Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов 16
1.2. Активные формы кислорода и их роль 21
1.3. Свободнорадикальные процессы при патологических состояниях и роль антиоксидантной системы 31
1.4. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов 38
1.5. Краткая характеристика изучаемых соединений 50
2. Материал, объем и методы исследования
2.1. Методы исследования 63
2.1.1. Метод исследования суммарной антиокислительной активности сыворотки крови (АОА) 63
2.1.2. Метод определения активности каталазы в эритроцитах крови 64
2.1.3. Метод определения пероксидазы в эритроцитах крови... 64
2.1.4. Метод определения содержания церулоплазмина в сыворотке крови 65
2.1.5. Метод определения содержания глутатиона в крови и органах 65
2.1.6. Методы исследования содержания молекулярных продуктов перекисного окисления липидов 66
2.1.6.1. Метод определения уровня диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот в сыворотке крови и в гомогенатах органов 66
2.1.6.2.Метод определения уровня ТБК-взаимодействующих продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови и в гомогенатах органов 67
2.1.7. Метод определения нитрит-иона в сыворотке крови... 68
2.1.8. Биохимические методы исследования, характеризующие развитие патологического процесса 68
2.2. Экспериментальные модели, используемые для изучения процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, а также эффективности изучаемых соединений 70
2.2.1. Экспериментальная модель хронического аутоиммунного воспаления лап крыс, вызванного введением адъюванта Фрейнда (адъювантный артрит) 70
2.2.2. Экспериментальная модель язвенного повреждения желудка крыс, вызванная введением нестероидного противовоспалительного средства - индометацина 71
2.2.3. Экспериментальная модель острого токсического поражения печени, вызванная введением нитрата свинца.. 72
2.2.4. Экспериментальная модель патологии печени, вызванная введением четыреххлористого углерода 73
2.2.5. Экспериментальная модель остеопороза, вызванная длительным введением преднизолона 74
2.2.6. Экспериментальная модель введения преднизолона в режиме "пульс-терапии" 75
Материал и объем исследований 76
3. Результаты собственных исследований
3.1. Исследование процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при хроническом аутоиммунном воспалении лап крыс, вызванном адъювантом Фрейнда 83
3.1.1. Влияние димефосфона, ксидифона, ксимедона и ионола на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при хроническом аутоиммунном воспалении лап крыс, вызванном адъювантом Фрейнда 89
3.1.2. Влияние димефосфона, ксидифона, ксимедона и ионола на процессы перекисного окисления липидов в ткани печени, почек и селезенки при хроническом аутоиммунном воспалении лап крыс, вызванном адъювантом Фрейнда 102
3.2. Исследование процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при язвенном поражении желудка крыс, вызванном введением нестероидного противовоспалительного средства - индометацина... 112
3.2.1. Влияние димефосфона, ксидифона и ионола на процессы перекисного окисления липидов в ткани желудка крыс при индометацин-индуцированной гастропатии 114
3.2.2. Влияние димефосфона, ксидифона и ионола на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в сыворотке крови животных при язвенном поражении желудка крыс, вызванном введением нестероидного противовоспалительного средства -индометацина 117
3.2.3. Влияние димефосфона, ксидифона, ксимедона и ионола на процессы перекисного окисления липидов в ткани печени, почек и селезенки животных при язвенном поражении желудка крыс, вызванном введением нестероидного противовоспалительного средства - индометацина 122
3.3. Исследование процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при токсическом поражении печени, вызванном нитратом свинца 127
3.3.1. Состояние процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при токсическом поражении печени, вызванном нитратом свинца 131
3.3.2. Состояние процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в гомогенатах печени, почек крыс при токсическом поражении печени, вызванном нитратом свинца 134
3.3.3. Влияние димефосфона, ксидифона и ксимедона на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при токсическом поражении печени, вызванном введением нитрата свинца 137
3.4. Исследование процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы крыс при токсическом поражении печени, вызванном введением четыреххлористого углерода 142
3.4.1. Влияние димефосфона на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при токсическом поражении печени, вызванном введением четыреххлористого углерода 143
3.4.2. Влияние димефосфона на процессы перекисного окисления липидов в ткани печени, почек и селезенки крыс при однократном введении четыреххлористого углерода 149
3.5. Исследование процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы крыс на модели остеопороза, вызванного длительным введением преднизолона 154
3.5.1. Влияние димефосфона (монофосфоната) на стероидный остеопороз в сравнении с ксидифоном (бисфосфонатом) 155
3.5.2. Влияние димефосфона и ксидифона на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс на модели стероидного остеопороза, вызванного длительным введением преднизолона 163
3.5.3. Влияние димефосфона и ксидифона на процессы перекисного окисления липидов в ткани печени крыс на модели стероидного остеопороза, вызванного длительным введением преднизолона 169
3.6. Профилактический эффект димефосфона и ксидифона на модели «пульс-терапии» преднизолоном 174
3.6.1. Влияние профилактического применения димефосфона и ксидифона на показатели минерального обмена у крыс на модели «пульс-терапии» преднизолоном 175
3.6.2. Влияние профилактического применения димефосфона и ксидифона на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс на модели «пульс-терапии» преднизолоном 180
3.6.3. Влияние профилактического применения димефосфона и ксидифона на процессы перекисного окисления липидов в ткани печени, почек крыс на модели «пульс-терапии» преднизолоном 183
3.7. Лечебный эффект димефосфона и ксидифона на модели «пульс-терапии» преднизолоном 186
3.7.1. Влияние лечебного применения димефосфона и ксидифона на показатели минерального обмена у крыс на модели «пульс-терапии» преднизолоном 188
3.7.2. Влияние лечебного применения димефосфона и ксидифона на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс на модели «пульс-терапии» преднизолоном 192
3.7.3. Влияние лечебного применения димефосфона и ксидифона на процессы перекисного окисления липидов в ткани печени, почек и селезенки крыс на модели «пульс-терапии» преднизолоном 196
Обсуждение 202
Выводы 281
Практические рекомендации 283
Библиографический список использованной
Литературы 284
- Свободнорадикальные процессы при патологических состояниях и роль антиоксидантной системы
- Биохимические методы исследования, характеризующие развитие патологического процесса
- Влияние димефосфона, ксидифона, ксимедона и ионола на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при хроническом аутоиммунном воспалении лап крыс, вызванном адъювантом Фрейнда
- Влияние димефосфона на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при токсическом поражении печени, вызванном введением четыреххлористого углерода
Введение к работе
Проблема свободнорадикальной патологии, важнейшей характеристикой которой является накопление токсических продуктов перекисного окисления липидов, имеет исключительно важное научное и практическое значение. Радикальные окислительные процессы являются значительным патогенетическим фактором многих заболеваний и патологических состояний (Болдырев А.А. и др. 1996,2001, Ю.А. Владимиров и др., 1991, 1993, 1998, 2002; К.Н.Зенков и др.1996, 1999, 2001; B.Halliwell et. al.,1987, Codet J.L. et. al.,1998, Katz L.M. et. al.,1998). Все клетки живого организма обладают способностью к генерации активных форм кислорода, и поэтому развитие окислительного стресса возможно в любых органах и тканях. В нормальных условиях жизнедеятельности при функционировании живых систем в условиях физиологического оптимума существует про- и антиоксидантное равновесие, которое является важнейшим механизмом окислительного гомеостаза. Любое повреждение структур живой системы сопровождается нарушением этого равновесия в сторону развития окислительного стресса. Однако антиоксидантные системы ограничивают развитие радикальных окислительных процессов, удерживая про- и антиоксидантное равновесие в пределах нормальной реакции. Лишь исчерпание буферной мощности защитных систем при тяжелых и продолжительных напряжениях, когда расход антиоксидантов превышает их биосинтез, приводит к окислительной деструкции биомембран, клеток, тканей, что ведет к более или менее серьезной патологии (Аксенов В.В. и др., 2002, Алексеева Н.Н., 1991, Башарина О.В., 1995, Бобырев В.Ф. и др., 1994, Волчегорский И.А., 1997, Ковальский Ю.Г. и др., 2002 и др.).
Одним из важных аспектов изучения патогенеза различных заболеваний является исследование состояния перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы. Нарушение стационарного состояния свободнорадикального окисления считается одним из универсальных, неспецифических показателей наличия повреждения и характерно для самых
10 различных заболеваний: атеросклероз, стресс, неврозы, сахарный диабет,
воспалительные процессы, аутоиммунные заболевания и др. (Владимиров
Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Ахмедов Д.Р.,1994; Азизова О.А. и др., 1996;
Биленко М.В., 1982; Борисова И.Г.,1990; Владимиров Ю.А, 1998; Зенков Н.К.,
1999, 2001, 2002, Владимиров В.Г и др., 2002; Ковальский Ю.Г., 2002;
Макарова М.Н. и др. 2002). Коррекция нарушений (свободнорадикального)
перекисного окисления липидов может предотвратить развитие
патологического процесса или облегчить его течение. Именно поэтому
понимание характера изменений процессов пероксидации под влиянием
лекарственного средства может являться одним из показателей, который
определяет выбор препарата для лечения той или иной патологии.
Актуальность работы. Изучение процессов перекисного окисления липидов является отправной точкой для решения вопроса о целесообразности применения антиоксидантов в комплексе медикаментозной терапии при заболеваниях различного генеза. До настоящего времени не существует единого мнения о целесообразности применения антиоксидантов в клинической практике при различных патологических состояниях, сопровождающихся активацией процессов пероксидации, что определяет актуальность настоящего систематического исследования. Актуальность проблемы продиктована также, прежде всего, необходимостью разработки принципов фармакологической коррекции нарушений перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы с помощью новых отечественных лекарственных препаратов, обладающих низкой токсичностью.
В настоящее время имеются сообщения, что новые отечественные оригинальные лекарственные средства димефосфон, ксимедон могут изменять интенсивность перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной системы организма (Хафизьянова Р.Х., 1988, 1993; Зиганшина Л.Е., Студенцова И.А., 1988, 1992; Гараев Р.С., Кудашкин С.С., 1997; Киньябулатов А.У., Студенцова И.А., 1999 и др.). В связи с этим возникла
необходимость проведения сравнительного изучения влияния этих лекарственных средств на интенсивность процессов переписного окисления липидов и антиоксидантнои системы при различных патологических состояниях, а также расшифровки интимных механизмов их действия. Работа представляется актуальной и имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение.
Цель исследования
Цель настоящей работы — изучить специфику изменений перекисного окисления липидов и антиоксидантнои системы при различной экспериментальной патологии и механизмы фармакологической коррекции этих изменений отечественными лекарственными средствами.
Задачи исследования
Изучить специфику изменений перекисного окисления липидов и антиоксидантнои системы в крови и органах (печень, почки, желудок и селезенка) крыс при моделировании различных патологических состояний ксенобиотиками: индометацин-индуцированные язвенно-эрозивные повреждения желудка, токсическое поражение печени нитратом свинца и четыреххлористым углеродом, преднизолон-индуцированный остеопороз и адъювантный артрит.
Исследовать влияние димефосфона (монофосфоната) на состояние перекисного окисления липидов, антиоксидантнои системы крови и внутренних органов крыс при моделировании патологических состояний в сравнении с ксидифоном (бисфосфонатом) и с эталонным синтетическим антиоксидантом ионолом.
Проанализировать степень анти - и прооксидантной активности и выяснить закономерности изменений перекисного окисления липидов при введении изучаемых фармакологических препаратов в зависимости от характера патологического состояния.
4. Выявить изменения в содержании нитрит-иона в крови крыс при
моделировании адъювантного артрита, токсического повреждения печени четыреххлористым углеродом на интактных животных и на фоне действия фармакологических препаратов.
5. Оценить влияние пиримидинового производного ксимедона на процессы
перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы крови и
внутренних органов при моделировании патологических состояний.
Научная новизна
Впервые при моделировании патологических состояний путем введения различных ксенобиотиков (индометацин-индуцированные язвенно-эрозивные повреждения желудка, токсическое поражение печени нитратом свинца и четыреххлористым углеродом, преднизолон-индуцированныи остеопороз и адъювантный артрит, вызванный адъювантом Фрейнда) выявлены конкретные звенья в нарушении перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови, печени, почках, ткани желудка и селезенке экспериментальных животных.
Установлена закономерность накопления первичных продуктов перекисного окисления липидов - диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот в органах и тканях с максимальным содержанием в крови при повреждающем воздействии ксенобиотиков. Выявлена органотропность накопления ТБК-взаимодействующих продуктов перекисного окисления липидов: наибольшее содержание их обнаружено в тканях желудка при индометацин-индуцированном язвенно-эрозивном повреждении желудка, в печени - при токсическом поражении нитратом свинца и преднизолон-индуцированном остеопорозе, в почках - при токсическом поражении четыреххлористым углеродом, в селезенке - при адъювантном артрите.
Существенно дополнены и систематизированы сведения об антиоксидантной активности димефосфона при моделировании различных патологических состояний. Антиоксидантная активность димефосфона
13 сопоставима с таковой эталонного антиоксидантного лекарственного средства
ионола.
Впервые установлена способность димефосфона повышать содержание нитрит-иона в сыворотке крови крыс при моделировании адъювантного артрита и токсическом поражении четыреххлористым углеродом.
Установлена закономерная связь изменений показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) под влиянием пиримидинового производного ксимедона, выражающаяся в снижении содержания продуктов ПОЛ и повышении активности ферментов АОС.
Практическая значимость работы
Результаты исследования могут служить теоретической и методологической основой для поиска корректоров нарушений процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при различных патологических состояниях, в том числе индуцированных ксенобиотиками.
Полученные результаты могут служить обоснованием для клинических исследований димефосфона и ксимедона в качестве средств фармакологической коррекции нарушений перекисного окисления липидов и антиоксидантной защитной системы организма при различных патологических состояниях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Общим свойством изученных ксенобиотиков (нитрат свинца,
четыреххлористыи углерод, индометацин, преднизолон и адъювант Фрейнда) при моделировании различных патологических состояний является повышение интенсивности перекисного окисления липидов, выражающееся в накоплении диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот в крови экспериментальных животных. Изменение показателей состояния антиоксидантной системы в этих условиях эксперимента специфично для каждого ксенобиотика.
2. Димефосфон является универсальным антиоксидантом с
преимущественным подавляющим влиянием на образование продуктов
перекисного окисления липидов в крови и повышающим действием на
активность каталазы, пероксидазы эритроцитов и на содержание
церулоплазмина в сыворотке крови. Особенностью димефосфона является
способность повышать содержание нитрит-иона в сыворотке крови.
Антиоксидантные эффекты димефосфона сопоставимы с действием эталонного антиоксиданта ионола.
3. Ксимедон так же как димефосфон в эквимолярных дозах корригирует
нарушения, вызываемые ксенобиотиками: снижает содержание диеновых
конъюгатов и ТБК-взаимодействующих продуктов в крови, гомогенатах
печени, почек и селезенки крыс, повышает содержание церулоплазмина в
сыворотке крови и восстановленного глутатиона в печени. На модели
токсического повреждения печени нитратом свинца ксимедон снижает
содержание продуктов ПОЛ и повышает активность каталазы и общую
антиокислительную активность в крови.
Внедрение результатов исследования
Результаты полученных исследований излагаются в лекционном курсе
на кафедрах фармакологии и клинической фармакологии, эндокринологии Казанской государственной медицинской академии и на кафедре фармакологии Казанского государственного медицинского университета.
Написано методическое руководство «Биохимические методы
исследования общих механизмов повреждения и воздействия ксенобиотиков», Казань, 1998.- 34с.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийских конференциях и симпозиумах: на IV, V,VIII Национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1997, 1998, 2001, 2002); 1-ой
15 Всероссийской конференции «Клинические и патогенетические проблемы
нарушений клеточной энергетики» (Москва, 1999); «Клинические исследования лекарственных средств в России» (Москва, 2001); Республиканской научно-практической конференции «Фармакология и токсикология ФОС и других биологически активных веществ» (Казань, 1996); научно-практических конференциях КГМА (Казань, 2000, 2001, 2002); III Всероссийском съезде эндокринологов (Москва, 1996); XX Скандинавском конгрессе по физиологии и фармакологии (Копенгаген, 1992); XIV Международном конгрессе по химии фосфора (Цинцинати, США 1998); XIV Европийском конгрессе по ревматизму (Эдинбург, 1999); материалах Американского общества клинических фармакологов и терапевтов (Атланта, 2002).
Публикации по теме диссертации: Основной материал диссертационной работы опубликован в 29 научных трудах, в том числе в центральной печати - 14.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 7 глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, который состоит из 413 отечественных и 214 иностранных источников. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 71 таблицами.
Диссертация выполнена в рамках блока научных проблем по направлению 7.07 «Фундаментальные и прикладные проблемы создания лекарственных средств» государственной научно-технической программы «Борьба с наиболее распространенными болезнями».
Свободнорадикальные процессы при патологических состояниях и роль антиоксидантной системы
Проявление жизнедеятельности клеток связано с процессами, протекающими на биомембранах. Основными компонентами мембран являются липиды и белки, минорными компонентами — гликопротеины и гликолипиды. Из липидов в состав мембран входят фосфоглицериды, сфинголипиды, холестерин и в небольших количествах три - и диацилглицериды, а также свободные жирные кислоты. Белки и липиды в мембранах расположены ассиметрично и находятся в постоянном движении. Одно из основных свойств липидных бислоев — текучесть - обусловливает работу ферментов, ионных каналов и избирательную проницаемость для ионов и гидрофильных молекул [3].
Одним из механизмов обновления липидных компонентов клеточных мембран является перекисное окисление липидов (ПОЛ). Центральным звеном является реакция образования свободного липидного радикала L, который взаимодействует с молекулами Ог с образованием радикала липоперекиси ЬОг. Радикал липоперекиси ЬОг атакует одну из соседних молекул фосфолипидов мембран (преимущественно ненасыщенными липидами) с образованием гидроперекиси липидов LOOH, диалкилперекисей LOOL , пероксикислот LCOOOH, пероксиэфиров LCOOOL и новых липидных радикалов [184,275]. В результате в процесс вовлекаются все новые и новые молекулы фосфолипидов и кислорода: при этом образуются гидроперекиси липидов, а число свободных радикалов (L+LO2) остается неизменным. Более устойчивыми, чем перекиси, соединениями развития радикальных процессов ПОЛ являются так называемые конечные (вторичные) продукты: спирты, альдегиды, кетоны, лактоны, предельные углеводороды и др. [184].
В живых клетках млекопитающих существует две системы ПОЛ. Одна из систем - это НАДФ - зависимое ферментативное ПОЛ, для работы которой требуется присутствие НАДФН, пирофосфата, железа. Другая аскорбатзависимое неферментное ПОЛ, для работы этой системы необходимы аскорбат и ионы Fe2+ [71].
Перекисное окисление липидов является физиологическим процессом, необходимым для устранения поврежденных структур, так как целостность организма поддерживается за счет равновесия между притоком вновь синтезированных молекул и элиминацией окислительно поврежденных белков и липидов [31,71,358]. ПОЛ в биомембранах регулируется рядом веществ, ингибирующих или активирующих этот процесс: ионами Fe2+, восстановителями типа глутатиона, цистеина и аскорбиновой кислоты, комплексообразователями, изменяющими активность ионов в реакциях, агентами, восстанавливающими гидроперекиси (глутатионпероксидаза), кислородом и ингибиторами свободнорадикального окисления (истинные антиоксиданты). Антиоксиданты сдерживают развитие окислительных реакций и предупреждают повреждение клеток кислородными радикалами и перекисью водорода, переводя их в неактивные формы [399,403,412]. Умеренная активация ПОЛ оказывает положительное действие на энергетический баланс клетки - усиливает каталитическую активность внутриклеточных ферментов, ускоряя гликолиз и активируя окисление глюкозы в «пентозо-фосфатном шунте» [36]. Перекиси липидов используются организмом для синтеза простагландинов, лейкотриенов и стероидных гомонов, регулируют проницаемость клеточных мембран, участвуют в регуляции адреналовой системы, сперматогенезе [129,192,310]. Чрезмерное усиление процессов ПОЛ вызывает активацию системы антиоксидантной защиты (АОЗ). Но при длительно текущих воспалительных процессах происходит истощение системы АОЗ и усиление процессов ПОЛ. Продукты ПОЛ способствуют возникновению в организме целого ряда негативных биохимических и физиологических изменений, вызывают «сшивку» и полимеризацию белковых молекул, нарушение иммунного статуса организма, повышение тонуса кровеносных сосудов и снижение объемной скорости кровотока [76,175,264]. Продукты ПОЛ способствуют увеличению матричной активности хроматина, приводят к изменению вторичной структуры ДНК [551], нарушению барьерных свойств, увеличению проницаемости и вязкости, а также изменению свойств поверхности липидного слоя мембран и в итоге к нарушению функции клеток [71,73,76,77,78,81].
Процессы ПОЛ играют важную роль не только в нормальной физиологии клетки, но и выступают как ранние ключевые звенья патогенеза многих распространенных заболеваний [78,234,242,243,246,247,248,263,265,266, 274,318,437,456,479,521,596,606,623]. Избыточное накопление перекисных продуктов является патогенетическим признаком многих заболеваний. Стрессовые ситуации активируют ПОЛ, что сопровождается образованием токсических продуктов и приводит к нарушениям в рецепторном аппарате клеток [222,378]. Интенсивное ПОЛ сопряжено с накоплением продуктов метаболизма, к числу которых относятся продукты деградации белков. В настоящее время появляется все больше данных о том, что окисление белков (транспортных и ферментов мембран) также служит существенным моментом этого процесса. Экспериментальные данные, полученные Красовской И.Е и др. [192], позволяют заключить, что мишенью действия активных форм кислорода могут быть как липидные, так и белковые компоненты мембран; причем белки, по-видимому, повреждаются в первую очередь. Окисление липидов, сопряженных с мембраносвязанными белками, усугубляет повреждающее действие окислительного стресса на функцию мембран. Одной из основных причин необратимых метаболических нарушений при остром стрессе является чрезмерная активация процессов ПОЛ, сопряженная с тканевой гипоксией [21,192].
Биохимические методы исследования, характеризующие развитие патологического процесса
Кроме вышеперечисленных показателей при моделировании повреждения печени нитратом свинца и четыреххлористым углеродом, определяли активность аланин-и аспартат трансфераз в сыворотке крови и в гомогенатах органов по общепринятой методике, используя наборы для определения АсАТ и АлАТ [38,240].
При моделировании остеопороза, длительным введением преднизолона и в режиме «пульс-терапии» содержание общего кальция в крови и моче определяли колориметрическим методом с о-крезолфталеиновым раствором стандартного набора фирмы Nova Holding International, Inc., США [607]. Количественное определение неорганического фосфата в крови и моче осуществляли колориметрическим методом (без депротеинизации) по реакции с молибдатом аммония с помощью стандартного набора фирмы Nova Holding International, Inc., США [181]. Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови определяли с применением стандартного набора фирмы «Лахема» (тест Щелочная фосфатаза 120 (ALP2x60) № 1300250 [235]. Активность тартратрезистентной кислой фосфатазы в сыворотке крови определяли колориметрическим методом с использованием в качестве субстрата альфа-нафтилфосфата стандартного набора фирмы «Лахема» [240]. Количественное определение свободного оксипролина в моче осуществляли с использованием хлорамина Т и парадиметиламинобензальдегида; для определения белковосвязанной фракции проводили 4 часовой гидролиз в 6N хлорной кислоте при температуре 100 С. Оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 538нм. Содержание оксипролина рассчитывали по калибровочной кривой на стандартный раствор оксипролина и выражали мкг/л [287]. Содержание общего белка в сыворотке крови определяли колориметрически с использованием стандартного набора фирмы «Olvex diagnosticum», Россия. Белковые фракции- методом электрофореза на бумаге. Содержание кальция в костях крыс определяли методом атомно абсорбционной спектрофотометрии (AAS) в лаборатории спектрофотометрического анализа Республиканского Центра охраны семьи, материнства и детства МЗ РТ совместно с Валиевым B.C. Метод основан на измерении величины поглощения резонансной линии определенного элемента при прохождении света через облако паров (свободных атомов) данного элемента согласно закону Ламберта-Бугера-Бера [322]. Подготовку образцов ткани проводили методом «сухого озоления»: навеску пробы сжигали в муфельной печи в фарфоровом тигле при температуре 450 С в течение 8-10 часов. Золу растворяли в 25 мл 1 N азотной кислоты и отфильтровывали через беззольный фильтр «синяя лента». Раствор анализировали на приборе СА10МП. Кальций определяли в стехиометрическом воздушно-ацетиленовом пламени при длине волны 422,7 нм с пределом обнаружения 0,0026 мкг/мл. В качестве стандартов использовались различные разведения стандартных образцов ГСОРМ-1 и ГОСРМ-2 [322].
Для гистологического исследования использовали первый поясничный позвонок крыс. Позвонок фиксировали в 10% формалине в течение 24 часов, декальцинировали в 10% растворе азотной кислоты, промывали в проточной воде, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Микротомом делали поперечный срез толщиной 4-6 ц. и окрашивали гематоксилин-эозином. Анализ микроструктуры проводили при консультации профессора кафедры патологической анатомии КГМУ Цыплакова Д.Э. Определяли относительную плотность трабекул в губчатой костной ткани позвонка, соотношение в трабекулах хрящевой и костной ткани и общую клеточность костной ткани. Подсчет вели в 50 произвольно выбранных полях зрения с помощью сетки Автандилова [4].
Экспериментальные модели, используемые для изучения процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, а также эффективности изучаемых содинений
По методу Тринуса Ф.П и др., 1987 [363] воспроизводили модель хронического аутоимунного воспаления лап на беспородных белых крысах обоего пола массой 180-200 г. Животные были разделены на 5 групп, по 20 крыс в каждой. Крысы первой группы были интактными. У животных следующих 4 опытных групп воспроизводили адъювантный артрит путем подкожного введения в подушечку левой задней лапы адъюванта Фрейнда по 0,1 мл. (адъювант содержал 10 мг сухой убитой вакцины БЦЖ в 1 мл смеси 1 части ланолина, 2 части вазелинового масла. Доза вводимой вакцины составляла 5 мг БЦЖ на 1 кг массы тела) [363]. Животным второй (контрольной) группы вводили ежедневно внутрижелудочно с помощью зонда физиологический раствор по 1 мл/100г. Крысам третьей группы, с момента введения адъюванта, в том же объеме вводили внутрижелудочно с помощью зонда димефосфон - 208 мг/кг в дозе, соответствующей 1мМ/кг массы тела животного в сутки: [626]. В качестве препаратов сравнения вводили ежедневно внутрижелудочно с помощью зонда ксидифон - бисфосфонат (этиндронат) в дозе 45 мг/кг [10], антиоксидант ионол (дибунол) 220 мг/кг. До начала эксперимента и в течение 40 дней с интервалом 4-5 суток, оценивали динамику массы тела и интенсивность первичного артрита по степени прироста объема лап, а вторичного артрита - по изменению объема контралатеральной лапы крыс на этих же сроках исследования. Величину отека лапы определяли плетизмометром Ugo Basile по разности объемов лап до введения адъюванта Фрейнда и на 3, 7, И, 15, 20, 27, 31, 38, 40 сутки после его введения. Показатели процессов ПОЛ и АОС в крови определяли на 15 и 41 сутки эксперимента. На 41 сутки животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Интенсивность воспаления суставов оценивали по увеличению объема голеностопных суставов задних, передних лап и хвоста. Степень отека лап выражали в % прироста их объема по сравнению с исходными показателями. Данный фрагмент работы был проведен совместно с ассистентом кафедры клинической фармакологии КГМА В.Н.Хазиахметовой.
Влияние димефосфона, ксидифона, ксимедона и ионола на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при хроническом аутоиммунном воспалении лап крыс, вызванном адъювантом Фрейнда
Показатели содержания диеновых конъюгатов, ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ в крови крыс, а также активность ферментов антиоксидантной защиты и состояние окислительно-восстановительной системы глутатиона крови на модели адъювантного артрита, после введения ксидифона в дозе 45 мг/кг внутрижелудочно в течение 15 дней, относительно контроля достоверно не изменились (табл. 3.1.1.1; 3.1.1.2; 3.1.1.3).
Введение ксимедона в дозе 168 мг/кг в течение 15-й дней на модели хронического аутоиммунного воспаления не вызывал достоверно значимых изменений содержания диеновых конъюгатов, ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов крови по сравнению с показателями крыс контрольной группы (табл.3.1.1.1, 3.1.1.2). При изучении показателей окислительно-восстановительной системы глутатиона крови крыс было показано, что введение ксимедона способствовало нормализации сниженного после введения адъюванта содержания суммарного глутатиона крови, повышая его уровень на 34% от контроля и окисленного глутатиона на 41% (табл. 3.1.1.3).
На модели адъювантного артрита 15-ти дневное введение эталонного антиоксиданта ионола в дозе 220 мг/кг в желудок сопровождалось снижением до исходного уровня содержания ТБК - взаимодействующих продуктов на 50% (Р 0,05) и диеновых конъюгатов в сыворотке крови на 20% (Р 0,05). Отмечалась тенденция к снижению активности пероксидазы эритроцитов крови на 39% (Р=0,05) от контроля - модели (табл. 3.1.1.1; 3.1.1.2; 3.1.1.3). Ионол на модели адъювантного артрита не влиял на показатели окислительно-восстановительной системы глутатиона и активности каталазы эритроцитов крови крыс; общей антиокислительной активности и содержания церулоплазмина сыворотки крови крыс (табл. 3.1.1.1; 3.1.1.2; 3.1.1.3).
Таким образом, на модели хронического аутоиммунного воспаления, вызванной введением адъюванта Фрейнда, на 15 день после его инъекции наблюдали увеличение содержания как первичных — диеновых конъюгатов ненасыщенных высших жирных кислот, так и вторичных — ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ в сыворотке крови. Это сопровождалось изменением глутатионового буфера крови: снижение содержания суммарного глутатиона за счет уменьшения его окисленной формы. При этом общая антиокислительная активность сыворотки, активность каталазы эритроцитов крови и содержания церулоплазмина в сыворотке крови не изменились, была выявлена тенденция к повышению активности пероксидазы крови крыс. Введение в желудок димефосфона, ксидифона в течение 15-ти дней на модели хронического аутоиммунного воспаления существенно не изменяло повышенный уровень молекулярных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов, ТБК-взаимодействующих продуктов. Только ионол нормализовал их уровень. Состояние антиоксидантной системы крови при введении исследуемых соединений на модели адъювантного артрита не изменилось: показатели активности каталазы эритроцитов крови, церулоплазмина, АОА сыворотки не отличались от контрольных показателей модели.
Развитие хронического аутоиммунного воспаления - адъювантного артрита Фрейнда, сопровождалось дальнейшим повышением уровня содержания диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот в сыворотке крови крыс и на 41 сутки после его инъекции было выше на 160 % (Р 0,05) от исходных показателей. Содержание вторичных продуктов процессов перекисного окисления липидов - ТБК-взаимодействующих соединений оставалось также на высоком уровне и было выше на 100% (Р 0,01) показателей животных интактнои группы (табл.3.1.1.4). Высокое содержание продуктов ПОЛ привело к снижению общей антиоксидантной активности сыворотки на 22% (Р 0,05) и уменьшению содержания сывороточного антиоксиданта церулоплазмина на 11% (Р 0,05) относительно показателей крыс интактнои группы, не влияя на активность каталазы и пероксидазы эритроцитов крови (табл.3.1.1.5.). Введение димефосфона в течение 40 суток на модели адъювантного артрита сопровождалось снижением уровня в крови продуктов перекисного окисления липидов: ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ на 25% (Р 0,05) и диеновых конъюгатов ненасыщенных высших жирных кислот на 46% (Р 0,05) по сравнению с показателями крыс контрольной группы модели (табл. 3.1.1.4). Сниженное моделью общая антиокислительная активность сыворотки после введения димефосфона повышалась на 30 % (Р 0,05) (табл. 3.1.1.5). На модели адъювантного артрита димефосфон не влиял на показатели окислительно-восстановительной системы глутатиона крови (табл. 3.1.1.6). Введение в желудок ксидифона в дозе 45 мг/кг в течение 40 суток при развитии аутоиммунного воспаления, вызванного адъювантом Фрейнда, сопровождалось увеличением в крови уровня продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови: ТБК-взаимодействующих соединений на 200% (Р 0,01), диеновых конъюгатов на 125% (Р 0,05), по сравнению с показателями крыс интактной группы. Эти показатели по сравнению с модельным контролем были недостоверными (табл.3.1.1.4). Повышалась активность пероксидазы на 21% (Р 0,05) от уровня животных интактной группы. Ксидифон снижал общую антиокислительную активность сыворотки крови на 30% (Р 0,05) относительно интактных, не вызывал достоверно значимых изменений активности каталазы эритроцитов и показателей окислительно-восстановительной системы глутатиона крови крыс (табл.3.1.1.4; 3.1.1.5; 3.1.1.6).
По истечении 40 суток с момента инъекции адъюванта Фрейнда и введения ксимедона в дозе 169 мг/кг в желудок изучение показало, что ксимедон вызывает снижение содержания диеновых конъюгатов в крови на 61% (Р 0,05), доводя его до исходного уровня. Препарат тормозил образование ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ на 50% (Р 0,05) от исходных показателей и уменьшал на 25% (Р 0,05) относительно контроля. Это сопровождалось повышением общей антиоксидантной активности сыворотки на 21% (Р 0,05) и содержания церулоплазмина на 19% (Р 0,05) от уровня животных контрольной группы. Ксимедон достоверно не влиял на измененное моделью содержание суммарного и окисленного глутатиона, а его восстановленную форму снижал на 5% (Р 0,05) от контроля (табл.3.1.2.4 -3.1.2.6).
Влияние димефосфона на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови крыс при токсическом поражении печени, вызванном введением четыреххлористого углерода
Профилактический недельный курс введения димефосфона до инъекции ССЦ сопровождался повышением содержания нитрит-иона в сыворотке крови на 38% (Р 0,05) относительно показателей животных интактной группы и на 44% (Р 0,05) от уровня модельного контроля (табл.3.4.1.4).
При введении димефосфона в течение 7 дней с лечебной целью на модели повреждения ССЦ наблюдали увеличение содержания нитрит-иона в сыворотке крови на 26% (Р 0,05) относительно показателей животных контрольной (ССЦ) группы.Таким образом, однократное введение четыреххлористого углерода в дозе 0,1 мл / 100 г массы крысы (внутрибрюшинно) повышает содержание как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ.
Введение димефосфона в дозе 208 мг/кг внутрижелудочно в течение одной недели до или после однократной инъекции четыреххлористого углерода в одинаковой степени снижало содержание ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ в сыворотке крови крыс, и эти показатели были в 1,9 раза ниже от контроля (ССЦ) и в 1,33 раза меньше от уровня крыс интактной группы. Профилактическое введение димефосфона уменьшало содержание вторичных продуктов ПОЛ, повышало АОС - активность пероксидазы и церулоплазмина, следовательно, этот факт можно рассматривать как повышение димефосфоном компенсаторных реакций организма, направленных против повреждающего воздействия продуктов ПОЛ на биологические мембраны. Лечение димефосфоном острого токсического повреждения печени ССІ4 также снижало повышенное содержание вторичных продуктов ПОЛ. Лечебно-профилактическое введение препарата повышало содержание нитрит- иона в сыворотке крови крыс.
Авторы работы [209] считают, что функциональное состояние энзимов антиоксидантной защиты адекватно отражает особенности развития патологического процесса у больных с хроническим поражением печени и эффективность медикаментозного лечения у них связана с воздействием на эндогенные механизмы регуляции свободнорадикальных процессов -активности СОД и системы глутатиона.
Результаты экспериментов по изучению влияния четыреххлористого углерода на количество молекулярных продуктов ПОЛ в гомогенатах печени крыс позволили выявить, что подкожное введение ССЦ в дозе 0,1 мл/100 г 150 массы тела животных увеличивало содержание диеновых конъюгатов на 74% (Р 0,05), а ТБК-взаимодействующих продуктов — на 225% (Р 0,05) от исходных показателей (табл.3.4.2.1). При этом недельный курс введения димефосфона с профилактической целью до инъекции ССЦ снижал образование в ткани печени диеновых конъюгатов на 11% (Р 0,05), а ТБК-взаимодействующих продуктов - на 32% (Р 0,05) от контроля-модели. Введение димефосфона в дозе 208 мг/кг внутрижелудочно в течение 7-ми дней после инъекции ССЦ с лечебной целью также снижало повышенный уровень в гомогенатах печени диеновых конъюгатов на 11% (Р 0,05), а ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ - на 67% (Р 0,05), что соответствовало уровню показателей крыс интактной группы (табл.3.4.2.1). Таким образом, результаты исследований состояний ПОЛ в гомогенатах печени крыс показали, что однократное внутрибрюшинное введение ССЦ в 151 дозе 100 мкмоль/100 г массы тела животных повышает интенсивность перекисного окисления липидов, увеличивая содержание как первичных, так и вторичных молекулярных продуктов ПОЛ. Димефосфон проявляет антиоксидантный эффект - снижает повышенное моделью содержание диеновых конъюгатов и ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ в ткан печени крыс. Результаты исследований показателей ПОЛ в гомогенатах почек на модели острого поражения печени четыреххлористым углеродом свидетельствуют о повышении интенсивности перекисного окисления (табл.3.4.2.2). Однократное введение ССЦ вызывало увеличение содержания в гомогенатах почек диеновых конъюгатов на 76% (Р 0,05), а ТБК-взаимодействующих продуктов - на 246 % (Р 0,05) от показателей крыс интактной группы. При этом недельный курс введения димефосфона с профилактической целью до инъекции ССЦ антиоксидантный эффект не проявил — показатели содержания диеновых конъюгатов в гомогенатах почек были в 1,28 раз, а ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ в 1,21 раза выше, чем таковые контрольной группы (табл.3.4.2.2). Введение димефосфона после инъекции ССЦ с лечебной целью достоверно значимо не влияло на повышенный уровень диеновых конъюгатов, эти показатели были в 1,9 раз выше, чем у животных интактной группы. Димефосфон снижал уровень ТБК взаимодействующих продуктов в гомогенатах почек на 16% (Р 0,05) от контроля, хотя эти показатели были в 2,9 раз выше, чем у животных интактной группы (табл.3.4.2.2). Таким образом, однократное введение крысам подкожно четыреххлористого углерода в дозе 100мкл/100 г массы тела вызывает повышение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гомогенатах почек крыс. Недельный курс введения димефосфона в дозе 208 мг/кг внутрижелудочно с лечебной целью, после инъекции четыреххлористого углерода, снижает повышенное моделью содержание вторичных продуктов — ТБК-взаимодействующих соединений ПОЛ в гомогенатах почек крыс.
Результаты исследований содержания продуктов ПОЛ в гомогенате селезенки на модели острого поражения печени, вызванного однократным введением четыреххлористого углерода, показали, что введение CCL» достоверно не влияло на содержание диеновых конъюгатов и ТБК-взаимодействующих продуктов ПОЛ (табл.3.4.2.3).
![Фармакологическая коррекция нарушений энергетического обмена в печени при экспериментальной патологии [B]-окисления жирных кислот](/i/i/4397/408076.png "Фармакологическая коррекция нарушений энергетического обмена в печени при экспериментальной патологии [B]-окисления жирных кислот Тимофеев Максим Сергеевич")
