Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Структура и метаболизм уридина и уридиновых пуклеотидов (УМФ, УДФ, УТФ) в организме млекопитающих 13
1.2. Рецепторный механизм действия УТФ и УДФ 17
1.3.Фармакологические эффекты уридина и уридиновых пуклеотидов (УМФ, УДФ и УТФ) 18
1.4. Метаболизм уридина и его пуклеотидов в миокардиалыюй ткани 19
1.4.1. Включение экзогенного уридина в сердце при пормоксии и ишемии в опытах in vitro и in vivo 21
1.5. Энергетический метаболизм миокарда в условиях пормоксии и ишемии 23
1.5.1. Реперфузионное повреждение миокарда 29
1.5.2. Постишемическая дисфункция миокарда (миокардиальный станшшг) 29
1.5.3. Постишемическне и реперфузионные аритмии .36
1.6. Механизмы повышения устойчивости миокарда к ишемии 40
1.6.1. Ишемическая адаптация миокарда (прекопдиционнрование) 40
1.6.2. Структурная организация и регуляция АТФ-зависимых калиевых каналов (цитоплазматического и митохондриального) 42
1.6.3. Основное физиологическое значение МИТОКДТФ каналов 45
1 6.4. Роль цитоплазматического и митохондриалыюго КАТФ каналов в обеспечении устойчивости к пшоксии 47
1.6.5. Эндогенные биологически активные вещества активаторы МИТОКДТФ каналов 49
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1.Животные 52
2.2. Вещества 52
2.3. Изучение острой,токсичности и широты терапевтического действия уридина, УМФ, УДФ, УТФ 53
2.4. Оценка кардиоваскулярных эффектов уридина и его пуклеотидов у иптактпых крыс 53
2.5. Острая регионарная и тотальная ишемия сердца крыс (in vitro) 53
2.5.1. Получение препаратов изолированного перфузируемого сердца 53
2.5.2. Модель регионарной ишемии 54
2.5.3. Модель тотальной ишемии 54
2.5.4.0пределение параметров сократительной функции сердца 55
2.5.5. Определение нарушений сердечного ритма 55
2.6. Экспериментальный инфаркт миокарда 56
2.6.1. Моделирование острого инфаркта миокарда 56
2.6.2. Оценка антиишемического действия уридина и его пуклеотидов 57
2.6.2.1. Определение амплитуды Т-волны на ЭКГ 57
2.6.2.2. Определение объема повреждения миокарда 57
2.6.2.3. Определение нарушений сердечного ритма 58
2.6.3. Оценка энергетического обмена в миокарде 58
2.6.3.1. Определение содержания молочной кислоты 58
2.6.3.2. Определение содержания нировиноградной кислоты 59
2.6.3.3. Определение содержания креатинфосфата (КФ) 60
2.6.3.4. Определение содержания гликогена - 61
2.7. Модель энергозависимого набухания митохондрий 62
2.7.1. Выделение митохондрий сердца крысы 62
2.7.2. Определение энергозависимого входа калия в изолированные митохондрии 63
2.8. Модель бислойной липидной мембраны (БЛМ), реконструированной митохондриальным АТФ зависимым каналом 64
2.8.1. Выделение митохондрий печени крысы 64
2.8.2. Выделение митопластов из митохондрий печени крысы 64
2.8.3. Выделение и очистка К -транспортирующсго белка 64
2.8.4. Реконструирование -транспортирующего белка в БЛМ 65
2.9. Статистическая обработка результатов 66
Глава 3. Результаты исследований 67
3.1. Кардиоваскулярные эффекты уридина, УМФ, УДФ и УТФ у интактных животных 67
3.1.1. Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ на сердечный ритм 67
3.1.2. Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ па среднее артериальное давление 69
3.2. Действие уридина и уридшювых пуклеотидов на сократительную способность изолированных нерфузируемых сердец крыс при регионарной ишемии 71
3.3. Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ па сократительную функцию левого желудочка и коронарный ток при реперфузии изрлированного сердца крысы после тотальной ишемии 77
3.4. Действие уридина и уридшювых пуклеотидов па нарушения сердечного ритма в экспериментах in vitro 82
3.4.1. Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ на развитие ранних постокклюзионных аритмий 82
3.4.2. Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ на развитие ренерфузионных аритмий 84
3.5.Кардиопротекторное действие уридина и его пуклеотидов в остром периоде экспериментального инфаркта миокарда у крыс 88
3.5.1. Антиишемический эффект уридина, УМФ, УДФ и УТФ 88
3.5.2. Антиаритмический эффект уридина, УМФ, УДФ и УТФ 91
3.6. Влияние уридина и его нуклеотидов на активность митохондри ального АТФ-зависимого К канала изолированных митохондрий кардиомиоцитов и активность каналообразующей субъединицы митохондриального АТФ-зависимого К канала в модельной системе 95
3.7. Зависимость кардиопротекторных эффектов уридина и УМФ от активности АТФ-зависимых К каналов у крыс с острым инфарктом миокарда 100
3.7.1. Влияние ингибиторов АТФ-зависимых К каналов на антиишемическую активность уридина и УМФ 100
3.7.2. Влияние ингибиторов АТФ-зависимых К каналов на антиаритмическую активность уридина иУМФ 104
3.8. Влияние УМФ и УТФ на энергетический обмен в миокарде 109
3.8.1. Определение биохимических показателей в ткани сердца 109
3.9. Изучение острой токсичности и широты терапевтического действия уридина, УМФ, УДФ и УТФ 113
Обсуждение результатов 115
Список литературы 129
- Структура и метаболизм уридина и уридиновых пуклеотидов (УМФ, УДФ, УТФ) в организме млекопитающих
- Эндогенные биологически активные вещества активаторы МИТОКДТФ каналов
- Действие уридина и уридшювых пуклеотидов на сократительную способность изолированных нерфузируемых сердец крыс при регионарной ишемии
- Определение биохимических показателей в ткани сердца
Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным Всемирной Организации Здравоохранения около половины всех причин человеческих смертей в высокоразвитых странах и почти 60% в России приходится на болезни системы кровообращения, среди которых первое место занимает острая ишемия миокарда (Захаров, 2001) При данном патологическом состоянии лекарственная терапия направлена прежде всего на повышение выживаемости миокарда и ограничение зоны инфаркта, снижение нагрузки на сердце и ус гранение нарушений сердечного ритма Наряду с применением традиционных фармпрепаратов, которые улучшают коронарное кровоснабжение и максимально снижают потребность кардиомиоцитов в кислороде и энергетических субстратах, большое внимание уделяется метаболической защите миокарда Исследование возможностей лечебного применения природных метаболитов, являющихся естественными факторами адаптации миокарда к патологическим воздействиям, определяется возрастающим интересом к использованию в кардиофармакологии эндогенных регуляторов (Галенко-Ярошевский, Гацура, 2001) К числу таких соединений можно отнести нуклеозиды и нуклеотиды, которые обладают большим набором регуляторных функций, реализующихся на рецепторном уровне, при регуляции метаболических процессов и пластического обмена В настоящее время хорошо изучены кардиотропные свойства таких представителей этого класса соединений, как аденозин, аденозин-монофосфат, аденозин-трифосфат, гуанозин-монофосфат, инозин, а созданные на их основе лекарственные препараты используются в клинике (Николаева и др , 1975, Stanley et al, 1997, Lopaschuc, 1998)
Потенциальными средствами профилактики и терапии инфаркта миокарда, а также постишемического реперфузионного повреждения сердца могут выступать пиримидиновый нуклеозид уридин и его фосфонуклеотиды уридин-5'-монофосфат (УМФ), уридин-5'-дифосфат (УДФ) и уридин-5'-трифосфат (УТФ) В экспериментальных и клинических исследованиях была установлена высокая терапевтическая активность уридина и его нуклеотидов при центральной и периферической нейропатиях, дисфункции печени, нарушении репродуктивной функции, при врожденной оротоацидурии и цистическом фиброзе (Connolly, Duley, 1999) В то же время фармакологическая активность этих соединений в отношении сердечнососудистой системы остается малоизученной
Известно, что в условиях ишемии уридин усиливает липидный и углеводный обмен в миокарде, предотвращая гибель кардиомиоцитов, а также восстанавливает функциональную активность мышечных волокон (Зайчик, Чуринов, 2000) Имеются данные о том, что уридин и его нуклеотиды поддерживают энергетический метаболизм миокарда, особенно в условиях дефицита кислорода (Aussedat et al, 1984) Уридиновые нуклеотиды участвуют в синтезе РНК и биомембран, что является важным элементом в регуляции как нормального физиологического, так и патологического состояний (Connolly,
1 - - I
і. »
Duley, 1999) В последнее время возрос интерес к УДФ и УТФ, являющимися агонистами пиримидиновых P2U - рецепторов (Abracchio, Burnstock, 1998, Kugelgen, Wetter, 2000, Yitzhaki et al, 2005) Этот тип рецепторов был обнаружен в кардиомиоцитах (Yitzhaki et al, 2005), эндотелии и гладкомышечных клетках кровеносных сосудов (Webb et al ,1996, Kugelgen, Wetter, 2000) Активация пиримидиновых рецепторов капилляров и других кровеносных сосудов приводит к улучшению кровотока в кардиоваскулярной системе (Froldi et al, 1994, Зиганшин и др , 1998, 1999) УТФ и УДФ, находясь во внеклеточном пространстве, могут играть роль универсальных модуляторов (Anderson, Parkinson, 1997)
Большое значение в защите миокарда от ишемического и постишемического повреждения придается ишемической адаптации (прекондиции) Конечным эффектором в реализации ее кардиопротективных влияний выступают АТФ-зависимые калиевые каналы (КАТф каналы) (Gross, Fryer, 1999) Принципиально новым в лечении и предупреждении сердечных заболеваний является развиваемый в последнее время подход, связанный с активацией этих каналов (Garlid et al, 1997, Liu et al, 1998, Fryer et a! , 2000, Маслов и др , 2002) Имеется предположение, что нуклеотид уридина УДФ играет роль эндогенного регулятора АТФ-зависимых К каналов (Mnonova et al, 1999)
Способность уридина проникать внутрь клетки и включаться в различные метаболические пути, наличие у его нуклеотидов рецепторного механизма действия, а также предположение о возможности активации с помощью уридиновых соединений внутриклеточных процессов адаптации к ишемии делают этот класс соединений перспективным для разработки новых кардиотропных лекарственных препаратов
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение кардиотропных эффектов уридина, УМФ, УДФ и УТФ при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда
В задачи исследования входило:
-
Сравнительное исследование действия уридина и уридиновых нуклеотидов на сократительную способность изолированных перфузируемых сердец крыс на моделях регионарной и тотальной ишемии с последующей реперфузией
-
Оценка антиаритмического и проаритмогенного действия уридина и уридиновых нуклеотидов на изолированных перфузируемых сердцах крыс при моделировании ишемических и реперфузионных аритмий
-
Сравнительное изучение антиишемического и антиаритмического действий уридина, УМФ, УДФ, УТФ на модели острого инфаркта миокарда у крыс
-
Изучение возможного участия уридина и его нуклеотидов в регуляции митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение кардиопротекторного действия уридина, УМФ, УДФ и УТФ при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда Показано, что все испытуемые соединения препятствуют депрессии сократительной функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс Уридин и УМФ предотвращают развитие контрактуры УДФ и УТФ усиливают коронарный ток
Впервые показано, что уридин и УМФ на модели регионорной и тотальной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс уменьшают развитие реперфузионных повреждений миокарда, ограничивая возникновение реперфузионных аритмий и препятствуя развитию миокардиального станнинга На модели острого инфаркта миокарда у крыс впервые обнаружено, что наибольшей кардиопротекторной активностью обладают уридин и УМФ, которые оказывают как антиишемическое, так и антиаритмическое действие В ходе исследования показано, что антиишемическая активность уридина и УМФ связана с активацией АТФ-зависимых К+ каналов митохондрий
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Уридин и его нуклеотиды ограничивают снижение сократительной
функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых
сердец крыс
2 Уридин и УМФ предупреждают развитие миокардиального станнинга при
реперфузии после тотальной ишемии
3 Уридин и его нуклеотиды обладают антиаритмическим действием в
отношении ранних постокклюзионных аритмий Уридин и УМФ проявляют
антиаритмический, а УТФ проаритмогенный эффекты при реперфузионных
нарушениях сердечного ритма
4 Уридин и УМФ оказывают антиишемическое действие на ранних сроках
острой ишемии миокарда
5 Механизм кардиопротекторной активности уридина и УМФ связан с активацией АТФ-зависимых К+ каналов митохондрий
Личный вклад соискателя. Соискателем были выполнены анализ литературы по теме исследования, планирование и проведение экспериментов, статистическая обработка и анализ полученных результатов, а также основные публикации по теме работы Автор выражает признательность профессору ГД Мироновой - руководителю лаборатории митохондриального транспорта Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино) за помощь в проведении работы на нативных митохондриях и на модельной системе бислойных липидных мембран (БЛМ)
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического углубленного изучения уридина и УМФ с целью разработки на их основе новых кардиопротекторных средств
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Всероссийской научной конференции "Нейрофармакология в XXI веке" посвященной 110-летию академика С В Аничкова (Санкт-Петербург, 2002), на Международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003, 2005), на Конгрессе кардиологов стран СНГ (Санкт-Петербург, 2003), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2003), на Международной конференции "Biological Motility" (Пущино, 2004), на 4-ой Международной конференции Mitochondrial Physiology (Vorarlberg, Austria, 2005), на 8-ом Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), на 2-ой Российско-китайской научной конференции «Фундаментальная фармакология и фармация — клинической практике» (Пермь, 2006), на 6-ой Международной конференции «Hypoxia in Medicine» (Milan, Italy, 2006) По теме диссертации опубликовано 14 научных работ
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, содержит 12 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждения, а также выводов и списка цитированной литературы, из которых 40 отечественных и 174 иностранных источников
Структура и метаболизм уридина и уридиновых пуклеотидов (УМФ, УДФ, УТФ) в организме млекопитающих
Уридин - комбинация гетероциклического соединения пиримидина с рибозой - относится к пиримидиновым нуклеозидам, а его фосфорные эфиры - уридин-5 -монофосфат, уридин-5 -дифосфат и уридин-5 -трифосфат - к пиримидиновым нуклеотидам (рис.1).
В организме млекопитающих существует несколько путей образования уридина. При синтезе его de novo из предшественников с открытой цепью карбамоилфосфата, аспарагиновой кислоты и диоксида углерода возникает пиримидиновое кольцо, представляющее собой ароматический гетероцикл в виде шестичленного азот-углеродного кольца с тремя двойными связями. Присоединение к этому пиримидиновому гетероциклу D-рибозы приводит к образованию уридина. Этот нуклеозид синтезируется также из урацила и рибозо-1-фосфата при участии уридинфосфорилазы. Источником уридина в клетке могут служить уридиновые нуклеотиды и УДФ-глюкоза (Connolly, Duley, 1999).
Клинические наблюдения и экспериментальные исследования свидетельствуют об участии в синтезе и распаде уридина печени, и о ее ведущей роли в поддержании уровня уридина в плазме. Однако наиболее значимую роль в регуляции уровня уридина играют эритроциты, которые обладают уникальной способностью быстро захватывать оротовую кислоту и превращать ее в УДФ-глюкозу (Connolly, Duley, 1999). Эритроцитарные запасы УДФ-глюкозы могут быть источником глюкозы и уридина в периферических тканях, мозге и скелетных мышцах.
Источниками пополнения внутриклеточного пула уридина и его нуклеотидов является процесс реутилизации - образование из пиримидинов, высвобождающихся в процессе деградации ДНК и РНК, а также поступление с пищей. Соотношение синтеза уридина de novo и образование его в результате реутилизации зависит от типа клетки и ее физиологического состояния (Wood, 1973).
Уридин постоянно присутствует в свободном виде в клетках, в крови, в плазме. Плазма, спинномозговая жидкость, семенная жидкость содержат уридии (в метаболически активных концентрациях), который может утилизироваться клетками. Концентрация уридина в плазме крови, Костном мозге и спинномозговой жидкости человека колеблется от 3 до 8 цМ; сходные количества были обнаружены в плазме к ыс н мышей (Traut, 1994). При внутривенных инъекциях больших доз уридина, содержание его в плазме повышается, но быстро приходит к норме. Механизм такого строгого контроля концентрации уридина в плазме неизвестен (Traut, 1994; Scriver, 1995). Уровень уридина в плазме колеблется также в ответ па прием пищи и циркадные ритмы (Connolly, Duley, 1999).
Внутриклеточные превращения уридина связаны, прежде всего, с его последовательным фосфорилирован1ем до УМФ, УДФ и УТФ при участии уридинкиназы или катаболизмом (рис.2). В последнем случае образуется урацил и (3-аланин, который может поступать в цикл трикарбоиовых кислот (Scriver et al., 1995; Gonzalez, Fernandez-Salguero, 1995).
УМФ образуется не только при фосфорилиррвании уридина, но синтезируется также из оротовой кислоты (6-карбоксиурацила) и 5-фосфорибозил-1-пирофосфата (ФРПФ) при помощи уридиифосфат-синтетазы или de novo из глицина (Зайчик, 2000). УМФ является предшественником синтеза цитидиновых нуклеотидов, предварительно пройдя стадии фосфорилирования до УТФ.
Добавление фосфатных групп к УМФ ведет к образованию УДФ и УТФ. УТФ включается во многие жизненно важные пути внутриклеточного метаболизма. Соединяясь с сахарами, он образует конъюгаты: УДФ-глюкозу и УДФ-галактозу, играющих важную роль в гликозилировании белков, в синтезе гликогена и регуляции энергетического обмена. УТФ путем аминирования может превращаться в цитидинтрифосфорную кислоту (ЦТФ), которая в свою очередь, соединяясь с разными липидами, образует конъюгаты ЦДФ-липиды, один их таких коньюгатов - ЦДФ-этаноламин является Kомпонентом мембраны (Connoly, Duley, 1999). УТФ используется также в синтезе РНК, а после превращения в дезоксипиримидин включается в ДНК. Участие уридина и его нуклеотидов в синтезе РНК и биологических биомембраи, является важным элементом в регуляции, как физиологических, так патологических процессов.
Эндогенные биологически активные вещества активаторы МИТОКДТФ каналов
Возможность регулировать активность митохондриальных АТФ-зависимых К каналов в условиях достаточно высоких концентраций АТФ открывает новые перспективы фармакологической коррекции и предупреждения ишемических состояний. В этом направлении делаются еще только первые шаги.
Так, в опытах in vivo показано, что В-эстрадиол снижает, размеры области инфаркта. Блокада этого эффекта 5-HD может свидетельствовать об активации митохондриальных АТФ-зависимых каналов 13 эстрадиолом (Tsai et al., 2002)
Стимуляция кардиальных ц-опиатных рецепторов эффективно предупреждает нарушения сократимости, вызванные ишемией-реперфузией. Кроме того, активация этих рецепторов способствует сохранению целостности мембран кардиомиоцитов и снижению повреждения миокарда свободными радикалами в условиях реоксигенации (Ласукова, Реброва, 2001). Установлен карднопротективный эффект морфина (лиганда опиатных рецепторов) при ишемии и реперфузии миокарда in vivo (Schultz et al., 1996), в экспериментах in vitro выявлено антиоксидантное действие неселективного агониста опиатных рецепторов даларгина после активации свободнорадикальных процессов (Лишманов и соавт., 1998). Предполагается, что все эти эффекты являются результатом активации АТФ-зависимых К каналрв.
Появился ряд публикаций, в которых показана антиаритмическая активность агонистов опиатных рецепторов. Полагают, что антиаритмический эффект опиоидов является результатом активации ими митохондриальных АТФ-зависимых Гканалов (Fryer et al., 2000; Лишманов, Маслов, 2000; Соленкова и др., 2001). Предварительная блокада АТФ-зависимых К каналов глнбенкламидом или ингибирование митохондриальных АТФ-зависимых К каналов 5-гидроксидеканоатом (5-HD) полностью устраняет антиаритмический эффект агонистов ц- (мір) и бГ.(дельта 1) опиатных рецепторов в условиях ишемии и реперфузии миокарда (Fryer et al., 2000; Лишманов, Маслов, 2000; Соленкова и др., 2001; Маслов и соавт., 2002). В передаче сигнала от 8,- рецептора к митохондриальным АТФ-зависимым К каналам, принимает участие протеинкиназа С (Huh et al., 2001).
Показано, что внеклеточная АТФ может усиливать работу АТФ-зависимых К каналов через Рг рецепторы, активируя адепилатциклазу (Grover, Garlid, 2000).
В физиологических условиях митохондриальный -АТФ-зависимый К+ канал находится обычно в закрытом состоянии, так как концентрация АТФ в клетках значительно превышает необходимую для ингибирования канала. Ингибирующий эффект АТФ на каналы проявляется в концентрациях, значительно ниже тех, которые наблюдаются в клетке даже при гипоксических условиях (Лукьянова, 2004). Для открытия и регуляции работы митохондриальных АТФ-зависимых К каналов необходимы активаторы этих каналов. Поиск таких активаторов наиболее целесообразен среди природных регуляторов метаболических процессов клетки, на основе которых могут быть созданы лекарственные препараты. Преимуществом природных регуляторов является их малая токсичность и возможность с их помощью регулировать внутриклеточный пул эндогенных форм этих соединений (Adrehali, 2004; O Rourke, 2004).
Grigoriev и соавторы (1999) . провели исследования влияния ряда нуклеотидов (АДФ, ЦТФ, ЦДФ, ГТФ, ГДФ) на активность митохондриальных АТФ»зависимых К каналов. В экспериментах на выделенной и реконструированной в БЛМ каналообразующей субъединице, а также на целом канале было выявлено активирующее действие только двух дифосфонуклеотидов АДФ и ГТФ.
Получены предварительные данные о способности УДФ активировать митохондриальные АТФ-зависидые К+ каналы (Скарга и соавт 001)
Экзогенный УДФ не транспортКруется черек мембраны," однако он может синтезиооватьсн ит экзогенных уридина и УМФ ппоникаюших через клеточныр мембраны (Matsushita, Fanburc а970У
В настоящей работе исследовались кардиотропные эффекты уридина и его нуклеояидов при ишемии миокарда in vitro и оп vivoэ
Установленные и иксперименте новые позитивные свойства уридина и его нуклеотидов возможно привлекут внимание кардиологоу и инане разработки довых более совершевных схем о поввшение жизнеспособности и,емизированного минкарда т к это одна го наиболее актуальных задач совиеменной экспериментальной д клиначеской карди офа рмакологии
Действие уридина и уридшювых пуклеотидов на сократительную способность изолированных нерфузируемых сердец крыс при регионарной ишемии
Регионарная ишемия левого желудочка изолированного перфузируемого сердца крыс приводила к развитию нарушений в процессах сокращения и расслабления миокарда.
На протяжении всего периода наблюдения (60 минут после окклюзии) отмечено постепенное уменьшение развиваемого давления (РД) в полости левого желудочка. К концу эксперимента оно составляло лишь 13.8% от исходного уровня (табл.2). Аналогичная динамика наблюдалась в отношении максимальной скорости сокращения миокарда (+dP/dtmax), которая к 60 минуте была в 8.3 раза меньше исходной.
. Параллельно с угнетением сократительной функции миокарда происходило нарушение расслабления сердечной мышцы. Об этом свидетельствовало уменьшение максимальной скорости расслабления (-dP/dtmax) в 2 раза и повышение конечного диастолического давления (КДД) в 1.8 раза через 60 минут после окклюзии по сравнению с исходными значениями (табл.2).
Кроме анализа процессов сокращения и расслабления миокарда была изучена динамика изменения коронарного тока (КТ) (количество перфузата, протекающего через сосуды сердца за 1 минуту). Полученные данные свидетельствуют о резком изменении этого показателя в условиях регионарной ишемии левого желудочка. Уже через 5 минут после окклюзии КТ сокращался па 40%, а к 60 минуте составлял только 18% от ИСХОдного уровня (табл.2).
В ходе эксперимента в контрольной группе наблюдалось постепенное уменьшение частоты сердечных сокращений (ЧСС), которое носило достоверный характер (р 0.05) начиная с 20 минуты ишемии. Максимальное изменение ЧСС было отмечено на 60 минуте и составляло 31% по сравнению с начальной величиной (р 0.05) (табл.2).
Добавление в перфузат . уридиновых соединений существенно изменяло динамику и выраженность нарушений в процессах сокращения и расслабления ишемизированного миокарда.
Так, если в контрольной группе уже через 5 минут после окклюзии развиваемое давление в полости левого желудочка уменьшалось на 35% по сравнению с исходными значениями и постепенно снижалось на протяжении всего периода наблюдения (60 минут после окклюзии), то под действием уридина наблюдалась другая картина. К 5 минуте после окклюзии происходило снижение РД (на 24% от исходных значений), но начиная с 10 минуты наблюдался подъем этого показателя и к 20 минуте он был равен исходному значению. В дальнейшем РД уменьшилось и к концу наблюдения составило 27% от исходного уровня (табл.2), что было в 2 раза выше по сравнению с контролем.
Добавление УМФ в перфузат значительно замедляло снижение РД. В течение первых 10 минут после окклюзии этот показатель оставался на исходном уровне. Далее РД снижалось, оставаясь до конца эксперимента в 2.5 раза выше, чем в контроле.
При перфузии сердец раствором, содержащим УДФ или УТФ, отмечена одинаковая динамика изменения РД. В течение первых 10 минут после окклюзии темпы снижения РД были сходными с наблюдавшимися в контроле. Однако, далее процесс угнетения РД замедлялся и, начиная с 20 минуты до окончания наблюдения, этот показатель был в 2 раза выше, чем в контроле. Достоверного различия в эффектах УДФ и УТФ отмечено не было.
Второй показатель, характеризующий степень сокращения миокарда - это максимальная скорость сокращения миокарда (+dP/dtmax)- К концу эксперимента (60 минута после окклюзии) в контрольной группе, как было отмечено выше, этот показатель снижался в 8.3 раза по сравнению с исходными значениями. Использование уридина, УМФ, УДФ и УТФ позволило в значительной степени предупредить уменьшение максимальной скорости сокращения изолированных сердец крыс с регионарной ишемией левого желудочка.
. Уридин способствовал сохранению исходных значений +dP/dtmaK в течение 20 минут после окклюзии. К 30 минуте этот показатель уменьшался на 39% и сохранялся на этом уровне до 60-й минуты. В этой группе к концу эксперимента значения +dP/dtiax превышали контрольные в 5 раз. .
Положительное влияние УМФ было сопоставимо с эффектом уридина.
В тех группах, где в перфузат добавляли УДФ и УТФ, динамика изменения +dP/dtiax была сходной и несколько отличалась от описанной выше. Уже через 5 минут окклюзии максимальная сила сердечных сокращений уменьшалась на 30%, но далее, на протяжении всего срока наблюдения, оставалась в пределах достигнутых величин, претерпевая незначительные колебания. В этих опытах, как при использовании уридина и УМФ, конечные зарегистрированные значения +dP/dtmax также были в 5 раз выше контрольных.
Таким образом, использование уридина, УМФ, УДФ и УТФ ослабляло угнетение инотропной функции миокарда в условиях регионарной ишемии. В итоге, к 60-ой минуте ишемии величина развиваемого давления в полости левого желудочка превышала соответствующий показатель в контроле в 2-2.5 раза, а максимальная скорость сокращения миокарда была больше чем в контроле примерно в 5 раз (во всех случаях различия с контрольной группой статистически достоверны; р 0.05). Необходимо подчеркнуть, что, несмотря на определенные различия в динамике изменения показателей сократительной функции миокарда, которые наблюдались при введении уридина, УМФ, УДФ и УТФ, к концу срока наблюдения эти различия были незначительны. Так к 60 минуте значения +dP/dtmax составляли 57, 61, 59 и 70 % от исходного уровня для уридина, УМФ, УДФ и УТФ соответственно. Регионарная ишемия левого желудочка изолированного перфузируемого сердца крыс приводила также и к изменению процессов расслабления миокарда, что выражалось в нарастании конечного диастолического давления (КДД) и падении максимальной скорости расслабления (-dP/dtmax)- Введение уридина или УМФ предотвращало ухудшение расслабления миокарда. В этих двух группах на протяжении всего эксперимента показатели КДД и -dP/dtmax практически не отличались от исходных. Эффект УДФ был менее выраженным. При его добавлении в перфузат наблюдалась тенденция к увеличению КДД, а показатель -dP/dtmax оставался до 30 минуты выше соответствующих значений в контроле, а к 60 минуте снижался до нх уровня. Положительный эффект УТФ полностью отсутствовал. В данном случае можно говорить даже о некотором ухудшении функции расслабления, так как резкое падение -dP/dtmax и увеличение КДД наблюдались уже через 5 минут после окклюзии.
Таким образом, проведенные исследования показали, что изученные препараты по-разному влияли на процессы расслабления ишемизированного миокарда: уридин и УМФ поддерживали их на исходном уровне, УДФ был мало эффективен, УТФ оказывал негативное влияние.
Регионарная ишемия миокарда сопровождалась уменьшением коронарного кровотока (КТ), который к концу эксперимента снижался в 5.5 раз. Уридин и УМФ не оказывали существенного влияния на величину коронарного тока. УДФ и, в большей степени, УТФ усиливали КТ. Так, если в контроле величина КТ к 60 минуте опыта уменьшилась на 82%, то .при перфузии сердец раствором, содержащим УДФ - на 64%, а УТФ - на 37% (в обоих случаях отмечено статистически достоверное отличие от контроля; р 0.05).
Тестируемые соединения незначительно влияли на ЧСС, которая во всех группах имела тенденцию к снижению и на 30- 60-й минуте была достоверно меньше, чем до окклюзии коронарной артерии,
Таким образом, все испытуемые соединения предотвращали депрессию сократительной функции миокарда при ишемии. Из всех соединений только уридин и УМФ препятствовали нарушению процессов расслабления миокарда, нто связано с предотвращением развития контрактуры. УДФ и, в большей степени, УТФ усиливали коронарный ток, т.е. оказывали коронародилатирующее действие.
Определение биохимических показателей в ткани сердца
Острая ишемия миокарда приводит к закономерному и хорошо воспроизводимому в эксперименте комплексу изменений: резкому повышению содержания лактата, росту соотношения лактат/пируват, к снижению содержания гликогена и КФ в ткани сердца (Галенко-Ярошевский,Гацура,2001).
Результаты нашего исследования показали, что через 15, 30 и 60 минут после окклюзии ЛКА происходит увеличение концентрации лактата в сердце крыс на 237%, 311% и 211% соответственно (рис.17 б), по сравнению с этим показателем у интактных животных. При этом достоверно значимых изменений в содержании нирувата на указанных сроках ишемии не отмечалось (рис. 17а). Соотношение лактат/пируват, являющееся показателем интенсивности гликолитического или аэробного пути образования энергии, увеличивалось с 11 до 43, 49 и 34 соответственно (табл.12). В условиях нарушения коронарного кровообращения, когда уменьшается приток свободных жирных кислот и глюкозы с кровью, сердце в качестве энергетического субстрата использует гликоген, запасы которого малы и быстро истощаются. Как показали результаты нашего исследования, наибольшее снижение уровня гликогена наблюдается на 30 минуте ишемии (на 52%) (рис.17 в). Одновременно отмечается уменьшение количества КФ, также более выраженное на 30 минуте ишемии (на 61%) (рис.16 г).
Полученные данные свидетельствуют о том, что окклюзия ЛКА приводит к значительным нарушениям в энергетическом метаболизме сердца, проявляющимся в снижении интенсивности аэробного пути окисления субстратов, активации гликолиза, дефиците запасов гликогена и снижении содержания КФ (пик изменений приходился на 30 минуте после окклюзии ЛКА).
Для оценки влияния уридиновых соединений на энергетический обмен ишемизированного миокарда, нами были выбраны УМФ и УТФ. Выбор УМФ обусловлен тем, что он, проникая через клеточные мембраны, оказывает непосредственное влияние на обменные процессы в кардиомиоцитах (Connolly, 1999). Кроме того, как показали наши предыдущие исследования, УМФ обладает более выраженным антиишемическим и антиаритмическим действием, чем уридин.
Другой препарат, использованный в данном исследовании, - УТФ. Он не транспортируется через клеточные мембраны и его влияние на клеточный метаболизм может проявляться только после дефосфорилирования до УМФ или уридина с их последующими внутриклеточными преобразованиями. УТФ может проявлять свои эффекты и на рецепторном уровне (Ziganschin, 1998).
Наши исследования показали, что введение препаратов УМФ и УТФ (30 мг/кг) до окклюзии ЛКА оказывает положительное действие на энергетический метаболизм сердца, отчетливо проявляющееся на 60 минуте окклюзии. При введении УМФ отмечалось снижение соотношения лактат/пирувата до 34, 30 и 17 против 43, 49 и 34 в контроле, что свидетельствует об уменьшении интенсивности гликолиза и увеличении доли аэробного пути образования макроэргических соединений на всех сроках окклюзии. УТФ, в отличие от УМФ, снижал соотношение лактат/пирувата, начиная с 30 минуты ишемии (45, 30 и 18). Оба нуклеотида способствовали сохранению запасов гликогена, необходимого для синтеза гликолитической фракции АТФ, играющей уникальную роль в сохранении функциональной и структурной целостности кардиомиоцитов на ранних сроках ишемии (Галенко-Ярошевский, Гацура, 2001). На 60 минуте эксперимента содержание этого полисахарида приближалось к его уровню у интактных крыс.
На фоне действия УМФ и УТФ на 60 минуте окклюзии ЛКА отмечалось увеличение количества пирувата в сердце на 87% и 65% сравнению с этим показателем у интактных животных, Пируват, включаясь в цикл Кребса с последующим митохондриальным окислением, способствует сохранению энергетического баланса в кардиомиоцитах.
Как показали результаты нашего исследования, содержание КФ, играющего важную роль в энергообеспечении сокращения сердечной мышцы и регуляции токов Са+2, на 60 минуте окклюзии ЛКА на фоне действия УМФ и УТФ было на уровне величин интактных животных, Следует отметить, что на 15 минуте окклюзии коронарной артерии содержание КФ при введении как УМФ, так и УТФ было ниже, чем в соответствующем контроле и лишь на 30 минуте отмечалось его небольшое увеличение. Этот факт можно объяснить положительным инотропным действием нуклеотидов. Усиление сократительной функции миокарда при введении УМФ и УТФ сопровождается увеличением расхода цитоплазматического КФ на самых ранних сроках ишемии, который не компенсируется его транспортом из митохондрий вследствие ингибирования АТФ-АДФ-транслоказы, функционально сопряженной с митохондриальной креатинкиназой. Транслоказа очень чувствительна к недостатку кислорода - за 15 мин ишемии ее активность снижается на 80% (Duan,Karmazy,1989),
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что применение УМФ и УТФ до окклюзии ЛКА оказывает положительное влияние на энергетический метаболизм миокарда в остром периоде ишемии. Однако энергопротекторный эффект УТФ отсрочен на 15 минут по сравнению с аналогичным эффектом УМФ.
