Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Эпидемиология анемий 10
1.2. Физиологическая роль железа и особенности его метаболизма 11
1.3. Клиническая картина и факторы, способствующие железодефи-цитной анемии 16
1.4. Реакции свободно-радикального окисления в условиях гипоксии... 19
1.5. Принципы терапии железодефицитной анемии 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 33
2.1. Основные этапы исследования. 33
2.2. Схема проведения исследований 35
2.3. Моделирование железодефицитной анемии 36
2.4. Распределение животных по сериям 39
2.5. Характеристика исследуемых препаратов 40
2.6. Характеристика доз, путей и схем введения исследуемых препаратов 44
2.7. Характеристика методов исследования 47
2.7.1. Методы определения показателей «красной крови» и обмена железа в организме 47
2.7.1.1. Определение уровня гемоглобина 47
2.7.1.2. Определение количества эритроцитов 48
2.7.1.3. Определение концентрации сывороточного железа 48
2.7.2. Методы определения» показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты 49
2.7.2.1. Метод индуцированной биохемилюминесценции 49
2.7.2.2. Определение содержания малонового диальдегида 50
2.7.2.3. Определение активности супероксиддисмутазы 50
2.7.2.4. Определение активности каталазы 52
2.7.2.5. Определение концентрации церулоплазмина 52
2.7.3. Методы статистической обработки полученных данных 53
ГЛАВА 3. Исследование влияния препаратов железа на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в крови экспериментальных животных 55
3.1. Исследование показателей индуцированной биохемилюминесценции 55
3.2. Исследование содержания малонового диальдегида 68
3.3. Исследование пула эндогенных антиоксидантов 73
ГЛАВА 4. Исследование показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в крови экспериментальных животных при сочетанном введении препаратов железа с антиоксидантами 87
4.1. Исследование показателей индуцированной биохемилюминесценции 87
4.2. Исследование содержания малонового диальдегида 97
4.3. Исследование пула эндогенных антиоксидантов 101
Обсуждение результатов исследований 115
Выводы 134
Практические рекомендации 136
Библиографический список 137
- Физиологическая роль железа и особенности его метаболизма
- Характеристика доз, путей и схем введения исследуемых препаратов
- Определение активности супероксиддисмутазы
- Исследование содержания малонового диальдегида
Введение к работе
Железо является важнейшим элементом, выполняющим широкий спектр физиологических функций, а его дефицит приводит к развитию такого заболевания, как железодефицитная анеми*(ЖДА) (Захарова И.Н., Заплатников А.Л., Малова Н.Е., 2003). По данным Всемирной организации здравоохранения, же-лезодефицитной анемией в мире страдает около 1 800 000 000 человек (WHO, 1998).
При данном заболевании формируются функциональные и морфологические изменения в различных органах и тканях (Дворецкий Л.И., 2001; Казакова Л.М., 2001; Захарова И.Н., Заплатников А.Л., Малова Н:Е., 2003), которые проявляются в виде анемического и сидеропенического синдромов (Протокол ведения больных. Железодефицитная анемия, 2005). При этом основным патогенетическим звеном является- тканевая гипоксия, при которой активируется свободно-радикальный процесс и снижается активность антиоксидантной системы вследствие, в частности, нарушения белковообразующей функции (Зарубина И.В., Шабанов П. Д., 2004; Новиков В.Е., Левченкова О.С., Парфенов Э.А., 2005; Бегова СВ., Османова З.М., Омаров Н.С., 2007; Евсеев А.В. с соавт., 2008; Gibson G.E., Huang Н. М., 2004).
Вместе с тем, известно, что ферропрепараты, являющиеся основой заместительной терапии дефицита железа, также могут активировать процесс пере-кисного окисления липидов (Defrere S. et al., 2008; Dimitrov J.D. et al., 2008; Mozuraityte R., Rustad Т., Storro I., 2008).
Вследствие этого при лечении ЖДА возникает необходимость коррекции изменений процесса свободно-радикального окисления, обусловленных как проводимой ферротерапией, так и явлениями наблюдаемой гипоксии. Указанная задача может быть решена как за счет обоснованного выбора двух- или трехвалентного препарата железа, так и выбора наиболее комплементарного с этим препаратом антиоксиданта.
При этом вопросы, касающиеся влияния препаратов железа на показатели перекисного окисления липидов- и антиоксидантнои защиты, до настоящего времени остаются недостаточно изученными (Блошанский Ю.М., Geisser Р., Хасабов Н.Н., 2006; Заспа Е.А., 2006; Dimitrov J.D. et. al., 2008; Hsiao J.K. et al., 2008; Wang L. et al., 2008; Weinberg E.D., 2008).
В связи с вышеуказанным, исследования, посвященные изучению влияния ферропрепаратов, относящихся к различным группам (двух- и трехвалентного железа), на процесс перекисного окисления липидов и антиоксидантнои защиты, а также наиболее комплементарных с ними антиоксидантов при коротком курсе введения, являются актуальной задачей клинической фармакологии.
Цель исследования. Изучение влияния препаратов железа на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантнои защиты в крови экспериментальных животных, а также комплементарности этих препаратов с антиоксидантами при коротком курсе введения.
В соответствии с поставленной» целью решались следующие
задачи:
Изучить влияние препарата двухвалентного железа сульфата/серин («Актиферрин») в эквитерапевтической дозе на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантнои защиты в крови экспериментальных животных.
Исследовать влияние препарата трехвалентного железа (III) гидроксид полимальтозата (мальтофер) на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантнои защиты в крови экспериментальных животных при введении его в эквитерапевтической дозе.
Изучить комплементарность водорастворимого антиоксиданта этилме-тилгидроксипиридина сукцината (мексидола) с препаратами двух- и трехвалентного железа при коротком курсе введения в эксперименте.
7 4. Исследовать комплементарность жирорастворимого антиоксиданта витамина Е (токоферола ацетата) с препаратами двух- и трехвалентного железа при коротком курсе введения в эксперименте.
Научная новизна работы. Проведено сравнительное исследование
влияния препаратов железа, относящихся к различным группам - двух- и трехвалентного, на динамику показателей перекисного окисления липидов и анти-оксидантной защиты в крови экспериментальных животных на различных эта-пах введения этих препаратов.
Доказано, что изучаемые препараты железа, в зависимости от химической
; структуры, в разные сроки вызывают активацию перекисного окисления липи-
дов. Препарат двухвалентного железа сульфата/серин («Актиферрин») активи-рует процесс ПОЛ через 1 сутки его введения, что проявляется в виде увеличе-
I ния свободно-радикальной активности плазмы, замедлении роста антиокси-
1 дантной активности и повышении скорости спада процесса СРО. Препарат
і*
трехвалентного железа' (ПІ)1 гидроксид полимальтозат (мальтофер) на ранних
I этапах обусловливает незначительное, а на более поздних этапах - выраженное
* влияние на указанный процесс, что-подтверждается увеличением скорости'спа-
да процесса СРО^и снижением активности СОД (через 1 сутки его введения), снижением концентрации МДА (через 5 суток), а также снижением антиоксидантний активности и активности СОД (через 10 суток), увеличением свободно-радикальной активности плазмы и скорости спада процесса* СРО (через 20 су-ток), снижением содержания МДА (через 30 суток).
Установлено, что при коротком курсе введения водорастворимый антиок-
сидант этилметилгидроксипиридина сукцинат (мексидол) наиболее комплемен
тарен с препаратом двухвалентного железа «Актиферрином», о чем свидетель
ствует динамика таких показателей, как потенциальная'способность плазмьг к
< СРО, концентрация МДА и активность СОД. Жирорастворимый антиоксидант
j витамин* Е (токоферола ацетат) наиболее комплементарен с препаратом трехва-
\ лентного железа мальтофером, что подтверждается динамикой таких показате-
?
8 лей, как потенциальная способность плазмы к СРО, концентрация МДА и церу-лоплазмина.
Практическая ценность работы состоит в том, что полученные результаты позволяют оптимизировать терапию железодефицитной анемии на основе обоснованного выбора ферропрепарата с учетом особенностей влияния препаратов двух- и трехвалентного железа на процесс свободно-радикального окисления и сроков активации ими указанных реакций, а также сочетанного назначения с ними наиболее комплементарного антиоксиданта, под контролем динамики показателей перекисного окисления липидов.
Результаты исследований внедрены в деятельность лечебно-профилактических учреждений службы медицинского обеспечения*на Горьков-ской железной дороге - филиале ОАО «Российские железные дороги».
По результатам исследования зарегистрирована Заявка на изобретение № 2008149614 «Способ лечения железодефицитной анемии у беременных» в Федеральном институте промышленной собственности Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам..
Основные положения работы внедрены и используются в процессе обучения студентов, клинических ординаторов и интернов на кафедре общей и клинической фармакологии ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия».
Основные положения, выносимые на защиту:
Существующие различия во влиянии препаратов двух- и трехвалентного железа на процесс перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты проявляются на разных этапах их введения и обусловлены особенностями химической структуры, а также фармакокинетики железосодержащих препаратов.
Препарат двухвалентного железа сульфата/серин («Актиферрин») активирует процесс перекисного окисления липидов і уже на ранних этапах его введения (через 1 сутки), а препарат трехвалентного железа (III) гидроксид по-
9 лимальтозат (мальтофер) на ранних этапах обусловливает незначительное, а на более поздних этапах - выраженное влияние на указанный процесс.
3. При коротком курсе введения водорастворимый антиоксидант этилме-тилгидроксипиридина сукцинат (мексидол) наиболее комплементарен с препаратом двухвалентного железа «Актиферрином», а жирорастворимый антиоксидант витамин Е (токоферола ацетат) - с препаратом трехвалентного железа мальтофером.
Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации представлены и обсуждены на 2-й Российско-Китайской-научной конференции по фармакологии «Фундаментальная фармакология и фармация — клинической практике» (Пермь, 2006); Международном конгрессе «Развитие фармакоэкономики и фармакоэпидемиологии в Российской Федерации» (Москва, 2006); XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); VI Международном, конгрессе «Доказательная медицина - основа современного»здравоохранения» (Хабаровск, 2007); XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008).
Публикации. По теме диссертации имеется 9 публикаций, в том числе 1 - в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка. Работа изложена на 167 страницах текста компьютерного набора, иллюстрирована 14 рисунками, 24 таблицами. Библиографический список содержит 298 названий работ, из них 170 отечественных и 128 зарубежных автора.
Физиологическая роль железа и особенности его метаболизма
У взрослого здорового человека в организме в среднем содержится около 3-5 г железа (40-50 мг Fe/кг массы тела). Около 60% железа находится в гемоглобине, а примерно 30% железа входит в состав ферритина - депо железа. Депо железа - величина непостоянная и определяется разницей между поступив шим и выделенным из организма железом (Зайчик Л.Ш., Чурилов А.П., 2001; Kagamimori S. et al., 1998; Carley A., 2003). Физиологическая роль железа в жизнедеятельности человека велика. Железо включено во многие белки, имеющие важное значение для жизни растений и животных, такие как: гемопротеины (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, ци-тохромоксидаза, пероксидаза, миелопероксидаза, каталаза); железофлавопро-теины (цитохром-с-редуктаза, сукцинатдегидрогеназа, пролиноксидаза, НАДФ-дегидрогеназа, ацил-КоА-дегидрогеназа, ксантиноксидаза и др.); белки, содержащие железо различных молекулярных конфигураций (трансферрин, ферри-тин, гемосидерин, мобилферрин, лактоферрин и др.) (Бисярина В.П., Казакова A.M., 1979; Вудли М., Уэлсен А., 1995; Захарова И.Н., Заплатников-А.Л., Мало-ваН.Е.,2003). О роли железа в энергетическом метаболизме свидетельствует тот факт, что около половины ферментов или кофакторов цикла Кребса либо содержат этот металл, либо нуждаются в его присутствии (Казюкова Т.В., Самсыгина Г.А., Калашникова Г.В., 2000; Румянцев А.Г., Токарев Ю.Н., 2000; Мальцев СВ., 2001; Самсыгина Г.А., 2001). Железо необходимо для формирования в мозге дофаминовых (D2) рецепторов (Tucker О.М., Sandstead Н.Н., Penland J.G., 1984; Salonen J.T., 1986; Langstaff F.J. et al., 1993; Yip R., 1998). Низкий уровень железа мешает деградации ГАМК или нарушает функционирование нейронов, производящих дофамин.
В связи с этим железодефи-цит не сводится только к гематологическому проявлению, а затрагивает функции всех клеток, особенно в высокоаэробных тканях, поэтому многие его проявления выражаются в аномалиях поведения и психических симптомах (Oski F.A. et al., 1983; Oski F.A., 1992; Tuomeinen T.P.J et al., 1999). Длительный дефицит железа у детей раннего возраста способствует нарушению миелинизации нервных волокон, формированию структур мозга, что является причиной задержки умственного и моторного развития (Румянцев А.Г., 2001; Mercuriali F. et al., 1994; Yap P.L., Leaver H.A., Gillon J., 1998). От содержания железа в организме зависят процессы адаптации, биоритмы обменных процессов, состояние иммунной системы (Михеенко Т.А., Иванова О.А., 2006; Banha J. et al., 2008; Wang L. et al., 2008). При дефиците железа снижается уровень альфа-токоферола, повышается уровень малонового-диаль-дегида, свидетельствующего о повышении активности ПОЛ, снижается потен-циал антиоксидантной системы (Баркова Э.Н., Назаренко Е.В., Жданова Е.В:, 2005; Бегова СВ., Османова З.М., Омаров Н.С., 2007). Железо оказывает влияние на процессы синтеза белков, регулирующих процессы апоптоза (Carlini R.G. et al., 2006). При-дефиците железа снижаются показатели фагоцитарной активности моноцитов и циркадный ритм их активности (Сафуанова F.IIL, Никуличева В.И., Бакиров, А.Б., 2004; Баркова Е.Н1, Барков О.Н., Назаренко Е.Н., 2005; Devaki Р:В., Chandra R.K., Geisser P., 2007). Регуляция цитокинами, в частности, интерлейкином-6 внутриклеточного содержания железа в макрофагах является одним из-важнейших механизмов защиты организма от инфекций, вызванных внутриклеточными микроорганизмами (Colling H.L., 2008; Paradkar P.N., 2008). Хелатный комплекс железа увеличивает выработку сосудистого эндотелиального фактора роста клеток (Lavglois A. et al., 2008). При наличии дефицита железа формируется оксидативный стресс и наблюдается дисфункция эндотелия, что может рассматриваться -в-качестве предиктора тяжелых сосудистых расстройств (Желобов В.Г. с соавт., 2005). При недостатке железа повышается активность калликреин-кининовой системы (Жилкова Е.Н., 2004). Вместе с тем, высокие концентрации железа могут приводить к развитию как острой, так и хронической патологии. Железо в данном случае способствует инициации, болезни или же является совместно действующим фактором в ее поддержании.
Так, высокое содержание железа было найдено в, областях мозга у больных с рассеянным склерозом, в коже области венозных трофических язв нижних конечностей (Simka М, Rybak Z., 2008; Weinberg E.D., 2008; Stankiewicz J.M., Brass S.D., 2009). В норме процессы обмена железа в организме строго регулируются, поэтому их нарушения сопровождаются либо его дефицитом, либо-его избытком. Метаболизм железа в организме представляет один из самых высокоорганизованных процессов, при котором практически все железо, высвобождающееся при распаде гемоглобина и других железосодержащих белков, вновь утилизируется (Зайчик Л.Ш., Чурилов А.П., 2001; Казюкова Т.В ., Самсыгина Г.А., Левина А.Л., 2002; Macdougall I.C. et al., 1992; Kohlmeier L. et al., 1998; Andrews N.C., 1999; Al-Othaimeen A., Osman A., Al Orf S., 1999). Способность организма выводить железо строго ограничена, таким образом, процесс всасывания железа является основным в поддержании гомеостаза железа (Самсыгина F.A., 2001; Breymann С, 1998; Danielson B.G., 1998; Andrews N.C., 1999; Blot I., Diallo D., Tcheria G., 1999; Carley A., 2003).
В клетках слизистой оболочки тонкого кишечника во время процесса всасывания закисное железо Fe2+ превращается в окисное железо Fe3+, в плазме включается в состав трансферрина и транспортируется по всему организму (Lebrecht A., Haberlin F., Faberhard J., 1995; Krafft A., Breymann C, Huch R., 2000; Halterman J. S., 2001). Трансферрин синтезируется печенью. Он отвечает за транспортировку не только всосавшегося в кишечнике железа, но и железа, поступающего из разрушенных эритроцитов для повторного использования (Walter Т., 1989; Van Wyck D.B., 1991; Tomkins А., 2002). В физиологических условиях занято не более чем 30% железосвязывающих рецепторов трансферрина плазмы. Это определяет общую железосвязывающую способность плазмы (100-150 мкг/100 мл) (Bogen D.L. et al., 2000; Theil E.C., Eisenstein R.S., 2000; Tomkins A., 2002). Молекулярный вес железотрансферринового комплекса слишком велик для того, чтобы выделяться почками, поэтому он остается-в кровеносном русле
Характеристика доз, путей и схем введения исследуемых препаратов
При выборе доз руководствовались средними терапевтическими дозами, в которых изучаемые препараты рекомендованы для клинического применения. Пересчет доз с человека на крыс осуществлялся с учетом коэффициентов поверхности тела по методу эквитерапевтических доз (Freireich E.J., 1966). Принцип расчета основанна том, что дозы препарата, рассчитанные на единицу поверхности тела, часто близки для разных видов животных. Исходя из этого, умножив величину дозы в мг/кг на коэффициент для данного вида животных с у определенной массой тела, получают дозу в мг/м . Чтобы вычислить дозу в мг/кг для-другого вида, следует найденную величину разделить на коэффициент этого вида с известной массой тела. Расчет производился по формуле: D для крысы (мг/кг) = (D-человека (мг/кг) х коэффициент-дня человека) / коэффициент для крысы, где D - доза (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005). Например, для крысы массой-200 г эквитерапевтические дозы препаратов-составили: - «Актиферрин»: средняя терапевтическая доза для человека 200 мг/сутки (в пересчете на двухвалентное железо). Следовательно, DKpbICbI=((200 мг/70 кг)х39)/6,5=17,14 мг/кг. Учитывая, что в «Актиферрине» в 1 мл содержится 9,48 мг Fe2+, то рассчитанная доза содержится в 1,81 мл.
Следовательно, 1 крысе массой 200 г необходимо вводить 0,362 мл препарата «Актиферрин» в сутки, что соответствует 6,52 каплям (в 1 мл - 18 капель). - мальтофер: средняя терапевтическая доза для человека 200 мг/сутки (в пересчете на железо элементарное). Таким образом, DKpblCbI= ((200 мг/70 кг)х39)/6,5=17,14 мг/кг. Учитывая, что в мальтофере в 1 мл содержится 50 мг Fe элементарного, то указанная доза содержится в 0,34 мл. Следовательно, 1 крысе массой 200 г необходимо вводить 0,07 мл препарата мальтофер в сутки, что соответствует 1,4 каплям (в 1 мл - 20 капель). - мексидол: средняя терапевтическая доза для человека 300 мг/сутки; следовательно, DKpbICb,= ((300 мг/70 кг)х39)/6,5=25,71 мг/кг в сутки. - токоферола ацетат: средняя терапевтическая доза для человека при заболеваниях, в патогенезе которых отмечается увеличение липопероксидации, составляет 100 мг/сутки (Клиническая фармакология антиоксидантов, 2003). Таким образом, DKpbICbI= ((100 мг/70 кг)х39)/6,5=8,57 мг/кг в сутки. Учитывая, что масса экспериментальных животных увеличивалась в течение периода введения препаратов, то через каждые 10 суток осуществлялась корректировка дозы. Пути введения изучаемых препаратов экспериментальным животным определялись в соответствии со способом, рекомендованным дляшх клинического применения. Изучаемые препараты железа в виде растворов вводились животным через зонд в желудок с 0,5 мл дистиллированной воды, содержащей суточную дозу препарата железа. Контрольной группе животных вводили по 0,5 мл дисти-лированной воды тем же способом, что и животным опытных групп. Антиокси-данты (мексидол и токоферола ацетат) - парентерально (внутримышечно), ин-сулиновыми, шприцами с ценой деления 0,01 мл. Схема введения препаратов: изучаемые препараты железа («Актиферрин» и мальтофер) вводились 1 раз в сутки, в течение 30 суток (7 раз в неделю).
Продолжительность введения препаратов железа определялась на основании рекомендуемого курса клинического применения железосодержащих препаратов в лечебных дозах (Протокол ведения больных. Железодефицитная анемия, 2005). Комбинации препаратов железа с антиоксидантами вводились также 1 раз в сутки, в течение 5 суток, поскольку в этой серии экспериментальных исследований была поставлена задача изучить комплементарность антиоксидантов (водорастворимого, и жирорастворимого) с препаратами двух- и трехвалентного железа причзведении их коротким курсом. Кроме того; учитывались данные литературы, свидетельствующие- о том, что мексидол в дозе 25 мг/кг (эквитерапевтическая доза для крыс) достоверно уменьшает выраженность процессов ПОЛ при посттравматических процессах при введении его именно коротким курсом (Проданец Н.Н., 2007). Содержание гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Принцип метода основан на том, что гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метге-моглобин, образующий с ацетоангидридом гемиглобинцианид (цианметгемог-лобин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в образце крови и измеряется фотометрически при длине волны 540 нм. Методика определения: к 5 мл трансформирующего раствора добавляли 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), хорошо перемешивали. Исследование проводили через 10 минут против холостой пробы (трансформирующего раствора). Определение оптической плотности проводилось при длине волны 540 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывали также, как и пробу цельной крови. Окраска устойчива в течение 1 часа. Концентрацию гемоглобина в крови рассчитывали по формуле: С=Ео/Екх120, где: С — концентрация гемоглобинав опытной пробе, г/л; Е0 - оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.; Ек - оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;
Определение активности супероксиддисмутазы
Принцип метода заключается в том, что при введении в биологическую систему перекиси водорода и сульфата железа происходит каталитическое разложение перекиси водорода ионами металлов переменной валентности (Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К., 1983). Образующиеся1 при этом свободные радикальь инициируют свободно-радикальное окисление в исследуемом субстрате. Рекомбинация, радикалов приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением квантов света. Протекающий свободно-радикальный процесс регистрируется-в течение 30 секунд - времени наибольшей информативности об его интенсивности. На интенсивность свечения при этом оказывает влияние полный комплекс соединений, обладающих анти- и прооксидантным действием, то есть данный метод дает возможность оценить уровень компенсаторных механизмов свободно-радикального процесса в организме. Для регистрации индуцированной хемилюминесценции использовался биохемилюминометр БХЛ-06, сопряженный с компьютером IBM PC/AT в диалоговом режиме. Результат распечатывался в унифицированной форме в виде хемилюминограммы с расчетом следующих показателей: - Imax (mV) - максимальная интенсивность свечения, отражающая потенциальную способность биологического объекта к свободно-радикальному окислению, характеризует его свободно-радикальную активность; (mV) - светосумма хемилюминесценции за 30 секунд, величина ее соответствует обрыву цепи свободно-радикального окисления, и поэтому она обратно пропорциональна активности антиоксидантной системы; - tg a2 — тангенс угла наклона (спада) кинетической, кривой хемилюми-несценции; показатель, характеризующий скорость снижения процесса свободно-радикального окисления и свидетельствующий об активности антиокси-дантной системы. 2:1.2.2.
Определение содержания малонового диальдегида Малоновый диальдегид (МДА) является вторичным продуктом перекис-ного окисления липидов; его концентрация указывает на интенсивность процесса ПОЛ и служит маркеромістепени эндогенной интоксикации. Как правило, высокое- содержание малонового диальдегида соответствует тяжелой степени эндогенной интоксикации. В настоящей работе определение содержания МДА проводилось по методу Smith J.B. (1976). Принцип метода заключается в том, что при высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Методика определения: к 0,2 мл плазмы добавляли 1,8 мл трисНО-буфер.-(рН=7,4), инкубировали 10 мин при 37 С, затем добавляли 0,5 мл НСЮд (1 н) и 1 мл ТБК (0,8%), помещали на кипящую водяную баню на, 1 ч, охлаждали и регистрировали оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны Х,=532 нм против контрольной пробы. Расчет производили с использованием коэффициента молярной экстинк-ции (1,56 х 105М" см"1) и с учетом разведения. Результат выражали в нмоль/мл. Супероксиддисмутаза (СОД) относится к антиоксидантам водной фазы, является ферментом первого этапа антиоксидантной защиты, снижая концен трацию супероксидных радикалов; тем самым препятствует восстановлению ими ионов трехвалентного железа до двухвалентного: Наличие СОД в организме позволяет поддреживать физиологическую концентрацию супероксидных радикалов в тканях, что? обеспечивает возможность.существования организма в кислородной атмосфере и использование им кислорода; в качестве конечного акцептора электронов; При железодефицитнойЇанемии активность СОД.в эритроцитах повышена. Определение, активности СОДпроводили по методуNischikimi Ml (1972).. Принцип метода основан на способности фермента СОД конкурировать с. нитросиним; тетразолием; (НТ) за супероксидные анион-радикалы, образующиеся в результате аэробного1 взаимодействия! НАДН; и? феназинметасульфата. В- результате этой реакции HGT восстанавливается- с г образованием гидразин-тетразолия. и регистрируется при- 540" нм: В присутствии; фермента ЄОДі процент восстановления НСТ уменьшается;. Методика определения: отмытые!эритроциты; гемолизировалшв трис-НС1ї буфере (рН=8)? в соотношении? 1:20: К. F мл гемолизата добавляли 300 мг КЩРО4 и 0,4 мл смесихлороформ/этанол (3:5): Затем помещали на холод: на 15 мищ после чего центрифугировали 10?мин при 12000 об/мин, отбирали центри.-фугат, который вносили в кювету, и измеряли экстинкцию. холостой и опытной проб; на спектрофотометре через 1 мин после добавления НАДН против контрольной пробы. Активность фермента вычисляли по формуле: А = Т/(100%-1), где А — активность фермента в условных единицах; Г - процент торможения: реакции; восстановления НСТ в пробег за 1 мин,(50% ингибирования этой реакции соответствует 1 условной единице).. Активность фермента: выражали в условных единицах:на грамм,гемоглобина в минуту (ед.акт./г НЬмин). Каталаза также относится к антиоксидантам водной фазы, является ферментом второго этапа антиоксидантной защиты, удаляет избыток перекиси водорода, образующейся на первом ее этапе из супероксидных радикалов при участии фермента СОД. Таким образом, каталаза обеспечивает детоксикацию перекиси водорода.
При проведении настоящих исследований активность каталазы определяли по методу Aebi Y. (1970). Принцип метода заключается в том, что каталаза в нейтральной среде разрушает перекись водорода до молекулярного кислорода и воды, об-активности фермента судят по убыли перекиси водорода в инкубационной среде. Методика определения: отмытые эритроциты гемолизировали в трис-НС1 буфере (рН=8) в соотношении 1:20. Затем к 0,1 мл гемолизата добавляли 4,9 мл фосфатного буфера (разведение 1:1000). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при- А-=240 нм. Активность каталазы исследовали при низкой--концентрации перекиси, так как насыщающая концентрация ингибирует фермент, и рассчитывали как константу скорости»реакции первого порядка: K = 2,3xlgE2/201gE3-E1 Активность каталазы выражали в условных единицах на грамм гемоглобина в секунду (ед.акт./гНЬсек).
Исследование содержания малонового диальдегида
Малоновый диальдегид (МДА) является вторичным молекулярным продуктом перекисного окисления липидов, его концентрация указывает на интенсивность процесса ПОЛ. В результате проведенного исследования были получены следующие исходные концентрации МДА в крови экспериментальных животных: 0,81 ±0,05 нмоль/мл (табл. 3.7). Через 1 сутки отмечалось повышение концентрации МДА по сравнению с исходным уровнем у животных всех трех групп (Р 0,05 - 1-й и 3-й группах, Р 0,01 - во 2-й группе) (табл. 3.7). При этом у животных 1-й группы на фоне введения «Актиферрина» увеличение содержания МДА было менее значительным, чем у животных 2-й группы (Р 0,01) и группы контроля (Р 0,05) (табл. 3.8). Через 3 суток изменения концентрации МДА были несущественными по сравнению с исходным значением во всех трех экспериментальных группах. Следует отметить, что при этом тенденция динамики содержания МДА изменилась по сравнению с предыдущим этапом исследования — если через 1 сутки выявлено различной степени выраженности повышение концентрации МДА у животных всех трех групп, то через 3 суток, напротив, отмечалась тенденция к ее снижению (табл. 3.7). Вместе с тем, межгрупповых различий на этом этапе исследования не выявлено (табл. 3.8). Примечания: 1-я группа - животные, которым вводили препарат железа сульфат/серин («Актиферрин»); 2-я группа - животные, которым вводили препарат железа (III) гидроксид полимальтозат (мальтофер); 3-группа - контрольная; Pi(...зо - уровень значимости различий между показателем через 1 сутки,.. .30 суток и исходным уровнем. Через 5 суток во всех трех группах животных также регистрировалось снижение: содержания-МДАпо -сравнению с исходным уровнем, которое было статистически значимым только у животных 1-й группы (Р 0,05) (табл. 3.7).
При этом наиболее существенно концентрация МДА снизилась в 1-й группе (по сравнению с группой мальтофера — в 3?разаі(Р 0,001); по сравнению с группой контроля - в 5 раз (Р 0,05)): У животных;.которым,вводили мальтофер, снижение содержания МДА,также было более значительным,:чем в; группе контроля (Р 0,00Г) (табл. 3:8). Примечания: 1-я группа - животные, которым вводили препарат железа сульфат/серин.(«Актиферрин»); 2-я= группа - животные, которым вводили-препарат железа (III) гидроксид полимальтозат (мальтофер); З.-группа - контрольная; изменение концентрации МДАї(...зо - изменение показателя через" К су тки,... 3 О суток по сравнению с исходным уровнем; Рі-з;2-з; 1-2 - уровень значимости различий между изменениями показателя в соответствующих группах животных. Через 10 суток также отмечалось снижение концентрации МДА, в 1-й и 2-й группах - незначительное, а в 3-й группе - статистически значимое (Р 0,05) (табл. 3.7). Причем у животных в группе «Актиферрина» снижение содержания МДА было менее значительным, чем в группе мальтофера (Р 0,05) и в группе контроля (Р 0;01) (табл. 3.8). Через 20 суток содержание МДА изменилось несущественно по сравнению с исходным значением во всех трех группах (табл. 3.7). Однако необходимо отметить, что в 1-й группе на фоне введения «Актиферрина» регистрировалась тенденция к повышению концентрации МДА, тогда как во 2-й-группе при-введении мальтофера, напротив, выявлено некоторое снижение содержания МДА (Р 0,05 между 1-й И 2-й группами) (табл. 3.8): Через 30 суток концентрация МДА уменьшилась статистически значимо по сравнению с исходными данными в 1-й и-2-й группах (Р 0,001 в обеих указанных группах) (табл. 3.7).
При этом изменения указанного показателям 1-й и-2-й группах были более существенными, чем в группе контроля (Р 0,05 в обеих группах) (табл. 3.8). Таким образом, анализ результатов исследования содержания вторичного молекулярного продукта перекисного окисления липидов (МДА) показал, что под влиянием препарата двухвалентного железа сульфата с серином («Акти-феррин») концентрация МДА изменяется ступенчато в течение периода наблюдения. Так, через 1 сутки и 20 суток происходит повышение, а в остальные сроки исследования, напротив, снижение концентрации МДА по сравнению с исходным уровнем. При этом через 1 сутки повышение концентрации МДА в группе «Актиферрина» меньше такового в группе контроля (в4 раза), а также в группе мальтофера (в 6 раз) (рис. 3.4).
