при массовом заражении уничтожают все листья, черешки и даже стебли. Потери урожая в отдельных регионах могут достигать 80 % (на необработанных площадях). Однако, даже используя средства защиты, потери от колорадского жука в некоторых регионах России достигают 30 % урожая. Важно заметить, что в России под картофелем занято около 4 млн. га, следовательно, ущерб, наносимый колорадским жуком, достигает сотен миллионов рублей [1].
12 Для борьбы с колорадским жуком используют комплекс мероприятий, включающих агротехнические, карантинные, механические, химические и биологические методы защиты растений.
Агротехнические методы направлены на создание лучших условий для развития растений, повышения их устойчивости к воздействию вредных организмов. К таким приемам относятся обработка почвы, подготовка посадочного материала, применение удобрений, сроки и способы посадки, уборки и др.
Карантинные мероприятия - это система государственных мероприятий, направленных на предупреждение завоза и распространения наиболее опасных болезней, вредителей и сорняков. В условиях непрерывного возрастающего обмена материальными и культурными ценностями между государствами карантинные мероприятия приобретают все большее значение.
Механические методы заключаются в уничтожении насекомых с помощью разных приспособлений.
Химическая защита растений основана на использовании различных органических и неорганических соединений, токсичных для вредных организмов. Химические средства защиты отличаются большой универсальностью, их можно применять против большинства вредителей, болезней и сорных растений на всех сельскохозяйственных культурах и разных угодьях, а также обрабатывать ими склады, теплицы и другие сооружения. Однако наряду с достоинствами следует отметить и их недостатки, прежде всего их токсичность для теплокровных животных и человека. В основном химические препараты не безопасны. Так, ряд традиционных химических пестицидов считается канцерогенным для человека [101]. Другие вызывают проблемы для здоровья человека, например болезнь Паркенсона [80]. Кроме того, химические средства защиты загрязняют окружающею среду и приводят к подавлению не только численности вредных насекомых, но и полезных (опылителей растений, энтомофагов, медоносов и др.). А если учесть, что плодовитость жука во много раз выше плодовитости его энтомофагов, то
13 восстановление его численности происходит во столько же раз быстрее, чем у его энтомофагов.
Наконец, наиболее существенным отрицательным фактором химических инсектицидов является то, что их широкое применение ведет к формированию популяции жуков, резистентных к этим инсектицидам. Это требует увеличения доз и кратности обработок, что в свою очередь ещё в большей степени приводит к загрязнению воды, кормов и продуктов. Увеличение дозы химических препаратов, в свою очередь, приводит к быстрому процессу возникновения резистентности жука. Например, на Ставрополь только в течение 1996 г. 8-9 кратные обработки против колорадского жука обусловили увеличение его уровня резистентности к пиретроидам в 1,6-2,5 раза [19].
Вот почему внимание исследователей в последнее время обращено в основном на биологические средства защиты, позволяющие снизить пестицидную нагрузку на полях картофеля. В основе биометода лежит поиск естественных врагов - энтомофагов колорадского жука, их искусственное разведение и выпуск на поля. Кроме того, одним из важнейших направлений биологической защиты картофеля от жука является использование энтомопатогенных микроогранизмов и биопрепаратов на их основе (битоксибацилин, Колорадо, бикол, турингин и др.). Основным действующим веществом этих препаратов является экзо- и эндотаксины бактерии Bacillus turingiensis. Созданы также препараты на основе энтомопатогенных грибов и нематод [28].
В то же время биологический метод защиты требует комплексных мер и строгого соблюдения правил обработки. Необходимо проведение фитосанитарного контроля картофельного поля. Важен также упреждающий выпуск массово разводимых энтомофагов и учёт погодных условий. Это одна из причин, препятствующих широкому внедрению этого метода защиты в хозяйствах.
По сути, любому средству защиты растений в той или иной степени присущи три серьезные ограничения: во-первых, недостаточная
14 избирательность; во-вторых, загрязнения компонентов агроценоза; в-третьих, выработка у вредного организма свойства наследуемой адаптации (резистентности) к применяемому пестицидному препарату.
Вот почему особые надежды возлагаются на создание селекционным путем сорта картофеля устойчивого к колорадскому жуку. Этот путь борьбы с вредителем, за счёт самого растения, лишен вышеупомянутых недостатков (за исключением выработки резистентности у вредителя) и является наиболее привлекательным для исследователей. Определенных успехов в этом направлении добились селекционеры, использующие традиционный подход.
Традиционная селекция картофеля на устойчивость к колорадскому жуку базируется на использовании природных источников устойчивости, найденных среди многочисленных диких видов Solarium. Основным фактором, определяющим устойчивость диких видов к колорадскому жуку, является химический состав их листьев, содержащих различные гликоалколойды. Они ядовиты для личинок и снижают плодовитость взрослых насекомых.
Гибридизация культурного картофеля с дикорастущим привела к получению относительно устойчивых форм. Однако высокая концентрация вторичных метаболитов в клубнях таких гибридов делало их малопригодными для использования в пищу. В то же время на этом пути были достигнуты определенные успехи [5, 48]. Созданы несколько сортов отечественной селекции с относительной устойчивостью и сохранением питательных качеств картофеля: Столовый 19, Искра, Зарево и др., однако доля их в посевных площадях занятых картофелем не превышает 9-13% [5].
Недостатком сортов картофеля, созданных на основе природных источников, является их относительная устойчивость к колорадскому жуку. Для реализации потенциальных возможностей они также нуждаются в обработках против вредителей, хотя и в меньших количествах.
Всё выше указанное говорит о необходимости качественно новых подходов в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку. Таковые были найдены, благодаря достижениям генно-инженерных технологий. В
15 отличие от обычной селекции, эмпирической, делающей ставку на счастливое и в значительной степени случайное сочетание признаков родительских форм в потомстве, молекулярная селекция позволяет вводить конкретный ген в растение конкретного генотипа, что значительно повышает качество и эффективность селекционной работы. Созданные таким образом трансгенные растения защищают себя сами, точно дозируя необходимое количество защитного агента. При этом достигается практически 100 % защита растений от целевого вредителя и максимально упрощается процесс производства картофеля [21].
Картофель, наряду с другими представителями семейства паслёновых Nicotiana tabacum ,был одним из первых растений, подвергшийся генетической трансформации [125]. В 1993 году были созданы первые трансгенные растения картофеля, обладающие необычайно высокой устойчивостью к колорадскому жуку [129]. Полученная фирмой «Монсанто» (США) линия картофеля New Leaf (сорта Russet Burbank, Atlantic, Superior) уже несколько лет выращивается на полях Северной Америки, и площади под этими сортами возрастают с каждым годом.
Механизм устойчивости трансгенных растений к вредителям обусловлен встраиванием в их геном генов бактерии Bacillus thuringiensis, кодирующих инсектицидные белки (или дельта-эндотоксины), образующиеся во время споруляции [57, 102].
От своей способности образовывать кристалы эти белки получили название Cry -белки (от англ. Crystl). Наряду с Cry- генами в геном растений переносятся еще несколько генов. Среди них, как правило, присутствует маркерный ген, необходимый для отбора трансформантов на этапе создания сорта: ген неомицинфосфотрансферазы (npt II, обеспечивает селекцию трансгенных растений в присутствии антибиотика канамицина).
Модифицированные таким образом растения получили название Bt-защищенные растения. Они обеспечивают безопасную и высоко эффективную технологию борьбы с насекомыми-вредителями, являясь, по сути, растениями-
инсектицидами. Cry-белки, вырабатываемые Bt-растениями, обладают селективным действием против узкой группы насекомых, причем разные классы белков эффективны для применения против разных видов насекомых-вредителей.
В мире известны тысячи штаммов бактерии В. turinginesis (Bt) с разнообразными генами и широким потенциалом биологически активных белков, из которых на сегодня описано более 100 Сгу-белков [66, 67]. Bt-защищенные растения экспрессируют, как правило, один или реже, несколько Cry-белков для защиты от чешуекрылых и жесткокрылых вредителей.
Bt-защищенные кукуруза, хлопчатник и картофель были внедрены в сельскохозяйственную практику в США в 1995-97 гг., тогда как первые Bt-растения были созданы в конце 80-х гг. [160, 130, 79]. И до сегодняшнего дня США являются мировым лидером по выращиванию трансгенных культур. На 2000 год общая площадь под трансгенными культурами в мире составила 44,2 млн. га (из них 30,3 млн. га в США). На долю ГМ-культур устойчивых к насекомым, приходилось 11,5 млн. га или 26 % всех площадей, занятых под ГМ-культурами [107].
В настоящее время эти культуры выращиваются, кроме США, в Канаде, Испании, Мексике, Аргентине, Австралии, Китае, Франции, Португалии, Румынии, Болгарии, Уругвае, Украине и Южной Африке [107]. Среди трансгенных культур ГМ-картофель занимает пятое место в мире по площади выращивания (менее 1 %). Его опережают соя, кукуруза, хлопчатник и рапс -соответственно 58, 23, 12 и 7 % от всей площади, занимаемой ГМ-культурами [107].
Картофель New Leaf полностью защищен от колорадского жука и не нуждается в дополнительной обработке инсектицидами. Трансгенные линии картофеля экпрессируют белок Cry ЗА, токсичный исключительно для колорадского жука. Полевые исследования показали, что при концентрации белка Cry ЗА 0,002% в растении картофеля происходит почти 100% гибель молодых личинок колорадского жука. При концентрации 0,005 % повреждение
17 растений взрослыми жуками было незначительно. Различные линии картофеля New Leaf содержат белка Cry ЗА в 24-125 раз выше той концентрации, которая полностью защищает картофель от личиночных форм колорадского жука, и в 9,6-50 раз от жуков во взрослой стадии [129].
Также подробно изучалось влияние трансгенных сортов картофеля на биоэкологические особенности колорадского жука, его вредоносность и химическую коммуникацию с энтомофагами [17].
В течение 4 лет промышленного выращивания Bt-сортов картофеля в Северной Америке случаев повреждения растений колорадским жуком отмечено не было [4]. Несмотря на это, популяции вредителей, подвергаемые постоянному воздействию со стороны Bt-защищенных растений, потенциально способны развить устойчивость к Cry-белкам. В этой связи в США компании производители в сотрудничестве с контролирующими организациями ввели жесткие планы сельскохозяйственного менеджмента для обеспечения долгосрочной эффективности Bt-растений. Ключевым элементом этих планов является требования к производителю сельскохозяйственной продукции культивировать на определенной части площади поля сорта традиционной селекции, которые служили бы «убежищем» для Bt-чувствительных вредителей. Смысл этого в том, что появляющиеся устойчивые особи скрещиваются с чувствительными. Их потомство не будет обладать необходимой генной комбинацией для полной адаптации, и, таким образом, процесс становления устойчивой популяции вредителей многократно замедляется [88].
Механизм действия Cry- белков на насекомых - вредителей известен. Cry-белки присоединяются к специфическим участкам клеток пищеварительной системы насекомых и образуют ион-селективные каналы в клеточных мембранах. В связи с чрезмерным поступлением воды, клетки разбухают, что приводит к их лизису и последующей гибели насекомого [111].
Широкомасштабные испытания Bt-защищенных культур и, в частности, трансгенного картофеля, установили, что получаемая таким образом продукция
18 безопасна для человека и окружающей среды. Пожалуй еще ни один из биологических объектов не испытывался столь тщательно на безопасность, как ГМ-организмы.
В1994-1998 гг. белок Cry ЗА, используемый в картофеле New Leaf, несколько раз предоставлялся для экспертизы в Департамент Сельского хозяйства США (USDA) и ЕРА. USDA было издано заключение о том, что «не обнаружено значительного воздействия на окружающую среду» со стороны растений картофеля, экспрессирующих белок Cry ЗА [26].
Кроме того, Агентство по Охране Окружающей Среды (ЕРА) даже предоставило для белка Cry ЗА освобождение от требований по допустимым дозам [71]. Данные, представленные компанией Монсанто на рассмотрение ЕРА и USDA, свидетельствуют, что белок Сгу-ЗА является нетоксичным для остальных организмов, включая пчел (личинок и взрослых особей), божьих коровок, златоглазок, паразитических ос, различных коллембол, земляных червей, мышей и виргинских куропаток.
Влияние трансгенных сортов картофеля на не целевые организмы исследовалось и в нашей стране [17, 29]. Объектом исследования служили: божья коровка, проволочник, нематоды и энтомофаг колорадского жука, питавшегося трансгенным картофелем - хищный клоп подизус. Отрицательного воздействия на эти объекты не установлено.
В целом все Cry-белки, экспрессируемые Bt-растениями, оказывают минимальное или нулевое значение на биоту (птиц, рыб, водных беспозвоночных, полезных насекомых).
Cry-белки характеризуются как практически нетоксичные для организмов, не принадлежащих к целевой группе. Отсутствие активности Сгу-белков по отношению к организмам не целевой группы неудивительно, принимая во внимание высокую избирательность этих соединений. Даже божья коровка (полезное хищное насекомое, родственное колорадскому жуку) не подвержена воздействию белка Cry ЗА, который высокоэффективен при использовании против колорадского жука [68].
Говоря о воздействии выращивания трансгенного картофеля на экологию, необходимо отметить положительное влияние сортов НьюЛив на биоразнообразие и окружающую биоту [17]. Это и понятно, т. к. наблюдаемое увеличение численности полезных насекомых и видового состава энтомофауны картофельного агроценоза объясняется снижением использования химических инсектицидов широкого спектра действия.
Неблагоприятное воздействие на почвенные биологические процессы также снижено на полях с Bt-картофелем, поскольку его выращивание не требует применения химических препаратов, негативно влияющих на колленбол и другие виды почвенных беспозвоночных. Кроме того, в США имелись эпизодические сообщения об увеличении численности некоторых позвоночных, особенно птиц, что, также связывается с сокращением использования инсектицидов на таких полях [4].
Проверялась также возможность так называемого дрейфа генов -переноса внедренной генетической конструкции из трансгенных растений в микроорганизмы ризосферы и филлосферы картофеля [29]. Исследуя разные виды фитопатогенных и эпифитных бактерий и грибов, выделенных из почвы, клубней и листьев, испытуемых трансгенных сортов картофеля (Рассет Бербанк НьюЛив и Супериор НьюЛив) установлено, что несанкционированного переноса генов (утечки генов) от картофеля этим организмам не происходит.
Что касается дрейфа генов в дикорастущие виды картофеля, то необходимо отметить, что эти вопросы также тщательно изучались, прежде чем было решено приступить к широкомасштабному внедрению Bt-защищенного картофеля. В этой связи необходимо заметить, что наиболее распространенный промышленный сорт - Russet Burbank- это сорт с мужской стерильностью, что препятствует дрейфу генов, поэтому не представляет опасности в этом отношении [4].
Что касается потенциального риска возделывания трансгенных растений для окружающей среды и человека, то в отчете Национальной Академии Наук США за 2000 г. [158] сообщалось, что как традиционные, так и трансгенные
20 растения, устойчивые к вредителям сельскохозяйственных культур могут оказывать отрицательное воздействие на не являющиеся объектом борьбы организмы. Однако, предполагается, что данное потенциальное влияние на нецелевые организмы будет менее вредоносным, чем воздействие синтетических инсектицидов широкого сектора действия, и поэтому применение трансгенных растений с признаками устойчивости к вредным организмам может способствовать сохранению более широкого биоразнообразия в агроэкосистемах, позволив отказаться от использования этих инсектицидов.
Преодоление резистентности вредных организмов к пестицидам является одной из важнейших задач современного мирового сельскохозяйственного производства.
Резистентность - это способность организма выжить в условиях селективного давления при экспозиции с такими дозами инсектицида, которые являются летальными для чувствительных особей. Развитие резистентности популяции происходит в процессе отбора через накопление устойчивых генотипов и определяется целым рядом факторов: генетическими особенностями насекомых (частота встречаемости в популяции и число генов резистентности, уровень доминирования), их поведением (способность перемещаться, один или несколько растений-хозяев) и агротехническими приемами (природа пестицида, число обработок и др.) [148].
В нашей стране еще в конце 80-х годов резистентность к препаратам разных химических классов уже была выявлена в популяциях 40 видов вредных членистоногих [35]. На сегодняшний день известно, что свыше 500 видов насекомых развили резистентность как минимум к одному инсектициду [85].
Колорадский жук, основной вредитель картофельного поля, развил устойчивость к почти всем синтетическим инсектицидам, включая фосфорорганические соединения (ФОС) и пиретроиды [104]. Введение в сельскохозяйственную практику Bt-препаратов, казалось, разрешит эту проблему. Дельта эндотоксины почвенной бактерии Bacillus thuringiensis (Bt)
21 явились новым, эффективным инструментом сдерживания численности вредителя. Подсчитано, что белковый Bt-токсин является в 80 тыс. раз более мощным орудием в борьбе с вредителями, чем ФОС и в 300 раз - чем пиретроиды [75]. В противоположность многим традиционным инсектицидам, Bt-препараты имеют узкий спектр действия и являются наиболее безопасными для окружающей среды и человека.
Bt-препараты являются наиболее широко используемыми микробными инсектицидами [151]. В то же время, подобно синтетическим инсектицидам, токсины В. thuringiensis также способны индуцировать резистентность у насекомых. История возникновения резистентности к Bt-токсинам была подробна рассмотрена в работе Коломбет [20]. Однако, вопросы мониторинга и управления развитием резистентности к Bt-защищенным растениям требуют дальнейшего рассмотрения. Среди ряда случаев возникновения резистентности к Bt-препаратам, зафиксированных в специальных лабораторных опытах, направленных на создание таких Bt-резистентных линий вредителей, оказался и колорадский жук. Выведенная в результате лабораторной селекции популяция КЖ обладала почти 300 - кратной резистентностью к Bt по сравнению с контрольной [132, 163].
Способность вредителей развить высокие уровни устойчивости к Bt-препаратам в лабораторных условиях показывала, что насекомые обладают достаточным генетическим потенциалом, для развития резистентности и к Bt-защищенным растениям в условиях поля. И хотя отселектированные в лабораторных условиях резистентные к Bt- микробным препаратам, или препаратам чистого Bt-токсина, линии насекомых не проявляли устойчивость к Bt- растениям [135, 145], потенциально такая возможность существует. В целом селекция на резистентность к Bt в лабораторных условиях послужила, главным образом, для изучения генетики и биохимии резистентности и механизмов ее становления. Это, в свою очередь, способствовало выработке различных стратегий управления и контроля за развитием резистентности насекомых (антирезистентная стратегия, АС).
Первые случаи возникновения резистентности к Bt-препаратам в естественных условиях были отмечены в отношении популяций капустной моли {Plutella xylostella) на Филиппинах [ПО] и Гавайях [152]. Позже аналогичные случаи возникновения резистентности к Bt-препаратам у полевых популяций капустной моли были зафиксированы в других регионах Азии (Китай, Япония, Малайзия, Таиланд), Центральной Америки (Коста Рика, Гватемала, Гондурас, Никарагуа) и США (Флорида, Нью-Йорк) [108, 116, 128].
По мнению Агентства по охране окружающей среды США (U.S. Environmental Protection Agency, ЕРА) [134], в то время как резистентность капустной моли к ЯД-микробным препаратам сейчас является общепризнанной проблемой, нет достаточных оснований считать, что у всех целевых насекомых-вредителей, являющихся объектами применения B.t. растений, разовьется резистентность к B.t. растениям, если будет применяться АС. Биология капустной моли существенно отличается от таковой исследуемых вредителей кукурузы, хлопчатника и картофеля. Эти важные отличия, в особенности увеличенное количество поколений и, как следствие, более высокая степень подверженности действию инсектицида, т.е., более высокое селективное давление, являются причинами очевидно более высокой способности моли капустной развивать резистентность к B.t инсектицидам при опрыскивании, и многим другим инсектицидам.
Важно отметить, что по данным ЕРА [134] ни для одной B.t. культуры, используемой сегодня для коммерческих целей (кукуруза, картофель, хлопчатник) и, соответственно, ни для одного целевого вредителя, до настоящего времени не было отмечено случаев возникновения резистентности, а поступающие иногда сообщения при дальнейшей проверке не подтверждались, а были вызваны, как правило, засоренностью посева не- B.t. растениями. Отсутствие до сего дня достоверных случаев возникновения резистентности вредителей к B.t культурам, объясняется не только высоким уровнем экспрессии Я.?-токсинов в листьях и длительностью их воздействия на вредителей, но и успешной АС, разработанной в США при содействии ЕРА.
23 Тем не менее, факт широкого распространения резистентности моли капустной к В. t препаратам свидетельствует о необходимости более прицельного мониторинга и контроля резистентности. Также необходимо продолжать исследовать потенциальную возможность развития резистентности других целевых насекомых, в том числе и кй.( растениям.
В этой связи встает вопрос о выработке и в нашей стране единой стратегии и методах борьбы для предотвращения возможного развития резистентности вредителей, и в частности колорадского жука, и таким образом продления жизни Bt-сортов трансгенного картофеля, вероятно первой ГМ-культуры, которая увидит свет на российских полях. Создание таких методов управления резистентностью должно базироваться как на международном опыте по этому вопросу, так и на знании генетических и биохимических механизмов, определяющих устойчивость насекомых к Bt-токсинам [76].
Изучение механизмов резистентности к Bt-токсинам проводилось с популяциями насекомых, отселектированных на резистентность в лабораторных условиях. В то же время, необходимо отметить, что лабораторные опыты не дают точного прогноза о развитии резистентности в полевых условиях, и какой механизм резистентности будет задействован в естественных условиях, но могут указать нам совокупность механизмов в целом, которые могут быть задействованы в популяции при развитии резистентности [86]. Эти эксперименты являются основополагающими для изучения биохимии и генетики резистентности [76].
Механизмы резистентности насекомых к Bt-токсину связаны с токсическим действием самого Bt-белка. После попадания в кишечник насекомого 5 -эндотоксина процесс интоксикации может быть разделен на 4 этапа: солюбилизация, активация, связывание с рецептором мембраны кишечника и формирование поры [70, 112]. Такая многоступенчатость токсического действия Bt потенциально способствует и возникновению многих механизмов развития резистентности у насекомых [97, 122]. Сообщалось, что основным механизмом, определяющим резистентность к Bt у капустной моли,
24 Plutella xylostella(L), является уменьшение способности связывания токсина с рецептором кишечника насекомого[77, 161]. Этот же механизм развития резистентности вероятно имеет место и в отношении Heliothis virescens [115]. В то же время, у индийской моли, Plodia interpunctella Hubner, устойчивость к Bt обусловлена отсутствием ключевого фермента, ответственного за активацию Bt-токсина [108]. Присутствие основной протеазы ТІ кишечника обусловливает чувствительность особей к Bt, а отсутствие этой протеазы - их резистентность [126]. Таким образом, отсутствие протеазы ТІ наследуется в качестве рецессивного признака. В активации 5-эндотоксина также важны рН кишечника и некоторые другие факторы. Изменение физиологии кишечника может явиться другим возможным механизмом резистентности к Bt [113, 127], в том числе и у колорадского жука.
В целом для Cry ЗА белка характерен тот же механизм токсического действия, что и для других Cry-белков (специфичных в отношении Lepidoptera). Показано, что белок размером 67 KDa активируется в желудке колорадского жука с помощью протеолитического фермента, который отщепляет активный фермент размером в 42 кБа [119]. В недавнем исследовании ряда авторов [118] показано, что резистентность КЖ к Cry ЗА токсину связана со специфическим изменением протеазной активности в среднем кишечнике и одновременно, в равной степени, - с уменьшением связывания токсинов. Вследствие этих изменений, очевидно, и развивается резистентность колорадского жука к Bt-токсину.
Лабораторные опыты с селекцией по одному токсину также показали, что вредители могут приобретать резистентность широкого спектра ко многим B.t токсинам (кросс-резистентность), при этом механизмы резистентности могут быть различны. Развитие кросс-резистентности более вероятно, когда у токсинов общий сайт связывания. Тем не менее, резистентность к неродственным токсинам также возможна [153]. В то же время, невозможно ни предположить, ни предсказать, с точки зрения контроля резистентности, будет ли в природе кросс-резистентность распространяться на широкий спектр Cry
25 белков или будет узко специализированной; будут ли механизмы резистентности к В л., наблюдаемые, например, у отобранных в полевых условиях и выведенных в лаборатории популяций моли капустной, иметь место у других видов целевых вредителей ВЛ культур, таких как табачная листовертка, совка хлопковая, розовый коробочный червь, мотылек кукурузный и колорадский жук [134].
Генетические исследования показали, что резистентность к Bt в основном наследовалась аутосомно, хотя в некоторых случаях пол родителей оказывал влияние на выживаемость потомства в F1 [65, 140]. Во всех случаях модификации сайта связывания резистентность была обусловлена рецессивной или частично рецессивной мутацией в главном аутосомном гене.
Наследование резистентности к Bt-токсинам различается у разных видов насекомых. Резистентность к Bt у P. Interpunctella, P. xylostella, и Н. virescens наследуется как рецессивный или частично рецессивный признак, и обусловлена одним или несколькими генами [87, 141]. Сообщается, что резистентность у L. decemlineata наследуется по типу неполного доминирования и обусловлена одним главным геном и несколькими минорными генами взаимосвязанными с ним [132, 122 ].
В то же время, ЕРА подчеркивает, что результаты лабораторных опытов на Bt-препаратах нельзя напрямую интерпретировать по отношению к Bt-растениям. ЕРА согласно с тем, что гены резистентности наследуются аутосомно, ограничены только несколькими локусами и наследуются рецессивно, однако только тогда, когда наследование резистентности изучали на B.t. растениях [134]. Liu et al. обнаружили, что резистентность розового коробочного червя к Вл. хлопчатнику является рецессивным признаком [117]. Другие результаты (не рецессивная резистентность к Вл. токсинам) были получены при выращивании на искусственной диете отобранного в лаборатории штамма кукурузного мотылька (КМ) [103]. Huang et al. показали, что генетическое наследование резистентности КМ к Вл. препарату при опрыскивании (Dipel ES) является неполно-доминантным [103]. Однако,
26 Tabashnik и др. утверждают, что "Huang et al. не представляют доказательств того, что гусеницы из устойчивого к Dipel-ES штамма, либо гетерозиготные гусеницы из того же штамма способны дожить до зрелого состояния на B.t. кукурузе [154]. За четыре года коммерческого использования в полевых условиях не было показано, что КМ могут проявлять устойчивость к B.t. токсинам, вырабатываемым кукурузой. Очень важным фактом, касающимся наследования резистентности и имеющим значение для контроля резистентности, является то, погибают ли гетерозиготные особи на трансгенных растениях [154], и на настоящий момент все данные свидетельствуют о том, что это именно так [134].
В некоторых случаях гены резистентности к Bt - токсинам картированы [96, 98, 99], но ни один из них до сих пор не клонирован, что затрудняет проведение более детального анализа биохимических и генетических механизмов и мониторинга полевой резистентности. В двух недавно опубликованных работах сообщалось об идентификации генов резистентности к Bt: у С. elegans это ген обусловливающий потерю или уменьшение функции фермента (3-1,3 галактозилтрансферазы (резистентность к Cry 5В) [92], а у Н. virescens резистентность к Cry 1Ас белку связана с повреждением гена суперсемейства кадхерина, в локусе BtR-4 [82].
В большинстве исследованных случаев резистентность к Bt была стабильной в ряду поколений и снижалась сразу же после прекращения давления отбора, в том числе и для L.decemlineata (реверсия к исходному или более низкому уровню чувствительности) [132, 164]. Tabashnik е.а. [151] предполагают, что эти явления, прежде всего, связаны с тем, что в отсутствии Bt токсина, некоторые показатели адаптивности (выживаемость, плодовитость, успешное спаривание и др.) у резистентных особей ниже, чем у чувствительных. Реверсия резистентности к Bt имеет важное значение в выработке стратегий управления резистентностью, основанных на периодической смене используемых пестицидов или культур, экспрессирующих различные Cry-белки. Явление плейотропии генов
27 резистентности отмечалось также для колорадского жука и, в частности, снижение у резистентных особей некоторых показателей жизнеспособности [50, 157].
Изучение механизмов резистентности к Bt-токсинам способствовало выработке единой стратегии управления развитием резистентности практически для всех возделываемых сегодня Bt-трансгенных культур.
Важной частью всех стратегий управления развитием Bt-резистентности является программа мониторинга. Данные, полученные от результатов мониторинга помогут оценить эффективность стратегии управления резистентностью и будут способствовать раннему выявлению резистентных фенотипов. При благоприятных обстоятельствах это позволит осуществить первоочередные меры для сдерживания численности вредителей [78].
Резистентность к традиционным химическим и микробиологическим инсектицидам обычно контролируется и оценивается с использованием кривой «эффект-доза» смертности насекомых. Такой подход позволяет вычислить отношение резистентности СК5о испытываемой популяции к СК5о референтной, чувствительной, популяции. Это отношение принято называть фактором (уровнем ) резистентности [17, 134, 146].
Таким образом, мониторинг принято начинать с токсикологической оценки чувствительности местной популяции вредителей, а именно с определения ее СК5о, СК95 для любых инсектицидов, в том числе и для Bt-токсина. Такая оценка «базовой» чувствительности к Bt- трансгенным растениям позволила оценить СК5о для различных популяций вредителя [144, 145, 149]. Так, в частности, при оценке СК5о Н. virescens и Н. zea к 63 kDa (трипсин-активированному) Cry I А(с) белку оказалось, что чувствительность различных популяций вредителя в значительной степени варьирует в зависимости от географического положения и вида популяций вредителя [117]. Это в равной степени относится и к другим видам насекомых вредителей [120].
В методическом плане оценка СК5о чувствительной популяции сводится к скармливанию насекомым определенного количества тканей листьев
28 трансгенного растения или листьев, обработанных Bt-токсином, и оценки их смертности. При этом в опыте можно использовать не только имаго особи, но и личинки, оценивая ингибирование их роста, вес и выживаемость в течение определенного времени [145].
В то же время, необходимо учитывать, что уровень продуцирования Bt-токсина может варьировать в различных тканях одного и того же трансгенного растения, в разных трансгенных сортах, в одном и том же растении в разные периоды его жизни и в зависимости от географической зоны его выращивания. Так, например, у Bt-сортов картофеля Атлантик и Супериор серии НьюЛиф (Монсанто, США), концентрация Cry 3 А белка в листьях находится в пределах от 15,7 до 59,3 мкг/г ткани листьев, а в клубнях - от 0,09 до 0,53 мкг/г ткани клубней, что составляет от 0,10 до 0,37% общего белка листьев и 0,0004-0,003% общего протеина клубней [74]. Тем не менее, несмотря на столь значительные вариации, концентрация токсина в листьях остается достаточно высокой для полной элиминации популяции вредителя.
Кроме того, данные затруднения решаются, когда в диету насекомых
добавляют свежие (или лиофилизированные) листья Bt-растений, содержащие
известную концентрацию Cry-белка (количественная оценка
иммунологическим [ELISA] методом). Иногда для этого требуется его очистка (или частичная или полная), и уже есть коммерческие препараты таких токсинов [145].
На определенные трудности в оценке базовой чувствительности популяций указывают в своей работе Мс Gaughey и Beeman [123]. По их мнению использование диагностической дозы смертности для мониторинга резистентности в популяции индийской моли, P. interpunctella, не будет эффективным, пока резистентность не достигнет высоких показателей. Согласно Halliday и Burnham [93] идентифицировать резистентность в популяциях индийской моли с высокой степенью достоверности можно только при анализе большой выборки особей («2000) и высокой частоты генов резистентности (0.054-0.10). В тоже время, оба возражения могут быть сняты
29 при использовании более чувствительных методов оценки диагностической дозы [145].
План мониторинга резистентности, одобренный ЕРА, включал в себя также выбор места пробоотбора, разъяснительную работу с земледельцами по отбору образцов для определения резистентности, отбор экземпляров для оценки резистентности, и специальные рекомендации по уничтожению устойчивых особей, что необходимо для предотвращения выживания резистентной популяции. Планы мониторинга резистентности необходимы ЕРА, чтобы определить, является ли причиной неудачи в борьбе с вредителем в полевых условиях резистентность, или другие факторы, которые могут ингибировать экспрессию B.t. эндотоксина в растении. Компания Naturemark разработала методики определения дискриминационной дозы для КЖ и установила бесплатный телефонный номер, по которому земледельцы могут сообщать о нетипичном выживании КЖ либо другую техническую информацию. Кроме того, Naturemark разработала и распространила среди пользователей инструкции, разъясняющие размер и принципы размещения убежищ и проведения мониторинга резистентности. В рамках программы мониторинга резистентности Naturemark организовала, совместно с поставщиками семян и энтомологами программу, направленную на поиск нетипичных уровней выживания КЖ, и разработала ускоренный серологический тест для идентификации растений, содержащих протеин СгуЗА [139]. Каждый год Monsanto/Naturemark модифицирует инструкции для пользователей картофеля СгуЗА в соответствии с новыми научными данными.
Ремедиациионный план Monsanto/Naturemark содержит указание потребителям обращаться в компанию (например, используя бесплатный телефонный номер службы по работе с клиентами) в случае неожиданно высокой степени повреждений картофеля КЖ. Если окажется, что особи КЖ развили резистентность к В. t., они могут быть немедленно обработаны традиционным инсектицидом для предотвращения дальнейшего размножения и распространения. В своем докладе за 1996-97 гг. по деятельности в области
регулирования резистентности Naturemark упомянула два случая, когда земледельцы сообщили компании о личинках КЖ, выживших на растениях NewLeaf. В обоих случаях произошла ошибка при посадке, т.е., высаженные культуры оказались не растениями NewLeaf, и не экспрессировали В. t. В докладе Naturemark подтверждено, что растения не содержали ген СгуЗА [134]. Таким образом понятно, что несмотря на уже разработанные в США и Канаде стратегии управления и контроля резистентности вредителей к Bt-защищенным культурам, эта проблема требует своей дальнейшей проработки, особенно в нашей стране и возможно новых, более простых, методов мониторинга и новых схем управления развитием резистентности.
1.3. ФЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ КОЛОРАДСКОГО
ЖУКА
Фитосанитарная нестабильность агроценозов, отмечаемая в последние десятилетие, в значительной мере определяется вредителями и болезнями, способными к массовому размножению и распространению на огромных территориях. К числу фитофагов, вызывающих нередко чрезвычайные ситуации в растениеводстве, оправдано, отнесен колорадский жук. Проблема защиты отечественного картофелеводства от этого вредителя в усложненных условиях современного АПК России приобрела государственное значение.
За полтора века, прошедшие с момента первой масштабной по размерам потерь вспышки массового размножения (1859) в штате Колорадо в США, колорадский жук проделал межконтинентальную экспансию из северных районов Мексики и заселил территории с возделываемым на них картофелем и другими пасленовыми культурами, как в Северной Америке, так и в Европе[38].
31 1.3.1. Систематическое положение и морфологические признаки
Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) является представителем семейства жуков - листоедов Chrysomelidae, подсемейства настоящих листоедов Chrysomelinae, рода Leptinotarsa. Он легко отличается от других насекомых, обитающих на посадках картофеля. Жуки овальной формы, сверху сильно выпуклые, снизу плоские, блестящие, красновато - желтого цвета, на передней спинке 12-14 черных пятен, из которых средние образуют рисунок, подобный римской цифре «V», на надкрыльях по 5 черных продольных полос. Полосы могут быть длиннее или короче, а также сливаться одна с другой. Длина тела в среднем составляет 10 мм, ширина - 6-7 мм. Как правило, самки крупнее самцов, однако иногда крупнее бывают самцы. Средний вес перезимовавших самок 160 мг, самцов 144 мг, только начавших питаться молодых жуков первого поколения 123 и 107 мг соответственно.
Яйца продолговато - овальной формы, с гладкой блестящей поверхностью, от лимонно - желтого (свежеотложенные) до темно — оранжевого цвета (накануне отрождения личинок). Длина яиц 1,5-1,8 мм, ширина - 0,7-0,8 мм.
Личинки червеобразной формы, с черной головой и тремя парами грудных черных ног; сверху, особенно в средней части, выпуклые, снизу плоские; брюшко шире, чем грудь, на конце заостренно; на переднеспинке поперечное черное пятно, по бокам брюшка по два черных пятна на каждом сегменте. Они имеют четыре возраста. В 1-ом возрасте они серого или темно коричневого цвета, покрыты волосками, длина около 2 мм; во 2-м -преимущественно красного цвета, с редкими волосками, длина 3-4 мм; в 3-м -красно - желтого (кирпичного) цвета, длина 6-8 мм; в 4-м - от оранжево -желтого до красно - желтого цвета, длина 11-15 мм.
Куколки свободные, подвижные, по форме тела похожи на жуков, преимущественно оранжево - желтого цвета. Длина тела в среднем 9-10 мм, ширина 6-7 мм. [6 ].
32 1.3.2. Фены и фенетика
В 1909г. известный датский генетик В.Иоганнсен в книге «Элементы точного учения о наследственности» вместе с понятием «ген» и «генотип» ввел понятия «фен» и «фенотип». Под феном Иоганнсен понимал элементарный генетически обусловленный признак, а под фенотипом -совокупность всех внешних и внутренних структур и функций организма, которая может быть описана и изучена морфологическими и физиологическими методами. Однако вскоре выяснилось, что практически нет ни одного признака, который определялся бы действиями лишь одного гена, равно как нет ни одного гена, действие которого не касалось бы многих признаков (принцип плейотропии гена) [36].
Основным свойством фена является, таким образом, его дискретность, неделимость (при наследственной передаче) во всем изученном материале. При этом иногда такой неделимый фен может представлять собою коррелятивно тесно сцепленную группу признаков, подобно тому, как действие генов часто бывает плейотропным. Сегодня под феном понимают дискретные, альтернативные вариации какого-то признака или свойства, которые на всем имеющемся (обязательно многочисленном) материале далее неделимы без потери качества. Фены отражают генотипическую конституцию особи, а частота их встречаемости - генетические особенности группы особей.
Выделяемые фены по своей генетической природе могут быть, конечно, различными. Одни из них могут оказаться и генетически «элементарными», другие могут образовываться в результате сочетаний действия нескольких генов (сохраняя при этом дискретный характер проявления как элементарного фенотипического признака). В общей форме совершенно ясно, что практически любой признак имеет в той или иной степени наследственную обусловленность.
Было бы неверно считать каждый фен однозначно и жестко связанным с каким-то одним определенным геном: не исключением, а правилом, вероятно,
33 является то, что фен может маркировать присутствие одного из нескольких генов. Это обстоятельство, несомненно, делает фены достаточно широкими маркерами генотипа: присутствие того или иного фена должно свидетельствовать не о присутствии какого-то определенного аллеля единственного гена, а о присутствии одного из аллелей нескольких из возможных генов. С этим связана одна из особенностей фенов (и особенно морфофизиологических фенов) как признаков-маркеров генотипа: они оказываются, несомненно, менее точными маркерами, чем те признаки, которые экспериментатор может проанализировать генетически. Однако «проигрывая» в точности маркирования, фены «выигрывают» в широте охвата генотипа. Если один фен связан с одним-двумя десятками генов, то, изучив частоту сотен фенов в популяции, мы можем надеяться учесть отклонения в строении нескольких тысяч генов. Именно в такой широте охвата фенами генотипа - одно из преимуществ фенетического подхода к изучению генетической структуры популяций [47].
Возникновение фенетики как самостоятельного направления исследований связано с появлением нового методологического подхода к исследованию природных популяций. Этот подход заключается в выявлении и изучении дискретных вариаций любых признаков (морфологических, физиологических и др.), маркирующих своим присутствием генетические особенности разных групп особей внутри вида [47].
Предметом фенетики является внутривидовая изменчивость, основанная на рассмотрении фенов; методы фенетики заключаются в выделении фенов и количественном изучении такой изменчивости в популяциях и географически различных частях видовых ареалов [36].
Цель фенетики популяций - разработка проблем популяционной биологии (изучение структуры и динамики генетического состава популяций, нахождение границ между популяциями, выявление сходства популяции и т.п.), разработки методов сохранения и рациональной эксплуатации природных популяций [47].
С одной стороны, фенетика является частью генетики, а с другой -
частью общего морфофизиологического направления в зоологии и ботанике.
Применение ряда фенетических методов оказалось очень полезным в выявлении вопросов о действительных размерах популяций разных видов живых организмов, о характере популяционных границ и их динамике в
* пространстве и времени, о внутрипопуляционной структуре, степени изоляции
соседних популяций и т. п. [36].
В некоторых случаях связь фена с адаптивными свойствами организма
достаточно отчетлива. Работ такого рода можно привести много, и все они
позволяют прийти к общему заключению: во всех специально исследованных
случаях особи - обладатели разных фенов - всегда обнаруживали те или иные
адаптивные различия. Например, фен красной окраски у двухточечной божьей
коровки связан со способностью лучше переносить холод во время зимовки, а
фен черной окраски- с более интенсивным размножением летом; фен желтой
окраски у калифорнийской полевки Microtus californicus также связан с лучшей
выживаемостью при низкой температуре и более интенсивным размножением
при питании зеленым кормом (а не семенами), чем у особей типичной, серой
окраски; фен серой окраски у американских лягушек-сверчков родаЛсга связан
с устойчивостью организма к потере влаги и лучшей сопротивляемостью
некоторым инфекциям, тогда как фены красной и зеленой окраски
обеспечивают покровительственную окраску в специфических местообитаниях.
Исходя из эффекта плейотропии можно полагать, что между особями, »
несущими разные фены, должны существовать многочисленные различия в
биологически важных признаках. При этом, вероятно, некоторые фены могут иметь непосредственно адаптивное значение. В большинстве же случаев, по-видимому, фены имеют не непосредственное, а косвенное адаптивное значение, будучи тесно связанными, с генами, контролирующими важные биологические признаки и свойства.
Другим важным показателем «не безразличности» фенов является порой удивительное постоянство их частот в природных популяциях. Сравнение
35 частот некоторых фенов рисунка спины у прыткой ящерицы в сборах, произведенных в одном и том же месте, но с промежутком в 70 лет, показало их стабильность. Есть много других примеров постоянства частот фенов (в том числе окраски) на протяжении многих поколений в популяциях бесхвостых амфибий, грызунов и др.
Важно подчеркнуть, что незнание конкретного адаптивного значения данного фена не может служить препятствием для его использования в качестве маркера генетического состава природных группировок особей [47].
Оценку изменчивости фенетической структуры популяций КЖ традиционно проводят, главным образом, по окраске переднеспинки взрослых особей [107, 114]. Многими исследователями подтверждена взаимосвязь адаптационного полиморфизма КЖ с рисунком центральной части переднеспинки имаго. Такая взаимосвязь дает возможность индикации в популяциях этого вредителя адаптивных форм по внешним признакам взрослых особей. Отмечается также адаптивный характер изменчивости некоторых фенов в связи с действием инсектицидов и фитонцидов [22, 24, 39]. В этой связи приобретает особую актуальность изучение фенетической структуры популяций КЖ и выявление фенов-маркеров адаптивности к биотическим и абиотическим стрессам.
Изучение структуры популяции КЖ методами фенетики особенно интенсивно началось в нашей стране в конце 70-х-начале 80-х годов. В ряде работ были предприняты попытки создать систему описания фенов переднеспинки КЖ и выявить фены-маркеры тех или иных адаптивных особенностей вредителя, связанных с его географическим положением, устойчивостью к пестицидам и др. [25, 27, 33].
Были предложены различные системы описания рисунка переднеспинки [24, 33, 40] . Так, в частности, Соколов (1978) предложил буквенно - цифровую схему описания, по которой он выделил 32 фенокомплекса только в центральной части рисунка переднеспинки [33]. В то же время, наиболее употребительной оказалась система описания фенов и фенокомплексов,
36 предложенная Кохманюк который из 30 фенов рисунка переднеспинки колорадского жука выделил 7, служащих маркерами популяционных процессов: А, В, D, Е, V, Р, М.
В то же время, с нашей точки зрения данный подход не учитывает всего многообразия жуков в популяции и поэтому не является универсальным и достаточным.
Некоторые авторы [18] считают, что для изучения популяционных процессов колорадского жука эта система описания рисунка переднеспинки недостаточна и ее следует дополнить фенами надкрыльев. Другие, наоборот, пошли по пути упрощения данного подхода [40].
Таким образом, значительный интерес представляло изучение изменчивости фенетической структуры ряда местных популяций, под действием стрессирующих факторов внешней среды.
1.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ДЛЯ АНАЛИЗА ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПОПУЛЯЦИЙ
НАСЕКОМЫХ
Современные достижения в области молекулярной биологии и генетики находят самое широкое применение в практике селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений. Примером может служить использование технологий биохимических и молекулярных маркеров на основе ДНК. В основе последней лежит выявление полиморфизма структуры ДНК с использованием ДНК-зондов разной длины и/или расщепления молекул ДНК специфичными ферментами. Полиморфизм, как правило, выявляется в виде электрофоретического спектра фрагментов ДНК разной длины [13]. Число ДНК-маркеров во много раз превосходит потенциал изоферментов или запасных белков. Кроме того, проявление таких молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является тканеспецифичным, и их
можно обнаружить на любой стадии развития организма. Вот почему
появление ДНК-маркеров радикально изменило методы оценки генетического
разнообразия организмов, паспортизации и классификации организмов,
картирования и определения физической природы генов, интрогрессии новых
генов и генетического мониторинга в селекции и семеноводстве [42].
Использованию ДНК-маркерных технологий в растениеводстве
посвящено несколько обзоров [42, 23, 10, 14].
Методы применения ДНК в качестве генетических маркеров сводятся в основном к двум видам анализа: рестриктазных фрагментов (RFLP) и фрагментов, полученных на основе ПЦР. Последний, благодаря своей простоте, доступности, отсутствию необходимости использования радиоактивных материалов произвел за последние 10 лет настоящий переворот в области применения молекулярных маркеров в сельском хозяйстве. И хотя RFLP-анализ имеет определенные преимущества, по сравнению с ПЦР, в настоящее время его проводят только в немногих крупных лабораториях [42].
В зависимости от природы праймеров и способа идентификации продуктов амплификации различают несколько методов ПНР-анализа. Широкое применение нашли варианты амплификации ДНК с произвольными праймерами, т.е. произвольной структуры.
В 1990 г. независимо друг от друга две исследовательские группы
предложили для выявления полиморфизма ДНК использовать полимеразную
цепную реакцию (ПЦР) с одним коротким олигонуклеотидным праймером і
произвольной структуры. После электрофоретического разделения продуктов
реакции детектировали фрагменты амплификационной ДНК различной
молекулярной массы и использовали их как молекулярные маркеры для анализа
генома. Одна группа назвала такие молекулярные маркеры RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) [165], другая- AP-PCR (Arbitrary Primer PCR)
[162]. Несколько позже были предложены еще сходные технологии DAF (DNA
Amplification Fingerprinting) [58] и УП-ГЩР (ПЦР с универсальными
праймерами) [2].
Оригинальность предложенного метода заключается в двух особенностях. Первая - при амплификации ДНК применяется только один праймер, так как "мишенью" являются, как принято считать, инвертированные повторы в геноме. Вторая - для использования "произвольных" праймеров нет необходимости в предварительном клонировании и секвенировании соответствующих фрагментов генома. При подборе праймеров достаточны следующие условия: олигонуклеотидная последовательность праймера должна содержать от 50 до 80% G+C оснований, а его длина должна быть около 10 оснований в случае RAPD, около 20 оснований в случае AP-PCR и пять оснований в случае DAF анализа.
При изучении полиморфизма популяций насекомых исследователи используют традиционно фенетические методы анализа, основанные на описании морфологических особенностей особи, ее строения, окраски, и т.п. [47]. Кроме того, к фенетическим методам можно отнести также изоферментный анализ, широко применявшийся исследователями в 80-х годах при изучении полиморфизма популяций насекомых [69, 55, 131, 156, 147].
Однако, позднее, в 90-х годах, с развитием ПЦР-метода стало возможно оценить генетический полиморфизм популяций. Анализ ДНК особей с помощью ПЦР позволяет проводить скрининг генетического разнообразия, основываясь на анализе большого количества молекулярных маркеров. Преимущества такого подхода заключается в том, что данная ДНК-технология позволяет вычленить генетическую компоненту в «чистом виде», свободную от средовых эффектов и проводить комплексную оценку геномов как на межвидовом, так и на внутривидовом уровне. Кроме того, ДНК-маркеры позволяют идентифицировать генотипы насекомых на любой стадии его развития, от яйца до имаго, в отличие от изоферментных маркеров, что в некоторых случаях может играть решающую роль. Кроме того, было показано, что уровень вариабельности по RAPD-маркерам превышает таковой по полиморфным белкам [64].
В настоящее время RAPD технология широко используется в изучении генома организмов (конструирование генетических карт, анализ генетической структуры популяций, генотипирование, маркирование признаков, а также в реализации целого ряда селекционных программ )[14].
Механизм RAPD анализа заключается в том, что при низкой температуре отжига (30-3 5 С) произвольный праймер связывается с двумя комплементарными ему короткими последовательностями, расположенными на противоположных цепях геномной ДНК. Если расстояние между этими сайтами находится в пределах 50-2000 оснований, то происходит амплификация дискретного фрагмента ДНК.
В среднем каждый праймер инициирует амплификацию нескольких дискретных локусов генома. Показано, что большинство RAPD-фрагментов, изученных у растений, состоит из повторяющихся последовательностей ДНК. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей между отдельными образцами ДНК выявляются по присутствию или отсутствию конкретных полос в спектре фрагментов ДНК при электрофорезе. Отсутствие полосы может быть следствием изменений в одном или обоих сайтах связывания праймера или обусловлено делецией фрагмента ДНК, несущего эти сайты. Делеции или инсерции внутри амплифицируемого фрагмента ДНК-матрицы приводят к изменению размера продукта амплификации.
Преимущества RAPD-анализа перед другими методами использования ДНК-маркеров состоят в следующем: 1) не нужна предварительная информация о нуклеотидной последовательности тех или иных участков генома, 2) требуются незначительные количества ДНК для проведения анализа, 3) быстрота и экономичность технологической процедуры. Однако для обеспечения воспроизводимых результатов необходимо оптимизировать и строго контролировать условия проведения реакции.
Показано, что RAPD-маркеры в основном наследуются как доминантные маркеры. Высокая чувствительность RAPD-анализа позволяет в некоторых случаях определять единичные замены оснований в геномной ДНК. В
40 большинстве случаев замена в праймере только одного нуклеотида приводит к полному применению в спектре амплифицированных фрагментов ДНК. Это делает возможным использование данного метода для анализа полиморфизма популяций и идентификации отдельных генотипов. Степень выявляемого RAPD-анализом генетического полиморфизма существенно выше по сравнению с другими ПЦР-методами [10].
В то же время, при сопоставлении разных геномов в RAPD-анализе возникает проблема выбора праймера. Подбор такового происходит эмпирически и часто не позволяет обнаружить полиморфные фрагменты в RAPD-спектрах. Это указывает на необходимость предварительной работы по оценке пригодности праймера для решения конкретных задач [10].
Данные, полученные в результате анализа ДНК-полиморфизма популяций насекомых, могут быть использованы для целей систематики и паспортизации.
Так, RAPD-технология, как разновидность ПЦР, была применена к оценке генетического полиморфизма разных групп насекомых: тлей [159, 61], комаров [53, 109], нематод [62], мух [95], пчел [43], бабочек [16], жуков [83] и других [60].
Позднее RAPD-анализ был использован и для сравнительной оценки некоторых групп насекомых с целью их систематики. Данный подход позволил определить таксономическую принадлежность и выявить ДНК-маркеры у разных групп насекомых: Aleyrodidae, Tenebrionidae, Tephritidae, Thripidae и Aeolothripidae [60]. В данной работе было показано, что праймеры ОРА-02 и ОРА-07 позволяют вскрыть межвидовые различия и являются признаками для целей таксономии.
Изучение ДНК-полиморфизма пчел, с помощью RAPD-анализа позволило выявить ДНК-маркеры разных "пород" и "видов" пчел, а также идентифицировать отдельные особи [43]. Из четырех исследованных праймеров, пригодными для этих целей оказались ОРА-01 и ОРА-04. Данный подход может оказаться полезным не только для целей генетико-
41 популяционных исследований и создания пород и видоспецифичных маркеров, но и в практической селекционной работе, генетической паспортизации племенных пасек и сертификации их продукции.
RAPD-PCR использовали также применительно к чешуекрылым CQU.Papilionidae. Приводятся RAPD-спектры для Atrophaneura alcinous и четырех видов рода Parnassius (sensulato). Продемонстрирована пригодность для RAPD-анализа даже музейных экспонатов бабочек [16]. В оценке генетического полиморфизма бабочек оказались пригодными праймеры ОРЕ-04, ОРЕ-06, ОРЕ-17, ОРВ-20, ОРА-18, ОРА-10, ОРА20 и ОРС-18.
В то же время, ПЦР-анализ насекомых нашел применение не только в систематике и популяционно-генетических исследованиях. Это и установление наследования материнской и отцовской компонент в потомстве от скрещивания у жуков-могильщиков [142] и выявление маркеров, сцепленных с чувствительностью к Bt-токсинам у капустной моли [96] и ДНК-маркеров, сцепленных с геном устойчивости к пестициду (циклодеин) у дрозофилы и проведение на этой основе мониторинга резистентности в популяциях насекомых [52].
В этом отношении колорадский жук, как основной вредитель картофельного поля, также не был обделен вниманием со стороны исследователей. Так, А.П.Сидоренко и др. [31, 32] проводили оценку генетического полиморфизма в популяциях КЖ по RAPD-маркерам в трех географически удаленных друг от друга областях: Киевской, Московской и Курганской. Выявлены четыре (из 12) праймера, позволяющих оценить генетический полиморфизм КЖ. Наиболее информативным оказались праймеры П1 и П2 с общим числом RAPD-фрагментов равным 12. Оценка популяций КЖ по RAPD-маркерам может оказаться полезной для визуализации сцепленных с ними селективно важных локусов и проведения на этой основе мониторинга или скрининга популяции по интересующему нас признаку.
Таким образом, электрофоретические спектры амплифицированных в RAPD-PCR последовательностей позволяют получить полезную информацию
об уровне генетического полиморфизма популяций, даже если продукты
амплификации не подвергать далее формальному генетическому анализу,
рестрикционной характеристике, гибридизации со специфическими зондами
или секвенированию. Тестирование генетического разнообразия в популяциях
колорадского жука с помощью RAPD-маркеров позволяет быстро и с
* достаточной степенью объективности сравнивать их состояние, а также
проследить динамику частот отдельных генетических маркеров.
В конечном счете изучение эколого- генетического полиморфизма популяций колорадского жука в Краснодарском крае ранее не проводилось. Исследование полиморфизма популяции колорадского жука в условиях их взаимодействия с пестицидами и трансгенным картофелем на фенетическом и генетическом уровне позволит выявить маркеры резистентности популяции вредителя к этим агентам. Исследование данного вопроса на популяционном уровне представляется важным и актуальным ввиду необходимости мониторинга и управления резистентностью колорадского жука к инсектицидам.
*
Генетически модифицированный картофель устойчивый к колорадскому жуку
Картофель, Solarium tuberosum L. ssp. tuberorum, сегодня выращивается для коммерческих целей более, чем в 150 странах. По значимости в нашей стране картофель выходит на первое место, опередив даже пшеницу (в мире -четвертое место, после пшеницы, риса и кукурузы). Всемирная организация продовольствия FAO приводит данные по сбору картофеля в России в размере свыше 31,0 млн. т., что составляет 10,5 % от мирового урожая. В среднем Россия потребляет 122-125 кг на душу населения [44].
Основными производителями картофеля за последнее десятилетие являются фермеры и небольшие хозяйства, а также садоводы и дачники, которым хорошо известно, что среди вредителей на одном из первых мест по вредности стоит колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say). Появившись в России в 50-60 годы, колорадский жук фактически поставил под угрозу выращивание этой важной сельскохозяйственной культуры в нашей стране. Жуки и личинки повреждают листья картофеля, а при массовом заражении уничтожают все листья, черешки и даже стебли. Потери урожая в отдельных регионах могут достигать 80 % (на необработанных площадях). Однако, даже используя средства защиты, потери от колорадского жука в некоторых регионах России достигают 30 % урожая. Важно заметить, что в России под картофелем занято около 4 млн. га, следовательно, ущерб, наносимый колорадским жуком, достигает сотен миллионов рублей [1].
Для борьбы с колорадским жуком используют комплекс мероприятий, включающих агротехнические, карантинные, механические, химические и биологические методы защиты растений.
Агротехнические методы направлены на создание лучших условий для развития растений, повышения их устойчивости к воздействию вредных организмов. К таким приемам относятся обработка почвы, подготовка посадочного материала, применение удобрений, сроки и способы посадки, уборки и др. Карантинные мероприятия - это система государственных мероприятий, направленных на предупреждение завоза и распространения наиболее опасных болезней, вредителей и сорняков. В условиях непрерывного возрастающего обмена материальными и культурными ценностями между государствами карантинные мероприятия приобретают все большее значение.
Механические методы заключаются в уничтожении насекомых с помощью разных приспособлений. Химическая защита растений основана на использовании различных органических и неорганических соединений, токсичных для вредных организмов. Химические средства защиты отличаются большой универсальностью, их можно применять против большинства вредителей, болезней и сорных растений на всех сельскохозяйственных культурах и разных угодьях, а также обрабатывать ими склады, теплицы и другие сооружения. Однако наряду с достоинствами следует отметить и их недостатки, прежде всего их токсичность для теплокровных животных и человека. В основном химические препараты не безопасны. Так, ряд традиционных химических пестицидов считается канцерогенным для человека [101]. Другие вызывают проблемы для здоровья человека, например болезнь Паркенсона [80]. Кроме того, химические средства защиты загрязняют окружающею среду и приводят к подавлению не только численности вредных насекомых, но и полезных (опылителей растений, энтомофагов, медоносов и др.). А если учесть, что плодовитость жука во много раз выше плодовитости его энтомофагов, то восстановление его численности происходит во столько же раз быстрее, чем у его энтомофагов.
Наконец, наиболее существенным отрицательным фактором химических инсектицидов является то, что их широкое применение ведет к формированию популяции жуков, резистентных к этим инсектицидам. Это требует увеличения доз и кратности обработок, что в свою очередь ещё в большей степени приводит к загрязнению воды, кормов и продуктов. Увеличение дозы химических препаратов, в свою очередь, приводит к быстрому процессу возникновения резистентности жука. Например, на Ставрополь только в течение 1996 г. 8-9 кратные обработки против колорадского жука обусловили увеличение его уровня резистентности к пиретроидам в 1,6-2,5 раза [19].
Вот почему внимание исследователей в последнее время обращено в основном на биологические средства защиты, позволяющие снизить пестицидную нагрузку на полях картофеля. В основе биометода лежит поиск естественных врагов - энтомофагов колорадского жука, их искусственное разведение и выпуск на поля. Кроме того, одним из важнейших направлений биологической защиты картофеля от жука является использование энтомопатогенных микроогранизмов и биопрепаратов на их основе (битоксибацилин, Колорадо, бикол, турингин и др.). Основным действующим веществом этих препаратов является экзо- и эндотаксины бактерии Bacillus turingiensis. Созданы также препараты на основе энтомопатогенных грибов и нематод [28]. В то же время биологический метод защиты требует комплексных мер и строгого соблюдения правил обработки. Необходимо проведение фитосанитарного контроля картофельного поля. Важен также упреждающий выпуск массово разводимых энтомофагов и учёт погодных условий. Это одна из причин, препятствующих широкому внедрению этого метода защиты в хозяйствах.
Систематическое положение и морфологические признаки
Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) является представителем семейства жуков - листоедов Chrysomelidae, подсемейства настоящих листоедов Chrysomelinae, рода Leptinotarsa. Он легко отличается от других насекомых, обитающих на посадках картофеля. Жуки овальной формы, сверху сильно выпуклые, снизу плоские, блестящие, красновато - желтого цвета, на передней спинке 12-14 черных пятен, из которых средние образуют рисунок, подобный римской цифре «V», на надкрыльях по 5 черных продольных полос. Полосы могут быть длиннее или короче, а также сливаться одна с другой. Длина тела в среднем составляет 10 мм, ширина - 6-7 мм. Как правило, самки крупнее самцов, однако иногда крупнее бывают самцы. Средний вес перезимовавших самок 160 мг, самцов 144 мг, только начавших питаться молодых жуков первого поколения 123 и 107 мг соответственно.
Яйца продолговато - овальной формы, с гладкой блестящей поверхностью, от лимонно - желтого (свежеотложенные) до темно — оранжевого цвета (накануне отрождения личинок). Длина яиц 1,5-1,8 мм, ширина - 0,7-0,8 мм.
Личинки червеобразной формы, с черной головой и тремя парами грудных черных ног; сверху, особенно в средней части, выпуклые, снизу плоские; брюшко шире, чем грудь, на конце заостренно; на переднеспинке поперечное черное пятно, по бокам брюшка по два черных пятна на каждом сегменте. Они имеют четыре возраста. В 1-ом возрасте они серого или темно коричневого цвета, покрыты волосками, длина около 2 мм; во 2-м -преимущественно красного цвета, с редкими волосками, длина 3-4 мм; в 3-м -красно - желтого (кирпичного) цвета, длина 6-8 мм; в 4-м - от оранжево -желтого до красно - желтого цвета, длина 11-15 мм.
Куколки свободные, подвижные, по форме тела похожи на жуков, преимущественно оранжево - желтого цвета. Длина тела в среднем 9-10 мм, ширина 6-7 мм. [6 ].
В 1909г. известный датский генетик В.Иоганнсен в книге «Элементы точного учения о наследственности» вместе с понятием «ген» и «генотип» ввел понятия «фен» и «фенотип». Под феном Иоганнсен понимал элементарный генетически обусловленный признак, а под фенотипом -совокупность всех внешних и внутренних структур и функций организма, которая может быть описана и изучена морфологическими и физиологическими методами. Однако вскоре выяснилось, что практически нет ни одного признака, который определялся бы действиями лишь одного гена, равно как нет ни одного гена, действие которого не касалось бы многих признаков (принцип плейотропии гена) [36].
Основным свойством фена является, таким образом, его дискретность, неделимость (при наследственной передаче) во всем изученном материале. При этом иногда такой неделимый фен может представлять собою коррелятивно тесно сцепленную группу признаков, подобно тому, как действие генов часто бывает плейотропным. Сегодня под феном понимают дискретные, альтернативные вариации какого-то признака или свойства, которые на всем имеющемся (обязательно многочисленном) материале далее неделимы без потери качества. Фены отражают генотипическую конституцию особи, а частота их встречаемости - генетические особенности группы особей.
Выделяемые фены по своей генетической природе могут быть, конечно, различными. Одни из них могут оказаться и генетически «элементарными», другие могут образовываться в результате сочетаний действия нескольких генов (сохраняя при этом дискретный характер проявления как элементарного фенотипического признака). В общей форме совершенно ясно, что практически любой признак имеет в той или иной степени наследственную обусловленность.
Было бы неверно считать каждый фен однозначно и жестко связанным с каким-то одним определенным геном: не исключением, а правилом, вероятно, является то, что фен может маркировать присутствие одного из нескольких генов. Это обстоятельство, несомненно, делает фены достаточно широкими маркерами генотипа: присутствие того или иного фена должно свидетельствовать не о присутствии какого-то определенного аллеля единственного гена, а о присутствии одного из аллелей нескольких из возможных генов. С этим связана одна из особенностей фенов (и особенно морфофизиологических фенов) как признаков-маркеров генотипа: они оказываются, несомненно, менее точными маркерами, чем те признаки, которые экспериментатор может проанализировать генетически. Однако «проигрывая» в точности маркирования, фены «выигрывают» в широте охвата генотипа. Если один фен связан с одним-двумя десятками генов, то, изучив частоту сотен фенов в популяции, мы можем надеяться учесть отклонения в строении нескольких тысяч генов. Именно в такой широте охвата фенами генотипа - одно из преимуществ фенетического подхода к изучению генетической структуры популяций [47].
Возникновение фенетики как самостоятельного направления исследований связано с появлением нового методологического подхода к исследованию природных популяций. Этот подход заключается в выявлении и изучении дискретных вариаций любых признаков (морфологических, физиологических и др.), маркирующих своим присутствием генетические особенности разных групп особей внутри вида [47]. Предметом фенетики является внутривидовая изменчивость, основанная на рассмотрении фенов; методы фенетики заключаются в выделении фенов и количественном изучении такой изменчивости в популяциях и географически различных частях видовых ареалов [36]. Цель фенетики популяций - разработка проблем популяционной биологии (изучение структуры и динамики генетического состава популяций, нахождение границ между популяциями, выявление сходства популяции и т.п.), разработки методов сохранения и рациональной эксплуатации природных популяций [47]. С одной стороны, фенетика является частью генетики, а с другой частью общего морфофизиологического направления в зоологии и ботанике. Применение ряда фенетических методов оказалось очень полезным в выявлении вопросов о действительных размерах популяций разных видов живых организмов, о характере популяционных границ и их динамике в пространстве и времени, о внутрипопуляционной структуре, степени изоляции соседних популяций и т. п. [36].
Влияние Bt-картофеля и химических инсектицидов на структуру различных популяций колорадского жука
Известно, что структура популяций колорадского жука подвержена значительным изменениям под действием стрессов, в то же время оставаясь достаточно стабильной на протяжении многих лет, в данном географическом регионе [47]. При этом оценка полиморфизма колорадского жука (КЖ) по рисунку переднеспинки показывает, что при действии различных стрессирующих агентов на популяцию преимущество получают различные фенетические группы особей, что, вероятно, указывает на адаптивность фенов и возможность их использования при мониторинге резистентности популяций насекомых [22, 24, 39]. Предложенный нами выше новый подход к описанию фенооблика популяций колорадского жука (КЖ) позволил оценить изменчивость структуры некоторых популяций под влиянием инсектицидов и трансгенного Bt-картофеля [7]. Описание фенооблика популяций КЖ в условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами приведено в табл. 7. Из таблицы 7 при сравнении фенооблика трёх исследованных популяций (контроль) можно заметить, что все они характеризовались примерно одинаковым спектром распределения частот фенов. И хотя наблюдались некоторые различия в фенетической структуре и между популяциями Краснодарского края, но они оказались статистически незначимыми (% фак.=9,73; 6,5; 4,56, что менее % табл)- Так, в частности, при сравнении популяций между собой Староминская популяция отличалась более высокой частотой фена HP, Темрюкская - фенов 6, 7 и 9, а Краснодарская - фенов 1, 2 и HY. Более наглядно фенооблик исследованных популяций представлен на рис.3 В целом по популяциям наиболее часто встречаемыми оказались фены HP, 6, 9 и 3 (средняя частота по популяциям 25,1; 14,3; 13,6 и 12,8 соответственно), а наиболее редкие фены 2, 4, 5, 7, 8, V, Y, VP, VH, VHP (частота менее 4 %). В целом это среднемноголетнее распределение и его можно принять за норму для популяций Краснодарского края.
Из таблицы 7 также можно заметить, что влияние Bt-токсина на структуру популяций фактически сохраняло доминирующее положение часто встречаемых фенов HP, 3, 6 и 9 (х факт Х 05), то есть фенооблик популяций сохранился таким же, как и в контроле. В то же время, действие лептоцида в Краснодарской популяции и действие дурсбана в Темрюкской популяции значительно влияло на структуру популяций (х =26,2; 27,2 % 05), однако и в этом случае указанные фены оставались наиболее часто встречаемыми. Влияние Bt токсина на Темрюкскую популяцию приводило к значительному уменьшению одних из часто встречаемых фенов № 6 и 9 и увеличивало частоты встречаемости редких фенов 8, V. Подобно и при оценке фенооблика Староминской популяции, можно заметить, что Bt токсин приводил к резкому уменьшению частоты встречаемости фенов № 3; 6; 9 и HP (одних из наиболее часто встречаемых) и как в случае с Темрюкской популяцией - к увеличению редких фенов - № 5; 7; 8 и VP. Как и следовало ожидать, влияние инсектицидов (лептоцид, дурсбан) (таблица 7) изменяло структуру популяции, причём изменчивость определялась как генотипическими особенностями популяций, так и природой инсектицида. Можно заметить, например, что в среднем по популяциям влияние Bt-токсина и лептоцида приводит к некоторому увеличению частоты фена HP, тогда как действие дурсбана - наоборот, к её снижению, причём для всех исследованных популяций. В то же время важно отметить, что частота встречаемости фена HP остаётся одной из самых высоких или самой высокой и под влиянием пестицидов, т. е. сохраняется на уровне контроля (в исходных популяциях). Однако относительно других фенов картина резко меняется в зависимости от природы пестицида и популяции. Так, например, влияние Bt-токсина в среднем по популяциям приводит к значительному увеличению частоты встречаемости редких фенов 5; 7; 8; V и VP и уменьшению - фенов 3; 6; 9. В то же время действие лептоцида приводит к увеличению частоты встречаемости фенов 4; 8; Y;VP и HY и уменьшению фенов 5; 9 и V . Действие дурсбана - наоборот, к увеличению частоты фенов 4; 5; и 9. Другими словами, отклик популяций на действие пестицидов в значительной степени определяется природой стрессового фактора. В то же время, важно отметить, что характеристика популяционной структуры на основании анализа только лишь частот распределения фенов не может позволить нам объективно понять закономерности развития их устойчивости к действию инсектицидов (лептоцид и дурсбан), как нами уже указывалось ранее.
Вот почему, наряду с частотой встречаемости, мы оценивали также выживаемость особей различных фенов в условиях действия стрессового фактора (пестицид, Bt-токсин). Данные по выживаемости имаго особей КЖ разных фенов под действием инсектицидов приведены в табл. 8. Данные анализа таблицы 8 показывают, что оценка выживаемости наиболее часто встречаемых фенов выявила тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию Bt-токсина и инсектицидов. Выживаемость фенов в условиях пестицидного пресса не коррелировала с исходной частотой их встречаемости в популяциях. Так, например, редко встречаемые фены Краснодарской популяции 7; VP и Y являлись, в среднем, наиболее устойчивыми к инсектицидам, а часто встречаемые фены 3 и HP характеризовались невысокой выживаемостью в условиях стресса (в среднем 12,9; 16,4 соответственно). Это указывает на то, что фенетическая структура популяций КЖ определяется не только, а может и не столько, пестицидным фактором, но и другими стрессовыми факторами окружающей среды (засухи, суховеи, град, холод и др.). По всей видимости, чувствительность различных фенов к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука, так как редкие фены, как правило, имеют более высокую устойчивость к инсектицидам, что согласуется и с данными других авторов (в частности в отношении Bt-токсина и др.) [22].
Влияние Bt-картофеля на выживаемость личинок колорадского жука, отродившихся из яиц различной окраски
По данным Фасулати и др. [39] к числу внешних признаков, взаимосвязанных с основными экологическими адаптациями внутрипопуляционных форм колорадского жука, наряду с рисунком переднеспинки имаго особей, можно отнести также оттенки пигментации яиц, пять из которых визуально хорошо различимы (по Фасулати). Данные об изменчивости данного признака («окраска яиц») в литературе крайне отрывочны. Считается, что окраска яиц обусловлена модификациями физиологической природы. Так известно, что цвет яиц колорадского жука может быть обусловлен возрастом самки: более молодые особи откладывают более темные яйца [38]. Выявлено также, что этот признак связан с пищевыми адаптациями КЖ, с особенностями регуляции сезонного цикла и типами диапаузы. В то же время, некоторые данные указывают и на генетическую обусловленность этого признака [39]. В этой связи несомненный интерес представляет исследование взаимосвязи адаптивности жуков к пестицидам с окраской яиц, из которых они отродились.
В случае выявления таких взаимосвязей это может дать в руки исследователю простой фенотипический маркер резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю. Важно заметить, что в некоторых случаях связь фена "окраски" с адаптивными свойствами организма довольно отчётлива [47]. Таким образом, необходимо было оценить изменчивость признака "окраска яиц КЖ" в зависимости от генотипических особенностей популяций КЖ и под влиянием Bt-картофеля. При сравнении выживаемости личинок на Bt-картофеле, несколько более высокую резистентность наблюдали у личинок, отродившихся из яиц желтой окраски, что особенно отчетливо видно на примере Краснодарской популяции. В соответствии с этим имеет значение изучение изменчивости данного признака также в зависимости от меняющихся условий внешней среды. Результаты испытаний Краснодарской популяции по чувствительности к Bt-картофелю в зависимости от окраски яиц, из которых отродились личинки, приведены в табл.13. Из таблицы 13 можно заметить, что несколько большая рзистентность к Bt-картофелю отмечалась у личинок, отродившихся из яиц желтой и оранжево-желтой окраски, (наименьшая - у личинок, отродившихся из яиц оранжево-красной окраски). Этот показатель оказался в целом стабильным на протяжении двух лет испытаний. На основании этих данных можно предположить, что увеличение частоты встречаемости яйцекладок желтой окраски в Краснодарской популяции будет свидетельствовать о развитии резистентности к Bt-картофелю.
В этой связи нами были исследованы частоты встречаемости яйцекладок различной окраски в популяциях КЖ. По некоторым данным (Фасулати,2000) соотношение яйцекладок разного цвета резко отличается у жуков перезимовавшего (весеннего) и летнего поколений во всех географических популяциях. В то же время, по нашим данным, при сравнении весенних генераций в разных географических зонах Краснодарского края этот показатель оказался довольно стабильным. Результаты оценки изменчивости структуры пяти популяций Краснодарского края по признаку «соотношение яйцекладок различной окраски приведены в табл. 14. высокое содержание яйцекладок желтой окраски, и низкое - оранжевой и оранжево-красной . При этом изменчивость по этому признаку по популяциям отсутствовала (х 0,5; при попарном сравнении распределений частот). В то же время, это не исключает наличие изменчивости этого показателя под влиянием инсектицидов и трансгенного картофеля, а также возможность проведения мониторинга популяций КЖ по этому признаку. Характер взаимосвязи признаков «окраска яиц» и «чувствительность к Bt-картофелю» исследовали и для других популяций края (табл. 15). Из данных таблицы 15 можно заметить, что продолжительность жизни личинок КЖ на трансгенном сорте картофеля зависит от возраста насекомого. Наиболее чувствительными к Bt-картофелю оказались личинки I- го возраста. Продолжительность их жизни, в среднем по популяциям, составила 2,5 суток. Наиболее устойчивыми к Bt-картофелю оказались личинки III и IV возрастов (средние по популяциям составили 4,4 и 5,6 суток соответственно). Эти данные согласуются с результатами работы Исмаилова. В то же время, необходимо отметить, что этот показатель варьирует в зависимости от генотипических особенностей популяций. Так, например, наиболее чувствительной в этом отношении оказалась Лабинская популяция. Продолжительность жизни личинок всех возрастов этой популяции была ниже, по сравнению с другими исследованными популяциями и составила в среднем 2,8 суток, тогда как Староминской, например - 5,1 суток. Кроме того, можно заметить, что продолжительность жизни личинок варьирует и в зависимости от окраски яиц из которых они отродились. Из таблицы 15 видно, что для разных географических популяций характер взаимосвязи признаков «окраски яиц» и чувствительности к Bt-картофелю различный. Так, например, если при анализе Краснодарской популяции по этому признаку наибольшую резистентность к Bt-картофелю проявили личинки, отродившиеся из яиц желтой окраски, то для Темрюкской - это были личинки отродившихся из яиц оранжевой окраски, для Лабинской - оранжево-красной окраски и т.д.. Это видно при сравнении как средних по выборке, так и отдельных значений продолжительности жизни по каждому возрасту личинок. В тоже время, это не снижает значимости самого подхода, но только конкретизирует необходимость проведения такого анализа для каждой отдельной географической популяции насекомых.
