Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль свободнорадикального окисления белков и липидов в функциональной активности клеток 11
1.1.1. Участие активных форм кислорода в функциональной активности клеток 11
1.1.2. Роль окислительной модификации белков в функциональной актив-ности клеток 14
1.1.3. Роль перекисного окисления липидов в функциональной активности клеток 16
1.2. Роль окислительной модификации белков при патологических состояниях 18
1.3. Роль перекисного окисления липидов в патогенезе заболеваний внутренних органов 24
1.4. Коррекция нарушений свободнорадикального окисления белков и липидов, как одна из составляющих комбинированной терапии больных бронхиальной астмой 32
1.4.1. Роль антиоксидантов в коррекции оксидантно антиоксидантного статуса 32
1.4.2. Коррекция оксидативного стресса у больных бронхиальной астмой 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Общая характеристика обследованных пациентов 44
2.2. Медикаментозная терапия обследуемых пациентов 49
2.3. Общеклинические методы обследования 56
2.4. Специальные методы исследования 59
2.4.1. Определение окислительной модификации белков в плазме крови по уровню карбонильных производных 59
2.4.2. Определение продуктов перекисного окисления липидов 60
2.4.3. Определение активности супероксиддисмутазы 62
2.5. Методы статистической обработки данных 63
Результаты собственных исследований 65
Глава 3. Клинико-диагностическое значение исследования показателей оксидантно-антиоксидантного статуса у больных бронхиальной астмой ... 65
3.1. Состояние показателей свободнорадикального окисления и антиокси-дантной системы у больных бронхиальной астмой 65
3.2. Зависимость показателей системы свободнорадикальное окисление антиоксидантная защита у больных бронхиальной астмой от различных факторов 68
3.3. Анализ «однородности» групп исследования 76
Глава 4. Эффективность антирадикальной терапии в составе комплексного лечения больных с обострением бронхиальной астмы 80
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 101
Выводы 113
Практические рекомендации 115
Список литературы 117
- Роль окислительной модификации белков в функциональной актив-ности клеток
- Коррекция нарушений свободнорадикального окисления белков и липидов, как одна из составляющих комбинированной терапии больных бронхиальной астмой
- Определение продуктов перекисного окисления липидов
- Зависимость показателей системы свободнорадикальное окисление антиоксидантная защита у больных бронхиальной астмой от различных факторов
Введение к работе
Актуальность темы
Бронхиальная астма является серьезной медицинской проблемой здравоохранения, наносящей существенный урон здоровью людей всех возрастов [9, 53, 124]. Во всем мире отмечается неуклонный рост числа больных бронхиальной астмой, что особенно характерно для экономически развитых стран. Эпидемиологические исследования последних лет свидетельствуют о том, что от 4 до 10% населения планеты страдают бронхиальной астмой различной степени выраженности [124].
Бронхиальная астма наносит значительный экономический ущерб, связанный с временной и стойкой утратой трудоспособности самой активной части населения, приводит к сравнительно ранней инвалидизации пациентов. Данное заболевание сокращает среднюю продолжительность жизни мужчин на 6,5, а женщин - на 13,5 лет. Экономические затраты, связанные с бронхиальной астмой, оценивают выше таковых при туберкулезе и ВИЧ/СПИДе вместе взятых [44, 144, 234].
Среди бронхолегночной патологии бронхиальная астма представляет серьезную проблему для практикующего врача. С одной стороны наблюдаемый рост заболеваемости бронхиальной астмой [44], а с другой стороны лечение бронхиальной астмы, которое всегда служило основой врачебного пессимизма, основанного на неясности некоторых звеньев патогенеза этой болезни.
В настоящее время установлено, что возникновение и развитие бронхиальной астмы сопровождается активацией свободнорадикальных процессов в легких [5, 28, 29, 53, 55, 61, 79, 108, 134]. Из-за высокой реакционной способности свободные радикалы могут модифицировать белки, липиды, нуклеиновые кислоты [28, 30, 31, 112, 128], что приводит к резкому нарушению функции органов и тканей. Помимо этого активные метаболиты кислорода в силу высокой токсичности сами по себе могут участвовать в первичных про-
цессах запуска бронхиальной астмы [27]. Известно, что активация фагоцитирующих клеток, в том числе альвеолярных макрофагов, приводит к развитию «дыхательного взрыва» [69, 180, 219]. Избыточная продукция активных форм кислорода способствует развитию оксидативного стресса, который сопровождается, как бронхоспастическим синдромом, так и хронизацией воспалительных процессов в легких [34, 51, 68, 77, 116, 123, 130].
В последнее время большое внимание уделяется изучению роли активных форм кислорода в процессах метаболизма белков. Любое влияние активных форм кислорода на белки различного характера приводит к сложным окислительным модификациям в структуре белковой молекулы и ее физико-химических и биологических свойств [6, 20, 40, 53, 59, 85, 112]. Нарушение структуры клеточных мембран и изменение функциональной активности рецепторного аппарата за счет свободнорадикального окисления связано, в первую очередь, с окислительной деструкцией белков. Учитывая большую и очень разнообразную функциональную нагрузку белков в тканях, их окислительная модификация также может носить избирательный и специфический характер при различных патологических состояниях [57]. Таким образом, гидроперекиси белков играют роль одного из патогенетических звеньев при ряде патологических состояний организма, и являются одними из наиболее ранних и стабильных маркеров оксидативного стресса [58, 179, 183]. Однако в литературе практически отсутствуют сведения о возможной роли свобод-норадикальной модификации белков в биохимических механизмах становления и прогрессирования бронхиальной астмы.
Согласно современной концепции, бронхиальная астма это заболевание, в основе которого лежит хроническое воспаление дыхательных путей [44, 144, 145]. Исходя из этого, в настоящее время как для долгосрочного лечения бронхиальной астмы, так и для купирования обострений болезни, чаще всего используются глюкокортикостероиды [80, 104]. Объем лекарственной терапии, если это необходимо для достижения контроля над данным заболеванием, может увеличиваться, или уменьшаться, если контроль достигнут
7 (ступенчатый подход) [44, 73, 74, 147]. Однако, несмотря на достижения современной фармакотерапии, по данным литературных источников, стандартная лекарственная терапия при бронхиальной астме не оказывает выраженного влияния на систему свободнорадикальное окисление — антиоксидантная защита, дисбаланс которой является одним из ключевых звеньев поддержания патогенеза бронхиальной астмы [5, 28, 29, 53, 55, 61, 79, 108, 134]. Причины подобной ситуации многообразны, и не последнюю роль в этом играет недостаточная осведомленность врача в патогенезе бронхиальной астмы [73].
Таким образом, сама жизнь диктует необходимость переосмысления подходов в лечении бронхиальной астмы и рационального использования всего лучшего, что есть на сегодняшний день.
Цель исследования
Повышение эффективности лечения обострения бронхиальной астмы с использованием антиоксидантов и энтеросорбентов на основе изучения показателей оксидантно-антиоксидантного статуса.
Задачи исследования:
Изучить уровень продуктов свободнорадикального окисления белков и липидов крови у больных с обострением бронхиальной астмы.
Изучить частоту и характер нарушений перекисного метаболизма белков и липидов у больных с обострением бронхиальной астмы в зависимости от степени тяжести, пола, возраста и длительности заболевания.
Оценить эффективность медикаментозной коррекции оксидативного стресса у больных с обострением бронхиальной астмы на основе изучения продуктов перекисного окисления белков и липидов в плазме крови.
Провести сравнительный анализ антирадикального действия различных антиоксидантных препаратов и энтеросорбента Энтеросгеля в составе комбинированной терапии обострения бронхиальной астмы на основе изучения показателей оксидантно-антиоксидантного статуса.
5. Провести сравнительный анализ клинической эффективности различных антиоксидантных препаратов и энтеросорбента «Энтеросгеля» в составе комбинированной терапии обострения бронхиальной астмы на основе изучения показателей функции внешнего дыхания и сатурации кислорода.
Научная новизна
Впервые комплексно изучено состояние системы свободнорадикальное окисление - антиоксидантная защита у больных с обострением бронхиальной астмы смешанного генеза, на основе спектрофотометрического исследования продуктов окислительной модификации белков (карбонильные группы), пе-рекисного окисления липидов (ТБК-активные продукты) и активности ключевого фермента антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза) в плазме крови. Дана оценка состояния системы свободнорадикальное окисление - антиоксидантная защита у больных с обострением бронхиальной астмы смешанного генеза, в зависимости от степени тяжести, пола, возраста и длительности заболевания. Проведен сравнительный анализ эффективности различных видов медикаментозной коррекции оксидативного стресса на фоне стандартной базисной терапии обострения бронхиальной астмы смешанного генеза.
Практическая значимость
Комплексное исследование показателей свободнорадикального окисления белков и липидов, а также активности ферментативного звена антиоксидантной системы организма у больных с обострением бронхиальной астмы позволяют осуществлять раннюю диагностику оксидативного поражения тканей. Это позволяет своевременно проводить курс специфической медикаментозной коррекции дисбаланса в системе свободнорадикальное окисление — антиоксидантная защита.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. У больных с обострением бронхиальной астмы имеет место дисбаланс в системе свободнорадикальное окисление — антиоксидантная защита, характеризующийся снижением активности антиоксидантной системы орга-
низма и накоплением продуктов свободнорадикального окисления белков и
липидов.
Для оценки дисбаланса в системе свободнорадикальное окисление -антиоксидантная защита у больных с обострением бронхиальной астмы целесообразно исследование продуктов окислительной модификации белков, перекисного окисления липидов и активности ферментативного звена антиоксидантной системы. Что позволит проводить своевременную коррекцию выявленных нарушений.
Частота и характер нарушений в системе СРО-АОЗ у больных с обострением бронхиальной астмы находятся в прямой зависимости от тяжести заболевания. При бронхиальной астме тяжелой степени имеет место статистически значимое (W>1,96) угнетение антиоксидантной системы организма с накоплением в крови продуктов свободнорадикального окисления белков и липидов. Показатели системы СРО-АОЗ имеют статистически значимые (W>1,96) различия при бронхиальной астме средней и тяжелой степени.
Стандартная базисная терапия обострения бронхиальной астмы не приводит к нормализации показателей оксидантно-антиоксидантного статуса.
Проведение различных видов медикаментозной коррекции оксида-тивного стресса на фоне стандартной базисной терапии обострения бронхиальной астмы является патогенетически обоснованным и эффективным.
Апробация
Основные положения диссертации доложены и обсуждены:
на VII Астраханской межрегиональной научно-практической конференции «Лекарство и здоровье человека», посвященной 450-летию Астрахани и 90-летию АГМА, Астрахань, 2008 г.
на научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины», посвященной 90-летию АГМА, Астрахань, 2008 г.
на XVIII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Екатеринбург, 2008 г.
10 на Всероссийской научной конференции РАЕ, Москва, 2009 г.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в учебно-методический процесс на кафедрах фармакологии и медицинской реабилитации ФПО ГОУ ВПО АГМА Росздрава, используются в лечебно-профилактической работе терапевтических отделений МУЗ Городской клинической больницы № 2 и №4 г. Астрахани.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 - в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Роль окислительной модификации белков в функциональной актив-ности клеток
Еще 10 лет назад объектом окисления активных форм кислорода считались исключительно липиды мембран или плазмы, а нарушение структуры белковой молекулы рассматривалось как следствие повреждения окружающих ее липидов [29]. KJ.A. Davies (1987) и соавт. [181, 182, 186, 196, 197, 223] в ходе своих исследований убедительно показали, что АФК наряду с липидами повреждают и белки, а их окислительная модификация ведет к изменению структуры белковых молекул и, соответственно, их физико-химических и биологических свойств [46, 183]. Как подтверждают исследования последних лет (R.L. Levine, 2001; Е.Е. Дубинина, 2006), влияние АФК может распространяться, в том числе на белковые компоненты ферментов, рецепторов, ионных каналов плазматических мембран, определяющих возможность нормального функционирования различных клеток и тканей в целостном организме [58, 196, 212]. R.T. Dean (1987) с соавт. показали, что в состоянии оксидативного стресса атаке АФК подвергаются не липиды, а, в первую очередь, белки плазматических мембран [168, 169]. По мнению авторов, любое влияние АФК на белки различного характера приводит к сложным окислительным модификациям в структуре белковой молекулы и изменению ее физико-химических и биологических свойств [168]. Подтверждением первичности перекисного окисления белков является наличие выраженных изменений при оксидативном стрессе в области ануляр ных липидов (связанных с интегральными белками) [12, 213], что говорит о ведущей роли свободнорадикальной модификации белков в деструкции клеточной мембраны.
В работах Т. Miayata (1998) и др., при инкубации арахидоновой кислоты с окислительно модифицированным белком in vitro наблюдалось образование малонового диальдегида (МДА) [183], что характеризует модифицированный белок в качестве потенциального стимулятора перекисного окисления липидов [137]. В условиях оксидативного стресса происходит интенсификация процессов окислительной модификации белков (ОМБ). Свободные радикалы повреждают белки по всей длине полипептидной цепи, нарушая не только вторичную, и третичную, но и первичную структуру белков [106, 156]. При оксидативном стрессе, в зависимости от интенсивности процессов генерации АФК, окислительной модификации подвергаются фактически все аминокислоты, что сопровождается агрегацией или фрагментацией белковой молекулы [56].. По мнению E.R. Stadtman (2000) модификация белков в результате сво-боднорадикального окисления меняет их антигенные свойства, делает их более чувствительными к эндогенному протеолизу. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, пепсин, катепсин D, субтилопептидаза А) быстрее расщепляют окисленные белки, чем нативные [223]. Образовавшийся пул поврежденных белков активирует протеолиз, что способствует дальнейшему усилению деструктивных процессов в очаге воспаления. KJ.A. Davies и R.T. Dean in vitro показали, что продукты СРО белков опосредуют окислительные повреждения ДНК [169, 173]. Перекисное окисление белков также приводит к снижению функции белков в цепи переносчиков электронов, избирательности действия транспортных пор. Следовательно, окисленные протеины являются не только «свидетелями», но и активными участниками свободнорадикального повреждения клетки [56, 106, 196, 212]. Окислительная модификация белков является одним из ранних индикаторов поражения тканей при свободнорадикальной патологии [56].
При окислении белков в них образуются альдегидные и кетоновые группы аминокислотных остатков (карбонильные группы), повышенный уровень которых может являться ранним и чувствительным маркером свободнорадикального повреждения, так как белки плазмы, подвергшиеся окислительной деструкции, имеют довольно большой период полураспада [209, 223]. Это нашло подтверждение в целом ряде исследований, показавших, что продукты ОМБ при оксидативном стрессе появляются в тканях раньше и они более стабильны, чем продукты ПОЛ (малоновый диальдегид, диеновые конъ-югаты, шиффовы основания) [58, 222, 224, 225, 226]. При всех достоинствах методов определения продуктов пероксидации липидов показано, что уже через несколько минут продукты ПОЛ подвергаются детоксикации, в отличие от них окисленные белки могут находиться в клетках часами и даже днями [58, 196]. Все вышеперечисленное позволяет рассматривать, изменение уровня окислительно модифицированных белков и их продуктов (карбонильных групп) в качестве наиболее стабильных и перспективных маркеров, отражающих интенсивность свободнорадикальных процессов и оксидативного стресса при ряде патологических состояний или при воздействии неблагоприятных внешних факторов [58].
Коррекция нарушений свободнорадикального окисления белков и липидов, как одна из составляющих комбинированной терапии больных бронхиальной астмой
Проблема патологии, связанная с усилением процессов свободнорадикального окисления в организме, остается одной из актуальных в теоретической и практической медицине. Нарушение баланса в системе СРО-АОЗ значительно отягощает течение любого заболевания. Усиление интенсивности процессов СРО, при патологии, сопровождающейся оксидативным стрессом, дик тует необходимость поиска путей диетологической и фармакологической коррекции нарушений указанного баланса. В настоящее время термин «антиоксиданты» (АО) широко используется в медицинской литературе. По определению В. Halliwell и J.M.C. Gutteridge: «Антиоксидант - любая субстанция, которая, присутствуя (в среде) в низкой концентрации, сравнимой с концентрацией способного окисляться субстрата, достоверно снижает или предотвращает окисление этого субстрата» [186]. К сожалению, в настоящее время, единой классификации АО не существует. Один из принципов деления АО основан на растворимости веществ в водной и липидной фазе (гидрофильные АО - аскорбиновая кислота, мочевая кислота, цистеин; и липофильные АО - токоферолы, ретинол, билирубин) [8, 30]. Другой способ деления основан на группировании АО по воздействию на конкретные мишени (АФК, нерадикальные инициаторы СРО, промежуточные радикальные продукты СРО и т.д.) [8, 62] и соответствует классификации АО по их химической структуре (фенольные АО, тиолы, каротиноиды, гидроксаматы и т.д.) [216]. Фактически, все вещества, проявляющие антиоксидантное действие могут быть разделены на: АО прямого (направленного) действия и АО косвенного (опосредованного) действия [62, 64]. АО косвенного действия способны снижать интенсивность СРО только в биологических объектах (от клеточных органелл до целого организма), но неэффективны in vitro. Механизмы их действия могут быть различны: активация (реактивация) антиоксидантных ферментов; подавление в организме реакций, приводящих к образованию АФК; сдвиг реакций СРО в сторону образования менее реакционноспособных соединений; селективная индукция генов, кодирующих белки систем антиоксидантной защиты и репарации повреждений; нормализация обмена веществ и т.д. [62, 64, 204].
Кроме того, препараты, не относящиеся к антиоксидантам, также могут снижать интенсивность процессов СРО и степень оксидативного повреждения. При патологии практически во всех случаях интенсивность СРО повышена [29, 58, 65, 216]. Нормализация обменных процессов в организме приводит к снижению продукции АФК и уровня СРО. Таким образом, любое вещество, нормализующее метаболические процессы в организме, способно на уровне организма проявить «антиоксидант-ный» эффект [64]. АО прямого действия, наоборот, обладают непосредственными антирадикальными свойствами, которые можно обнаружить в тестах in vitro. Большую часть широко используемых лекарственных препаратов антиоксидантного действия составляют АО прямого действия [160, 187, 216]. По данным В.Г. Зайцева и О.В. Островского АО прямого действия можно сгруппировать в пять основных категорий: 1) доноры протона; 2) полиены; 3) катализаторы, 4) ловушки радикалов; 5) комплексообразователи [68]. АО, способствующие снижению интенсивности СРО путем активации компонентов АОС, будут относиться к препаратам косвенного действия [62, 64, 216]. При разработке стратегии лечения больных с любой патологией, протекающей на фоне оксидативного стресса, необходимо включать препараты, проявляющие антиоксидантную активность и способствующие повышению буферной емкости АОС организма. Терапия антиоксидантами способствует выравниванию соотношения свободные радикалы - антиоксидантные ферменты.
Механизм действия антиоксидантов основан на прерывании цепных процессов свободнорадикального окисления. Вещества этой группы имеют подвижный атом водорода и поэтому реагируют со свободными радикалами, а также катализаторами свободнорадикального окисления и, прежде всего, с ионами металлов переменной валентности. В результате взаимодействия антиоксиданта с радикальной молекулой образуются малоактивные радикалы антиоксидантов, которые легко выводятся из организма [2, 24, 33, 70, 126]. Коррекция нарушений в функционировании АОС организма с помощью препаратов антиоксидантного типа действия является одним из наиболее пер спективных направлений, направленных на нормализацию клеточного метаболизма и восстановление функциональной активности клеток [26, 33, 60, 84, 91, 126, 127, 135, 152, 159, 160]. В клинике одними из наиболее часто применяемых естественных антиок-сидантов являются токоферол (витамин Е), аскорбиновая кислота (витамин С) и ретинол (витамин А). Однако, в некоторых исследованиях последних лет, была показана недостаточная эффективность обычно применяемых антиоксидантов при заболеваниях, в которых дисбаланс между интенсивностью СРО и статусом АОС играет существенную патогенетическую роль [62, 83].
Витамин Е, являясь природным антиоксидантом, содержащим фенольное кольцо с системой сопряженных двойных связей, защищает различные вещества от окислительных изменений. Механизм его антиоксидантного действия заключается в переносе водорода фенильной группы на перекисный радикал. В тоже время, поданным некоторых источников [62, 174, 238], суммарный анти-оксидантный эффект витамина Е не слишком выражен, так как в процессе нейтрализации свободных радикалов данным веществом образуются соединения с остаточной радикальной активностью, которые сами по себе обладают достаточной реакционной способностью, обуславливая прооксидантные свойства а-токоферола [62, 107]. Совместно с витамином Е в организме действует и аскорбиновая кислота, способная образовывать окислительно-восстановительную пару аскорбиновая кислота/дегидроаскорбиновая кислота. Она обеспечивает защиту токоферола или восстанавливает его окисленную форму после атаки свободных радикалов. Однако, весьма важным обстоятельством является то, что аскорбиновая кислота проявляет выраженный антиоксидантный эффект только в отсутствии металлов переменной валентности (ионов железа и меди). В присутствии активной формы железа (Fe3+), она может восстанавливать его до двухвалентного железа (Fe2+), которое способно высвобождать гидроксильный радикал по реакции Фентона, проявляя свойства прооксиданта [25, 62, 107, 174, 238, 239].
Определение продуктов перекисного окисления липидов
В качестве основного показателя, позволяющего судить об интенсивности перекисного окисления липидов, использовали определение уровня малонового диальдегида - одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов, определяемого в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [92]. Поскольку, кроме МДА, ряд низкомолекулярных соединений (сахара, сиаловые кислоты, некоторые аминокислоты) могут также образовывать окрашенные комплексы с ТБК, то в конечном результате реакция определяет сумму ТБК-активных продуктов [29]. ТБК-активные продукты плазмы крови определяли на основе метода, предложенного К. Jagi (1968) в модификации М. Uchiyama и М. Mihara (1980) [237]. Кровь для определения уровня ТБК-активных продуктов забирали по общепринятой методике в утренние часы из локтевой вены в охлажденные силиконизированные пробирки объемом 5 мл. Свежесобранные образцы немедленно помещались на лед. Плазма выделялась путем центрифугирования со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут в первые 2 часа после забора крови и помещалась в силиконовые пробирки. Забор материала проводили дважды при поступлении в стационар и при выписке. В исследовании использовали коммерческие диагностические наборы, предназначенные для количественного определения содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке или плазме крови в клинико-диагностических и биохимических лабораториях «ТБК-Агат» (Биоконт) Москва, РФ. Принцип метода основан на том, что при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагаются с образованием МДА, молекула которого взаимодействует с 2 молекулами, тиобарбитуровой кислоты с образованием окрашенного триметинового комплекса, экстрагируемого бутанолом [45]. Для приготовление рабочего раствора ТБК во флакон с тиобарбитуровой кислотой добавляли 31 мл дистиллированной воды и растворяли при нагревании до 60С в течении 10-15 мин (выпадение осадка после охлаждения не влияет на качество анализа).
Перед использованием раствор ТБК нагревали до комнатной температуры. Для определения уровня ТБК-активных продуктов к 0,25 мл плазмы крови добавляли реактивы по следующей схеме 3 мл 1,4% раствора орто-фосфорной кислоты и 1 мл рабочего раствора ТБК. Пробирки накрывали конденсирующими колпачками и помещали в водяную баню на 45 мин при 100 С. После кипячения пробирки охлаждали в холодной воде 3-5 мин. После охлаждения проб цветной комплекс в течение 2 мин экстрагировали в мл n-бутанола. Пробирки интенсивно встряхивали до образования однородной белой суспензии, имеющий розовый оттенок. Затем пробирки центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин (1800 g). Сразу после центрифугирования отбирали 3 мл супернатанта в чистую пробирку и измеряли оптическую плотность опытной пробы против холостой пробы, где плазма была заменена 0,25 мл дистиллированной воды. Определение оптической плотности окрашенного бутанолового экстракта проводили на биохимическом автоматическом анализаторе «HumaStar 80» (Германия) при длине волны 535 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, не позднее 1,5 ч после центрифугирования [237]. Расчет содержания ТБК-активных продуктов производили по формуле: С = (D535 - D570) х 16/0,156 где: С - содержание ТБК-активных продуктов в опытной пробе мкмоль/л; D535 - оптическая плотность опытной пробы при 535 нм; D570 -оптическая плотность холостой пробы при 570 нм; 0,156 - коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид - ТБК в л/мкмоль/см; 16 - коэффициент разведения плазмы. Уровень продуктов перекисного окисления липидов выражали в микромолях на 1 л плазмы крови. Для определения активности супероксиддисмутазы в материале трудно использовать методы, основанные на прямом определении концентрации супероксидных радикалов, поэтому в работе использовался косвенный метод определении активности супероксиддисмутазы, позволяющий учитывать концентрацию веществ индикаторов (в данном случае I.N.T. - 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitro phenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride), преобразуемых супероксидом [29, 92]. Кровь для определения активности супероксиддисмутазы забирали по общепринятой методике в утренние часы из локтевой вены в охлажденные силиконизированные пробирки объемом 5 мл.
Свежесобранные образцы немедленно помещались на лед. Плазма выделялась путем центрифугирования со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут в первые 2 часа после забора крови и помещалась в силиконовые пробирки. Забор материала проводили дважды при поступлении в стационар и при выписке. В исследовании использовали коммерческий диагностический набор, предназначенный для определения активности СОД плазме крови — SOD kit «Randox Laboratories LTD.», Ardmore, United Kingdom. Определение активности супероксиддисмутазы проводилось на основании способности фермента подавлять реакцию восстановления I.N.T. супероксидным анион радикалом, генерированным in vitro в системе ксантин — ксантиноксидаза [49]. .N.T. под действием супероксид-радикала образует формазан, который имеет достаточно стабильную голубовато-зеленую окраску. Ингибирование образования окраски пропорционально активности супероксиддисмутазы. Оптическую плотность регистрировали на биохимическом автоматическом анализаторе «HumaStar 80» (Германия) при длине волны 600 нм. Выражали активность СОД в удельных единицах активности на 1 мл плазмы крови. За единицу активности СОД принимали то количество, которое способно подавить реакцию восстановления I.N.T. на 50 %. Статистическая обработка данных проводилась при помощи набора параметров описательной статистики, реализованного в пакете программы SPSS 13.
Зависимость показателей системы свободнорадикальное окисление антиоксидантная защита у больных бронхиальной астмой от различных факторов
Нами была предпринята попытка проанализировать состояние оксидант-но-антиоксидантного статуса у больных бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести, длительности заболевания, пола, возраста пациентов и наличия вредных привычек (курение). Состояние перекисного окисления белков и липидов у больных с обострением бронхиальной астмы смешанного генеза в зависимости от степени тяжести отражены в таблице 6. При сопоставлении показателей системы СРО-АОС больных бронхиальной астмой разной степени тяжести с показателями в группе соматически здоровых лиц, с 95% вероятностью различия определены для: уровня карбонильных производных у пациентов со средней (W=4,5975) и тяжелой (W=3,2577) степенью БА, уровня ТБК-активных продуктов у пациентов со средней (W=3,5205) и тяжелой (W=3,6108) степенью БА и активности основного фермента АОЗ - супероксиддисмутазы у пациентов со средней (W=4,8038) и тяжелой (W=4,0356) степенью Б А. При анализе показателей полученных в группе пациентов с тяжелой степенью БА смешанного генеза были выявлены статистически значимые различия (W 1,96) по сравнению с показателями у больных бронхиальной астмой средней степени тяжести, так активность СОД у пациентов с тяжелой степенью БА составила - 7,49±1,00 у.е./мл, против - 11,45±0,97 у.е./мл у пациентов со средней степенью тяжести (W=2,3883), что указывает на более выраженное истощение ферментативного звена антиоксидантной системы организма в зависимости от тяжести бронхиальной астмы. Уровень карбонильных производных также статистически значимо (W=2,2188) преобладал у пациентов с тяжелой степенью БА и составил -6,66±0,05 ед.опт.пл./мл, против 6,14±0,08 ед.опт.пл./мл у пациентов со средней-степенью БА. По уровню ТБК-активных продуктов мы не получили статистически значимых различий в зависимости от степени тяжести бронхиальной астмы (W=l,1619). Поиск корреляционных взаимосвязей между степенью тяжести бронхиальной астмы и показателями системы СРО-АОЗ у больных БА выявил умеренную обратную зависимость s=-0,5274 (р=0,006) между степенью тяжести и показателем активности СОД в плазме крови у больных бронхиальной астмой, что указывает на истощение ферментативного звена антиоксидантной защиты организма у больных БА с нарастанием степени тяжести.
Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшие изменения в зависимости от степени тяжести БА претерпевают такие показатели, как: уровень окислительной модификации белков (карбонильные производные) и показатель активности основного фермента АОС организма — супероксиддисмутазы в плазме крови больных бронхиальной астмой. Из 107 обследованных пациентов, получавших стационарное лечение по поводу обострения бронхиальной астмы смешанного генеза, мужчин было 51 (47,7%) человек, женщин - 56 (52,3%). Мы провели сравнительный анализ показателей системы СРО-АОЗ у больных бронхиальной астмой смешанного генеза, с целью определить насколько различия по половому признаку влияют на изучаемые показатели. Усредненный показатель интенсивности окислительной модификации белков (уровень карбонильных производных) у лиц мужского пола составил -6,46±0,08 ед.опт.пл./мл, а у лиц женского пола - 6,53±0,05 ед.опт.пл./мл. Уровень ТБК-активных продуктов в плазме крови у мужчин составил 5,82±0,90 мкмоль/л, против 5,52±0,42 мкмоль/л у женщин. Активность основного фермента антиоксидантной системы организма (супероксиддисмутазы) у мужчин составила 10,05±1,67 у.е./мл, против 11,18±0,74 у.е./мл у женщин. Наиболее наглядно зависимость показателей системы СРО-АОЗ от пола показана графически на рисунке 2. При анализе показателей, представленных на гистограмме 2, у больных с обострением бронхиальной астмы смешанной этиологии статистически значимых отличий (W 1,96) в зависимости от пола найдено не было, что указывает на однородность показателей по данному признаку (рис. 8).
Возраст обследованных пациентов с Б А смешанного генеза колебался от 21 до 59 лет (средний возраст 42,13±1,43 года). Для оценки влияния возраста на уровень КП, ТБК-АП и активность СОД у больных с обострением бронхиальной астмой смешанного генеза пациенты были разделены на 2 подгруппы (табл. 7): лица молодого возраста (до 40 лет) — 65 человек, и среднего возраста (от 40 до 60 лет) - 42 человека. Лица пожилого возраста (старше 60 лет) были исключены из исследования для того, чтобы нивелировать влияние возраста на изучаемые показатели. Так как, согласно свободно-радикальной теории старения D. Harman, в процессе старения происходит нарастание молекулярных повреждений клеточных мембран и генетического аппарата клетки активными формами кислорода и ослабление функций АОС организма. Причиной этого является интенсивная генерация АФК в тканях в результате увеличения дефектов в АОЗ, направленной против образования реакционноспособных радикальных соединений, что приводит к накоплению их в тканях и повреждению белков, липидов, ДНК, углеводов.
А это, в свою очередь влечет за собой гибель клеток [40, 58, 85]. Как видно из таблицы 7 статистически значимых различий" (W 1,96) в зависимости от возраста пациентов с бронхиальной астмой по показателям ОБМ, ПОЛ и активности АОЗ выявлено не было. Далее нами была проведена оценка изменения показателей свободнорадикального окисления белков, липидов и активности АОС организма в зависимости от длительности заболевания. Длительность заболевания бронхиальной астмой в исследуемой группе пациентов варьировала от 5 до 22 лет. Средняя длительность заболевания составила 16,47±2,39 лет. Все пациенты в зависимости от длительности заболевания бронхиальной астмой смешанного генеза были поделены на 3 группы: 1 группа - пациенты с длительностью заболевания менее 10 лет (38 человек); 2 группа - пациенты с длительностью заболевания от 10 до 20 лет (42 человека); 3 группа - пациенты с длительностью заболевания более 20 лет (27 человек).
Уровень ТБК-активных продуктов в плазме крови у пациентов, страдающих бронхиальной астмой менее 10 лет, составил - 5,74±0,54 мкмоль/л, у пациентов с длительностью заболевания от 10 до 20 лет - 5,9б±0,60 мкмоль/л,
Похожие диссертации на Медикаментозная коррекция нарушений свободнорадикального окисления белков и липидов у больных бронхиальной астмой
![Фармакологическая коррекция нарушений энергетического обмена в печени при экспериментальной патологии [B]-окисления жирных кислот](/i/i/4397/408076.png "Фармакологическая коррекция нарушений энергетического обмена в печени при экспериментальной патологии [B]-окисления жирных кислот Тимофеев Максим Сергеевич")
