Содержание к диссертации
Введение
1. Условия, материал и методы исследований
1.1. Место и условия проведения опытов 11
1.2. Материал исследований 12
1.3. Методы закладки опытов 13
1.4. Методы фитопатологических оценок устойчивости пшеницы к болезням 15
1.5. Изучение структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы 17
2. Биологические особенности возбудителей болезней пшеницы в поволжье и перспективы селекции устойчивых к ним сортов
2.1. Бурая листовая ржавчина 19
2.1.1. Особенности биологии и распространенность в Поволжье 19
2.1.2. Взаимоотношения растения-хозяина и патогена, как основа исследований состава популяций и поиска источников устойчивости к болезням 24
2.1.3. Структура и изменчивость популяции бурой ржавчины пшеницы в Поволжье 27
2.2. Мучнистая роса
2.2.1. Особенности биологии развития 55
2.2.2. Структура популяции 57
2.3. Пыльная головня
2.3.1. Особенности биологии развития 60
2.3.2. Расовая дифференциация популяции 61
2.4. Твердая головня
2.4.1. Особенности биологии развития 64
2.4.2. Структура популяции 66
2.5. Стратегия селекции на устойчивость к основным болезням 68
3. Создание инфекционных фонов для фитопатолотическои оценки и отбора болезнеустойчивых форм пшеницы 74
3.1. Полевые инфекционные питомники 75
3.2. Оценка на устойчивость к патогенам в условиях искусственного климата 86
3.3. Новый способ совмещенной оценки пшеницы на устойчивость к двум патогенам 87
3.4. Оценка и отбор селекционного материала in vitro на устойчивость к бурой ржавчине и мучнистой росе 90
4. Выявление доноров устойчивости пшеницы к болезням
4.1. Источники устойчивости пшеницы к бурой ржавчине 95
4.1.1. Скрининг мировой коллекции и сортов отечественной селекции 95
4.1.2. Идентификация генов устойчивости при помощи тест-клона Р23 98
4.1.3. Дикие виды и сородичи пшеницы как источники устойчивости к бурой ржавчине 99
4.2. Источники устойчивости пшеницы к мучнистой росе
4.2.1. Скрининг мировой коллекции и сортов отечественной селекции 106
4.2.2. Дикие виды и сородичи пшеницы как основной источник генов устойчивости к мучнистой росе 109
4.3. Источники устойчивости пшеницы к твердой головне 110
4.4. Источники устойчивости пшеницы к пыльной головне 112
5. Создание исходного материала для селекции на устойчивость
5.1. Получение гомозиготных линий яровой пшеницы устойчивых к болезням путем интрогрессии генов устойчивости от диких злаков 115
5.2. Получение линий яровой твердой пшеницы, устойчивых к пыльной головне 124
5.3. Создание линий яровой мягкой пшеницы с комплексной устойчивостью к бурой ржавчине, мучнистой росе и пыльной головне 125
5.4. Получение гомозиготных линий озимой пшеницы с комплексной устойчивостью к бурой ржавчине, мучнистой росе, твердой головне 130
6. Реализация схемы ускоренного создания линий озимой мягкой пшеницы с комплексной устойчивостью к болезням в процессе создания сортов
6.1. Характеристика сорта озимой пшеницы Смуглянка 135
6.2. Характеристика сорта озимой пшеницы Рубин 96 140
Выводы 145
Рекомендации для селекционной практики и предложения
Сельскохозяйственному производству 148
Приложения 149
Литература 181
- Методы фитопатологических оценок устойчивости пшеницы к болезням
- Стратегия селекции на устойчивость к основным болезням
- Оценка и отбор селекционного материала in vitro на устойчивость к бурой ржавчине и мучнистой росе
- Дикие виды и сородичи пшеницы как источники устойчивости к бурой ржавчине
Введение к работе
Актуальность проблемы. Пшеница, как важнейшая зерновая культура, занимает в Поволжье до 40% посевных площадей Высокая насьпценность севооборотов пшеницей приводит к ухудшению фитосанитарного состояния агробиоценоза Возрастает поражение посевов наиболее вредоносными заболеваниями* бурой ржавчиной, мучнистой росой, пыльной и твердой головней, пятнистостями листьев, вирусными болезнями и др.
Изменения климатических условий в регионе, являющиеся наглядными показателями глобального потепления климата, также оказывают значительное влияние на состав фитопатогенного комплекса Для развития возбудителей заболеваний создаются оптимальные условия — повышенная атмосферная влажность и температурный режим, осадки и т д
Не менее серьезной причиной возникновения эпифитотий грибных заболеваний на посевах пшеницы является использование в производстве восприимчивых, генетически однородных сортов как озимой, так и яровой пшеницы С.С Санин (2003) считает, что в сельскохозяйственном производстве сорт относится к числу важнейших факторов, влияющих на фитосанитарную обстановку на посевах пшеницы, его вклад в формирование урожая достигает 30-70%. Поэтому в системе интегрированной защиты устойчивые к болезням сорта должны занимать особое место.
В связи с этим повышается значимость исследований в области иммунитета Основной проблемой этих исследований стоит выявление и расширение разнообразия генофонда сельскохозяйственных культур по признакам устойчивости, стратегии использования эффективных генов, подбора доноров для оптимизации иммунологических селекционных программ (В А. Павлюпшн, 2002 г )
Таким образом в условиях неблагополучной фитосанитарной обстановки на посевах шпеницы проблема создания устойчивых сортов является актуальной, а предложенные в данной работе методы создания исходного материала для селекции болезнеустойчивых сортов, основанные на иммунологических принципах, являются необходимыми как для работы иммунологов, так и селекционеров
Диссертационная работа выполнена на базе НИИСХ Юго-Востока в период с 1971 по 2004 гг. Исследования проводились в рамках государственных программ ВАСХНИЛ и РАСХН и в соответствии с тематическим планом НИР НИИСХ Юго-Востока 1971-1990 гг -шифр тем 0 51 03; 0.51.05.1991-2005 гг -шифртем. 02 06; 01 02 20, 02 05.
Цель исследований Разработать систему иммунологических подходов для целенаправленной селекции пшеницы на комплексную устойчивость к наиболее вредоносным болезням в Поволжье Расширить генетическое разнообразие пшеницы по признакам устойчивости к бурой ржавчине, мучнистой росе, пыльной и твердой головне
Задачи исследований;
изучить биологические особенности развития и распространения возбудителей основных грибных болезней пшеницы в Поволжье и провести анализ расового состава и вирулентности их популяций,
исследовать структуру и динамику изменчивости популяции бурой ржавчины пшеницы Puccinia recondita Rob. ex. Desm. f. sp. tritici,
усовершенствовать способы создания усиленных инфекционных фонов, необходимых для оценки и отбора болезнеустойчивых форм пшеницы, с учетом местных климатических условий,
провести скрининг мировой коллекции пшеницы и сортов отечественной селекции и выявить доноры устойчивости к основным грибным болезням,
разработать систему методов создания исходного материала, обладающего устойчивостью к основным грибным болезням;
расширить генетическое разнообразие по признакам устойчивости к основным болезням
создать исходный материал для селекции пшеницы на устойчивость к основным грибным болезням
Научная новизна.
Исследован расовый и патотипный состав популяции бурой ржавчины в Поволжье по вирулентности, а также его динамика, начиная с 70-х годов прошлого века до настоящего времени
На основании знания биологических возбудителей болезней пшеницы в местных климатических условиях предложены варианты создания усиленных инфекционных фонов.
В результате скрининга мировой коллекции ВИР, сортов отечественной селекции, а также диких видов и сородичей пшеницы (всего более 50 тыс образцов), выявлены новые генетические источники устойчивости пшеницы к болезням
Предложен новый способ совмещенной оценки пшеницы на устойчивость к двум патогенам (Авторское свидетельство № 1777726), а также новый способ оценки и отбора селекционного материала in vitro на устойчивость к бурой ржавчине и мучнистой росе (заявка на изобретение №94034770 (034684) с датой приоритета от 20 09.94 г ).
Разработаны схемы ускоренного создания линий яровой мягкой пшеницы с использованием межвидовой гибридизации и биотехнологии, а также линий озимой пшеницы с комплексной устойчивостью к основным грибным болезням
- Созданы сорта озимой пшеницы Смуглянка (Патент 0141 (РФ) — № 9401113 Приоритет 24.11.1993 Зарегистрирован в Государственном реестре охраняемых селекционных достижений, допущенных к использованию, 23.06.98 г; А с 27724) и Рубин 96 (Патент 3654 (РФ). - № 9609725; Приоритет 25.02.2003 Зарегистрирован в Государственном реестре охраняемых
селекционных достижений 13.06 07 г.; А.с. 39730). Оба сорта, обладают комплексной устойчивостью к бурой ржавчине, мучнистой росе и твердой головне и получены по ускоренной селекционной схеме, с применением методов биотехнологии (культуры пыльников, оценки на устойчивость к болезням in vitro и др).
Научная новизна работы подтверждена тремя авторскими
свидетельствами и двумя патентами на сорта
Основные положения, выносимые на защиту. На защиту выносится комплексная иммунологическая схема создания болезнеустойчивого селекционного материала пшеницы для условий Поволжья, включающая следующие направления исследований.
1. Структура популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы, и динамика ее реакции на селекцию и внедрение в производство новых сортов пшеницы с генами устойчивости,
Способы создания усиленных инфекционных фонов в климатической зоне юго-востока;
Система оценок и отбора исходного и селекционного материала на устойчивость к основным грибным болезням,
Пакет доноров устойчивости пшеницы к бурой ржавчине, мучнистой росе, пыльной и твердой головне,
Схема ускоренного создания линий яровой мягкой пшеницы с комплексной устойчивостью к бурой ржавчине, мучнистой росе и пыльной головне с использованием межвидовой гибридизации,
Схема ускоренного создания линий озимой пшеницы с комплексной устойчивостью к бурой ржавчине, мучнистой росе и твердой головне;
Сорта озимой мягкой пшеницы Смуглянка и Рубин 96, с комплексной устойчивостью к бурой ржавчине, мучнистой росе и твердой головне.
Практическая значимость и реализация полученных результатов.
Предложена схема создания линий и сортов пшеницы, устойчивых к болезням, которая за счет применения методов биотехнологии и системы фитопатологических оценок позволяет существенно повысить эффективность отборов на устойчивость и сократить сроки создания новых устойчивых линий и сортов.
Создан и внедряется в производстве (на площади более 30 тыс га) сорт озимой мягкой пшеницы Смуглянка, устойчивый к бурой ржавчине, мучнистой росе, твердой головне и стеблевому хлебному пилильщику Внесен в Госреестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Средне- и Нижневолжском регионах РФ
Проходит Государственное сортоиспытание сорт озимой мягкой пшеницы Рубин 96, также обладающий комплексной устойчивостью к болезням (бурой ржавчине, мучнистой росе, твердой головне).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на VII Всесоюзном совещании по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям (г. Омск, 1981), на VIII Всесоюзном совещании по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям (г Рига, 1986 г), на IX совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (г Минск, 1991 г), на конференции «Проблемы новаторской деятельности ученых, изобретателей и др » (г Саратов, 1996 г ), на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы агроэкологии в интегрированных системах защиты растений» (г Пенза, 1999 г.), на Первом Съезде микологов России (г Москва, 2002), на Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (г Санкт-Петербург, 2002), на научно-практической конференции «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии» (Голицьшо, 2003), на Международной научно-практической конференции «Стратегия адаптивной селекции полевых культур в связи с глобальным изменением климата» (г Саратов, 2004).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 48 научных работ, 9 из которых в рецензируемых изданиях, в том числе получено три авторских свидетельства и два патента на сорта озимой мягкой пшеницы Смуглянка и Рубин 96
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 таблицами и 14 рисунками Состоит из общей характеристики работы, шести разделов экспериментальной части, выводов, рекомендаций для селекционной практики и предложений производству, 9 приложений и списка литературы, включающего 245 источников, в том числе 50 — на иностранных языках
Благодарности. Автор приносит глубокую благодарность кандидату сельскохозяйственных наук МЛ. Веденеевой за научно-методическое руководство, помощь и поддержку при вьшолнении данной работы Выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории иммунитета за помощь при вьшолнении полевых и лабораторных исследований.
Автор приносит глубокую благодарность доктору
сельскохозяйственных наук, профессору В.Б. Лебедеву за глубокий анализ диссертационной работы, ценные предложения и замечания, которые были учтены при подготовке окончательного варианта диссертации
Методы фитопатологических оценок устойчивости пшеницы к болезням
Устойчивость образцов пшеницы к таким болезням, как бурая ржавчина, определяют по двум основным показателям: 1 - по внешнему проявлению реакции растения на заражение патогеном, 2 - по интенсивности проявления заболевания. Поэтому оценку и отбор источников устойчивости к бурой ржавчине проводили в два этапа. Первый этап - полевая оценка в условиях естественных эпифитотий грибных заболеваний или в специально созданных усиленных инфекционных питомниках. Такие питомники позволяют проводить оценку образцов пшеницы на устойчивость в засушливые годы, когда большинство болезней находится в депрессии. Подробно о создании инфекционных фонов описывается в главе 3. Для полевой оценки используется шкала Р.Ф. Петерсона и др. (R.F. Peterson, А.В. Campbell, А.Е. Hannah, 1948), по которой учитывается интенсивность поражения листьев бурой ржавчиной, т.е. действительный процент площади листа, занятой пустулами. Эта оценка проводится, как правило, в фазу молочно-восковой спелости зерна пшеницы. Второй этап - оценка материала, выделенного по устойчивости в поле, в тепличных условиях при искусственном заражении сложной популяцией бурой ржавчины, составленной из споровых образцов различных районов Поволжья. 10-12-дневные проростки инокулируются суспензией урединиоспор гриба. После нанесения инфекции на растения, они опрыскиваются водой из пульверизатора и накрываются влажными сосудами, то есть помещаются во влажную камеру на 12-14 часов при температуре +20-22 град. С. Через 10-12 дней, как правило, на листьях восприимчивых растений развиваются крупные порошащие урединиопустулы. Тип реакции растений на заражение патогеном определяется по шкале Майнса и Джексона (Е.В. Mains, Н.С Jackson, 1926): 0 - отсутствие видимых симптомов - иммунность; 0; - гиперчувствительные пятна - высокая устойчивость; 1 - мелкие пустулы, окаймленные некрозом - устойчивость; 2 - мелкие и средние пустулы, окаймленные некрозом - средняя устойчивость; 3 - средние пустулы без некроза - восприимчивость; 4 - крупные пустулы без некроза - сильная восприимчивость; ед. - единичные пустулы. Встречаются образцы с гетерогенным типом реакции, например - 0;- 2-3 или - 2-3. Устойчивость таких образцов оценивается по преобладающей реакции на заражение. Мучнистая роса. Оценку на устойчивость к мучнистой росе проводили в полевых условиях на естественном и усиленном инфекционных фонах в период наиболее сильного развития болезни, чаще всего в фазу колошения. Степень поражения определяли глазомерно по шкале ВИР (1980): 0 - отсутствие поражения; 1 - поражение очень слабое, в виде легкого налета или единичных подушечек на листьях и междоузлиях нижнего яруса; 2 - слабое поражение, умеренное число подушечек на листьях и междоузлиях нижнего яруса; 3 - среднее поражение. Развитие гриба обильное, главным образом на нижних листьях. На верхних листьях подушечки локальные, рассеяны; 4 - сильное поражение. Гриб сильно поражает все листья и междоузлия. Мицелий может быть обнаружен и на колосе.
Подушечки хорошо выражены, сливающиеся, с обильным спороношением. Пыльная и твердая головня. Оценку на устойчивость к пыльной и твердой головне проводили методом подсчета здоровых и пораженных головней колосьев в каждом образце при искусственном заражении и определяли % больных колосьев. Степень устойчивости сортообразца устанавливали по шкале, разработанной В.И. Кривченко с соавторами (1987): 0 - высокая устойчивость, поражение отсутствует; 1 - практическая устойчивость, поражение не превышает 10%; 2 - слабая восприимчивость, поражение не превышает 25%; 3 - средняя восприимчивость, поражение не более 50%; 4 - сильная восприимчивость, поражение более 50%. Оценка селекционного материала на такие показатели качества зерна, как стекловидность, натурная масса зерна и масса 1000 зерен проводилась по общепринятым методикам (М.Н. Фирсова, Е.П. Попова, 1981). Содержание белка и клейковины в зерне, а также оценка качества клейковины и оценка технолого-хлебопекарных свойств проводились по общепринятым методикам в лаборатории технологии и качества зерна НИИСХ Юго-Востока. Полученные данные подвергали дисперсионному анализу по методике Б.А. Доспехова (1988). Установлено, что у большинства возбудителей грибных болезней растений, в том числе у бурой ржавчины пшеницы, популяции состоят из биотипов, различающихся по вирулентности к различным сортам растения-хозяина. Для изучения структуры популяции бурой ржавчины по признаку вирулентности используются специально подобранные сорта-дифференциаторы и моногенные линии сорта Thatcher. Стандартный набор сортов-дифференциаторов предложили Майне и Джексон в 1926 году. Он включает следующие сорта: Malakoff, Carina, Brevit, Webster, Loros, Mediterranean, Hussar, Democrat. Моногенные линии серии Thatcher получены с помощью беккроссов, отличаются наличием одного из генов устойчивости (D.J. Samborski, 1981, 1982, 1984, 1985; Mcintosh et al., 1995). При анализе рас или патотипов ржавчинных грибов используются монопустульные изоляты в урединиостадии, то есть потомство одной урединиопустулы. В течение вегетационного периода из разных географических зон региона собираются урединиообразцы бурой ржавчины. В тепличных боксах при оптимальных условиях для развития растений пшеницы и патогена (t = +20-22 град. С, относительная влажность воздуха 60-70%, освещенность 10 тыс. люкс) из урединиообразцов выделяются монопустульные изоляты. Для этого растения восприимчивого сорта (Лютесценс 230) в фазу 10-12-дневного проростка инокулируются слабой суспензией урединиоспор бурой ржавчины. Через 5-6 дней на листьях появляются некрозные пятна - будущие урединиопустулы. На одном растении в отдельном сосуде оставляется единичная урединиопустула и изолируется стеклянным изолятором. С одного образца бурой ржавчины выделяется по 10-15 урединиопустул. Каждая из урединиопустул размножается изолированно на восприимчивом сорте озимой пшеницы Лютесценс 230. Размноженные монопустульные изоляты используются для идентификации патотипного состава популяции бурой ржавчины.
Стратегия селекции на устойчивость к основным болезням
В 1966 году Ван дер Планк предложил гипотезу о существовании двух типов устойчивости: вертикальной (расоспецифической) и горизонтальной (нерасоспецифической). Если сорт проявляет устойчивость к отдельным расам патогена, то он обладает вертикальной устойчивостью, а если сорт более или менее устойчив ко всем расам патогена, то это горизонтальная устойчивость. Как правило, вертикальная устойчивость не долговечна, она утрачивается с появлением новых рас и патотипов возбудителя болезни. Горизонтальная устойчивость более долговечна и не зависит от состава популяции возбудителя.
По отношению к внешним условиям горизонтальная устойчивость проявляется в поле и может быть ослаблена или потеряна при искусственном заражении, например в тепличных условиях, благоприятных для развития болезни. Вертикальная устойчивость проявляется в более широком диапазоне внешних условий (температуры, влажности, освещенности), при использовании более высокой инфекционной нагрузки, чем горизонтальная (Ю.Т. Дьяков, 2001). Поэтому отбор на вертикальную устойчивость, к таким патогенам как бурая ржавчина, мучнистая роса, проводят обычно в фазу проростков, которые лишены горизонтальной устойчивости.
Современные исследования взаимоотношений растения-хозяина и патогена несколько изменили понятия о горизонтальной (нерасоспецифической) и вертикальной (расоспецифической) устойчивости.
В настоящее время специфическая устойчивость рассматривается как качественный признак, проявляющийся в виде реакции сверхчувствительности и являющийся результатом взаимодействия гена устойчивости растения и гена авирулентности патогена. Она контролируется олигогенами, которые способны быстро терять эффективность вследствие накопления в популяции патогена мутаций по комплементарным генам авирулентности (Л.А. Михайлова, 2003).
Неспецифическая устойчивость считается количественным признаком. Для возбудителей ржавчинных заболеваний она проявляется в уменьшении репродуктивной способности патогена, в уменьшении числа пустул на единицу листовой поверхности, числа спор в пустуле и увеличении длительности латентного периода (Л.А. Михайлова, 2003).
Горизонтальная или неспецифическая устойчивость дает восприимчивый тип реакции. Степень устойчивости сорта выражается в снижении числа пустул на растении и числа спор в одной пустуле. Выражением степени горизонтальной устойчивости по И.Г. Одинцовой (1977) И.Г. Одинцовой и Л.А. Михайловой (1988) является индекс устойчивости - произведение числа пустул на число спор в них. Расонеспецифическая устойчивость способствует уменьшению селективного давления на фитопатоген, обеспечивая стабильную защиту растений от большого разнообразия физиологических рас возбудителя (Р.Х. Гончарова, Г.В. Тонконог, 1991).
На инфекционном фоне в полевых условиях по типу проявления болезни можно установить форму устойчивости: если наблюдается реакция сверхчувствительности, то сорт обладает вертикальной устойчивостью к расам патогена в данной популяции. Если же два сорта имеют один тип реакции, но различаются по числу пустул или пятен, то один из этих сортов имеет более высокий уровень горизонтальной устойчивости (Ю.Т. Дьяков и др., 2001).
Во многих исследованиях показано, что иногда нет четкого различия между специфической и неспецифической устойчивостью. Не всегда специфическая устойчивость быстро теряется, а неспецифическая остается стабильной долгое время (Ю.Т. Дьяков, 2003; А.П. Дмитриев, 2003).
Сорта с расоспецифической устойчивостью оказывают сильное давление на популяцию патогена. Это приводит к накоплению на таких сортах вирулентных патотипов гриба. По данным специалистов ВНИИФ если сорт с расоспецифической устойчивостью занимает в структуре посевных площадей примерно 12 тыс. га, то в этих посевах появляется новый патотип гриба, поражающий этот сорт (А.А. Макаров, Е.Д. Коваленко, Д.А. Соломатин, Н.М. Маторина, 2003).
Сорта с неспецифической устойчивостью сохраняют это свойство более длительный период. Они поражаются практически всеми патотипами в популяции патогена, но в слабой степени, что не вызывает заметного снижения урожая. При этом замедляется скорость нарастания заболевания, уменьшается число генераций патогена за вегетационный период, предотвращая развитие эпифитотий. В результате снижается риск образования новых, вирулентных патотипов.
При разработке селекционной программы необходимо учитывать специфику патогенов, и на этой основе планировать тип устойчивости будущего сорта. Ю.Т. Дьяков (2003) считает, что нельзя полностью отрицать вертикальную устойчивость или использовать только ее.
В.А. Алфимов, Л.А. Беспалова и О.Ю. Пузырная (2001) считают, что для достижения стабилизации в популяции бурой ржавчины в условиях Краснодарского края необходимо в производственных посевах пшеницы иметь паритет между сортами с горизонтальной и вертикальной устойчивостью, создавая мозаичность посевов. В таких условиях вертикальная устойчивость будет сдерживать начало эпифитотий, а горизонтальная замедлит развитие болезни.
Оценка и отбор селекционного материала in vitro на устойчивость к бурой ржавчине и мучнистой росе
В процессе создания исходного материала нами использовались методы культуры клеток и тканей растений. Эти методы получили широкое распространение в селекции. Они используются не только для расширения генетического разнообразия создаваемого материала, но и значительного ускорения селекционного процесса.
Современная технология создания болезнеустойчивых форм пшеницы также предусматривает применение некоторых известных методов культуры тканей. Так, метод эмбриокультуры используется для преодоления различных видов несовместимости при интрогрессии генов устойчивости от диких злаков, а метод гаплоидии - для стабилизации признака устойчивости в потомстве. Поскольку мы в своих исследованиях использовали эти методы, то для ускорения отбора болезнеустойчивых форм нами изучалась возможность фитопатологической оценки in vitro. По данным литературы известно, что работы в этом направлении предпринимались и это, в основном, были работы по созданию двойных культур (каллус/патоген).
Проблемой двойных культур, то есть изучением взаимоотношений между паразитическими грибами и клетками растения-хозяина in vitro занимались многие исследователи (J.P. Helgeson, G.T. Haberlach, 1980; D.S. Ingram, 1980; D.S. Ingram, I.C. Tommerup, 1973). Двойную культуру получают или непосредственным заражением каллусной ткани стерильной инфекцией гриба (А.Е. Harvey, 1970), или вводя в культуру зараженную грибом ткань растения (W.H. Chen, М.С. Lin, C.Y. Chao, 1979). Однако во многих случаях заразить каллусную ткань растения-хозяина и, тем более, добиться синхронного развития двойной культуры практически не удается (R.D. Milholland, 1962; R. Maheshwari, 1967; Т.В. Смирнова, Е.В. Карташова, М.В. Гусев, 1991; Т.С. Маркелова, Т.В. Тихонова, 1996). Существование системы эксплант/гриб/культуральная среда зависит от многих факторов: состава культуральной среды (концентрация, фитогормоны и т.д.), возраста и генетического состояния экспланта, условий культивирования (температура, влажность, освещение и т.д.). Есть также данные, что не всегда оценка на устойчивость в культуре совпадает с результатами оценки на интактных растениях (D.S. Ingram, I.C. Tommerup, 1973; W.H. Chen W.H, M.C. Lin, C.Y. Chao, 1979).
E.P. Карташова, Т.В. Смирнова, М.В. Гусев (1991) изучали возможность получения двойной культуры Puccinia graminis с суспензионной и каллусной культурами пшеницы. Им удалось наблюдать только фазу прикрепления гиф гриба к клеткам пшеницы. Дальнейшего развития гриба не происходило. Таким образом, анализ литературы и проведенные нами исследования (Т.С. Маркелова, Т.В. Тихонова, 1996; Т.С. Маркелова, М.Л. Веденеева, 1999) показывают, что в настоящее время двойные культуры могут представлять интерес как модели для изучения взаимодействия растения-хозяина и патогена, но не могут использоваться для оценки на устойчивость.
Наиболее простым и доступным методом оценки и отбора устойчивых к облигатным патогенам форм пшеницы является заражение на уровне регенерантов.
Известен метод размножения возбудителя бурой ржавчины в условиях асептики (В.М. Берлянд-Кожевников, К.В. Квитко, И.П. Шитова, В.Е. Буданов, Л.А. Михайлова, 1972), включающий посев в пробирки со стерильной питательной средой обеззараженных зерен пшеницы, получение в этих условиях зеленых проростков и заражение их уредоспорами бурой ржавчины. Нами также изучалась возможность оценки сортов пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине в пробирочной культуре (М.Л. Веденеева, 1975). В данных случаях растения получали из семян, где основным питательным субстратом для проростков являлся эндосперм, а питательная среда не содержала гормонов и других биологически активных веществ, поэтому не отмечено заметного влияния на геном и проявления признака устойчивости.
Между тем многие авторы на примере двойных культур указывают на различия во взаимодействии растений-хозяев и облигатных паразитических грибов in vivo и in vitro. Неизвестно также будет ли идентичной иммунологическая реакция регенерантов in vivo и in vitro.
Целью настоящей работы было обосновать возможность применения методов заражения бурой ржавчиной и мучнистой росой in vitro регенерантов пшеницы, полученных из соматических тканей и пыльников и идентичность реакции иммунности in vivo и in vitro. В условиях in vitro проводили заражение регенерантов яровой мягкой пшеницы бурой ржавчиной (Puccinia recondita Rob. ex Desm. f. sp. tritici) и мучнистой росой (Erysiphe graminis DC. f. sp. Tritici). Бурая ржавчина и мучнистая роса пшеницы были представлены местными популяциями, размноженными в изолированных боксах на восприимчивом сорте Саратовская 55. Инфекционный материал собирали путем стряхивания спор в стерильные пробирки. Непосредственно перед инокуляцией бурой ржавчиной готовили суспензию: 50 мл дистиллированной автоклавированной воды и 30 мг уредоспор тщательно взбалтывались в течение нескольких минут.
В качестве эксплантов растений-хозяев использовались недозрелые зародыши и пыльники сортов пшеницы и линий с различной степенью устойчивости (Саратовская 55, Саратовская 58, изогенные линии серии Thatcher Lr9, Lrl9, Lrl+27+31, линии из межвидовых скрещиваний, созданных в лаборатории (120/97, 124/97, 146/97, 160/97). Зеленые растения-регенеранты получали по общепринятым методикам (С.Ф. Лукьянюк и др., 1981; Т.И. Дьячук, 1989). Для сравнительной оценки семенной материал тех же сортов и линий высевали в тепличных боксах в вазоны с почвой. Условия для выращивания проростков были максимально приближены к условиям регенерации in vitro - освещение до 20 тыс. люкс и температура воздуха - 23-25 град. С. Инокуляцию регенерантов урединиоспорами бурой ржавчины проводили в фазу первого листа путем нанесения суспензии стерильным шприцом на листья. Для поддержания повышенной влажности конец ватно-марлевой пробки, закрывающей пробирку с культурой, смачивался дистиллированной автоклавированной водой. Через 7-8 дней после инокуляции проводили оценку регенерантов на устойчивость к бурой ржавчине по шкале Майнса и Джексона. Затем эти же регенеранты инокулировали конидиоспорами мучнистой росы. На увлажненные листья регенерантов наносили конидии с помощью стерильной иглы. Условия культивирования зараженных регенерантов поддерживались на прежнем уровне. После проявления заболевания через 6-8 дней проводили оценку на устойчивость по общепринятой шкале ВИР (1980), описанной в главе 1.4. Контрольный материал, высеянный в тепличных боксах, инокулировали инфекцией бурой ржавчины и мучнистой росы и оценивали на устойчивость в той же последовательности и теми же методами, что и в культуре.
Дикие виды и сородичи пшеницы как источники устойчивости к бурой ржавчине
Успех селекции на устойчивость к болезням определяется многими факторами, среди которых решающее значение имеют генетические ресурсы, то есть исходный материал. Чем больше и разнообразнее источников устойчивости включается в селекцию, тем больше возникает возможности получить совершенно новые формы растений с обогащенным генофондом. Особое значение имеет источник устойчивости, обеспечивающий эффективную и длительную защиту их от патогенов. К сожалению, в настоящее время генофонд мягкой пшеницы имеет недостаточное количество таких генов. В этом плане наиболее надежными и эффективными донорами новых генов устойчивости являются дикие сородичи культурных растений, о чем писал Н.И. Вавилов еще в 1935 году. Роль диких форм в улучшении возделываемых сортов особенно ярко проявляется на примере пшеницы. Ценным источником генов устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе является Aegilops umbellulata - эгилопс зонтичный (B.S. Gill, H.S. Sharma, W.J. Raupp, L.E. Brrowder, J.H. Hatchett, T.L. Harvey, J.G. Moseman, J.G. Waines, 1985). Первая успешная попытка перенести ген устойчивости к бурой ржавчине от Aeg. umbellulata была сделана Сирсом в 1956 году (E.R. Sears, 1956). Устойчивая к бурой ржавчине линия была названа Трансфер, а ген устойчивости идентифицирован как Lr9 (R.A. Mcintosh, G.E. Hart, K.M. Devos, и др. 1998). На основе гена Lr9 в США созданы сорта ABE, Arthur 71, McNair 701, Riley 67, Oasis, McNair 2203. Все эти сорта являются ценными донорами устойчивости пшеницы к бурой ржавчине. Ученые из Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко (P.O. Давоян, И.В. Бебякина, 2001) для передачи устойчивости к бурой ржавчине от A eg. umbellulata озимой пшенице Аврора использовали геномно-замещенную форму Авролата. В результате ими были получены стабильные чужеродно-замещенные линии, устойчивые к бурой ржавчине.
Генетический анализ устойчивости показал, что линии отличались друг от друга и от известных эффективных генов Lr9 и Lr24 по генам устойчивости. Следовательно, геномно-замещенная форма Авролата может служить ценным источником для передачи устойчивости к листовой ржавчине от Aeg. umbellulata в пшеницу. P.O. Давоян (1991) с сотрудниками для получения линий озимой пшеницы с комплексной устойчивостью к болезням использовали созданный в лаборатории хромосомной инженерии гомолог мягкой пшеницы Т. miguschovae, который содержит два генома от Т. militinae и один геном - от устойчивой к бурой ржавчине формы Aegilops tauschii. В качестве реципиента использовался сорт озимой мягкой пшеницы Кавказ. С помощью беккроссов и последующих отборов были получены линии, фенотипически близкие к рекуррентному сорту Кавказ, но отличающиеся от него высокой устойчивостью к бурой ржавчине и мучнистой росе. В Селекционно-генетическом институте (Украина) в результате скрещиваний культурной пшеницы с Aeg. cylindrical созданы линии озимой мягкой пшеницы, обладающие устойчивостью к мучнистой росе, бурой и стеблевой ржавчине, септориозу, твердой и пыльной головне, фузариозу. Их устойчивость контролируется высокоэффективными интрогрессивными генами.
Эти линии являются ценным исходным материалом для селекции пшеницы на групповую устойчивость к патогенам (Л.Т. Бабаянц, А.И. Рыбалка, О.В. Бабаянц и др., 2001). Гены Lrl9, Lr24, Lr29 трансформированы от пырея Agropiron elongatum L. Ген Lrl9 имеется в канадском сорте Agrus, Lr24 - в сортах американской селекции Agent, Cloud, Osage, Parker 76, Blueboy, McNair 23, Payne, Fox и др. (E.R. Sears, 1956; H.C. Sharma, B.S. Gill, 1983). Сорта озимой пшеницы Аврора и Кавказ, созданные академиком П.П. Лукьяненко, имеют ген устойчивости к бурой ржавчине Lr26, перенесенный в мягкую пшеницу от ржи Secale cereale (Иммунологическая характеристика редких видов пшеницы. Методическое указание, 1975). Дикие злаки послужили также источниками генов устойчивости пшеницы к стеблевой ржавчине (5 -генов), мучнистой росе (Рт-генов), желтой ржавчине (7г-генов), устойчивости к глазковой пятнистости пшеницы и др. (H.C. Sharma and B.S. Gill, 1983; H.T. Stalker, 1980; F.J. Zeller, 1973). Многие сорта имеют комплексную устойчивость к нескольким патогенам, обусловленную генами, интродуцированными от Secale cereale, Agropiron intermedium, A. elongatum, Aegilops и других злаков. По данным исследователей НИИСХ ЦР Нечерноземной зоны и ВНИИ фитопатологии (И.Ф. Лапочкина, Е.Д. Коваленко, А.И. Жемчужина и др., 2003) высокоэффективными генами в Московской области остаются Lr9, перенесенный от Ае. umbellulata, Lr24 от Ag. elongatum, Lr38 от Ag. intermedium, Lr45 от S.cereale и др. В лаборатории генетики и цитологии ЫИИСХ ЦРНЗ создана цитогенетическая коллекция мягкой пшеницы «Арсенал» с чужеродными генами, переданными от видов Т. kiharae, Ае. speltoides, Ае. triuncialis. На инфекционном фоне заражения спорами бурой ржавчины с использованием всего спектра рас, характерных для Московской области, большинство данных линий с чужеродными генами проявляли устойчивость у бурой ржавчине в течение ряда лет (И.Ф. Лапочкина, Е.Д. Коваленко и др., 2004). В качестве доноров иммунитета могут быть использованы более близкие сородичи культурной пшеницы: ее дикие виды. По данным ВИР (1975) такие виды как Triticum топососсит, Т. dicoccum, Т. timopheevi, Т. fungicidum, Т. militinae обладают высокой устойчивостью ко многим грибным болезням. Некоторые виды устойчивы только к отдельным патогенам. Так, вид Т. persicum устойчив к мучнистой росе и пыльной головне, но очень сильно поражается бурой ржавчиной. Н.А. Макарова и Т.В. Лебедева, сотрудники ВИР (1994) изучали образцы Triticum топососсит и Triticum dicoccum с целью выявления эффективных источников устойчивости к бурой и стеблевой ржавчине и мучнистой росе. В результате все изучаемые образцы Triticum топососсит проявили абсолютную устойчивость к популяции возбудителя бурой ржавчины в фазу мол очно-восковой спелости. В фазу проростков лишь 18 образцов были выделены как высокоустойчивые. Большинство этого вида пшениц оказались высокоустойчивыми к мучнистой росе. Из 472 образцов Triticum dicoccum только 4,5% обладали абсолютной устойчивостью к бурой ржавчине и 15,6% оказались устойчивыми к возбудителю мучнистой росы в фазу проростка. В основном это образцы из Австрии, Италии, Турции, Албании, Армении, Оренбургской области и др.
