Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1 Пограничные покровы тела. Нормофлора кожи, ее значение и функции 14
1.2 Инфекционные и травматические поражения наружных покровов тела 24
1.3 Пробиотики и перспективы их применения для лечения инфекционных и травматических поражений кожи и слизистых 28
1.3.1. Общая характеристика пробиотиков 28
1.3.2. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus 31
1.3.3. Пробиотики на основе бактерий рода Lactobacillus 34
1.3.4. Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков 36
1.3.5. Критерии отбора микроорганизмов для включения в состав пробиотиков 40
1.4 Чрезкожные проводники лекарственных средств 43
1.5 Выбор направления исследований 52
2. Материалы и методы исследований 54
2.1 Материалы 54
2.1.1. Микроорганизмы и препараты, используемые в работе 54
2.1.2. Экспериментальные животные 57
2.1.3. Питательные среды, растворы и реактивы 58
2.2 Методы исследований 59
2.3 Статистическая обработка результатов 66
3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 67
3.1 Экспериментальное изучение новых гелевых лекарственных форм препаратов для наружного применения, содержащих В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ 67
3.1.1. Изучение возможности получения экспериментальных образцов пробиотических гелевых препаратов для наружного применения 67
3.1.2. Изучение биологических свойств и сохраняемости микроорганизмов в составе экспериментальных образцов препаратов 82
3.2 Экспериментальная оценка эффективности испытуемых препаратов 88
3.2.1. Доклиничкская оценка безопасности и активности мягких лекарственных форм, содержащих Субтилакт 88
3.2.2. Изучение терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях инфекционных процессов пограничных покровов тела лабораторных животных 109
3.2.2.1. Биохимические исследования сыворотки крови лабораторных животных при оценке терапевтической эффективности испытуемых препаратов на основе Субтилакта в условиях моделирования локализованной гнойной инфекции кожи 126
3.2.2.2. Влияние исследуемых образцов пробиотического препарата Субтилакт на некоторые факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном моделировании кожного инфекционного процесса 132
3.2.3. Изучение терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях резаных ран кожи 142
3.2.3.1. Биохимические исследования сыворотки крови лабораторных животных при оценке терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях резаных ран кожи 145
3.2.3.2. Влияние исследуемых образцов гелевых пробиотических препаратов на некоторые факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном , моделировании резаных ран кожи 150
3.2.4 Изучение терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях термических ожогов кожи 158
3.2.4.1. Биохимические исследования сыворотки крови лабораторных животных при оценке терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях термических ожогов кожи 160
3.2.4.2. Влияние образцов гелевых пробиотических препаратов на некоторые факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном термических ожогов кожи 165
3.3 Подтверждение терапевтической эффективности гелевых пробиотических препаратов на моделях инфекционных процессов, резаных ран и термических ожогов кожи у морских свинок 174
3.4. Фармакодинамика и фармакокинетика биокомпонента при наружном применении исследуемых препаратов 182
Заключение 185
Выводы 189
- Инфекционные и травматические поражения наружных покровов тела
- Методы исследований
- Экспериментальная оценка эффективности испытуемых препаратов
- Биохимические исследования сыворотки крови лабораторных животных при оценке терапевтической эффективности испытуемых препаратов на основе Субтилакта в условиях моделирования локализованной гнойной инфекции кожи
Введение к работе
С позиций медико-биологических наук здоровье - это нормальное психосоматическое состояние человека [1]. Одной из наиболее удачных, по нашему мнению, формулировок, определяющих здоровье, является следующая: «Здоровье - это состояние полного физического, духовного и социального благополучия, а не только отсутствие болезней или физических дефектов» [1, 28,287].
В настоящее время объективно наблюдается нарастание неблагоприятных социальных, экологических и других факторов, что существенно влияет на состояние здоровья населения и ухудшает эпидемическую ситуацию по ряду инфекционных заболеваний [20, 70, 75, 217].
По данным Центрального научно-исследовательского института Эпидемиологии Минздрава Российской Федерации. Существенно увеличилась не только общая инфекционная заболеваемость, но и количество инфекций, отличающихся вялотекущим, рецидивирующим и хроническим течением, одновременно возросло и число инфекционных поражений вызываемых условно-патогенными видами возбудителей [70, 71, 98, 211].
Все большую значимость в настоящее время приобретает проблема борьбы с местными воспалительными и гнойными заболеваниями. По данным некоторых авторов неудовлетворительные результаты лечения таких поражений существенно возросли [123, 152, 179].
Наметилась отчетливая тенденция снижения терапевтической эффективности многих противомикробных средств, особенно антибиотиков, что, значительно снижает эффективность лечения поражений, в частности кожных покровов, инфекционного генеза. В настоящее время целесообразным представляется использование для лечения инфекционных заболеваний препаратов на основе живых пробиотических бактерий.
Пробиотики считаются наиболее распространенными и эффективными средствами для поддержания микроэкологии человека на оптимальном уровне и ее коррекции.
Пробиотики относятся к группе медицинских иммунобиологических препаратов на основе живых бактерий, антагонистически активных в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов - возбудителей различных инфекционных заболеваний и не оказывающих отрицательного влияния на представителей нормальной микрофлоры человека [98, 185,211].
Пробиотики, как новый класс лечебно-профилактических препаратов, в настоящее время находят все большее применение в медицинской практике и показания к их назначению все больше расширяются [98, 173, 134, 135]. Как правило, пробиотические препараты используются для профилактики и лечения острых кишечных инфекций и дисбактериозов [98]. Отметим также, что подобная терапия сопровождается, как правило, и позитивными сдвигами в системе неспецифической защиты организма и приводит к повышению сопротивляемости организма к воздействию неблагоприятных факторов [51, 98, 99, 227]. Наиболее распространены такие препараты как ацилакт, бактисуб-тил, биоспорин, бифидумбактерин, бификол, колибактерин, колифлорал, лактобактерин, севакол, флонивин и др.
В тоже время нам известна только лишь одна работа, в которой про-биотик и, в частности, биоспорин использовали для лечения инфекционных поражений кожных покровов и слизистых оболочек у сельскохозяйственных животных [224].
Как уже было отмечено выше, существенное место в инфекционной патологии людей занимают гнойно-воспалительные заболевания кожных покровов и слизистых оболочек [129, 147], которые чаще всего развиваются в результате их травматических повреждений (раны, ожоги). Лечение подобных повреждений антибиотиками и другими традиционными средствами далеко не всегда бывает эффективным, поэтому задача борьбы с воспали-
9 тельными заболеваниями наружных покровов в настоящее время является актуальной и требует новых решений.
Данное обстоятельство послужило основанием для проведения теоретических и экспериментальных исследований по оценке возможности разработки новых фармакологических препаратов для наружного применения на основе уже известных пробиотиков и современных трансдермальных основ. В качестве пробиотического средства нами был выбран и предложен Субти-лакт, как один из новых и сравнительно более эффективных (в частности по величине антагонистической активности) пробиотиков. Биологический компонент данного препарата представлен культурами двух видов микроорганизмов бактериальной природы: Bacillus subtilis и Lactobacillus plantarum, безвредных для человека.
Специфическое лечебное и профилактическое действие В.subtilis и L. plantarum обеспечивается различными биологически активными веществами, такими как протеины, ферменты, антибиотики, витамины и другие, являющимися продуктами метаболизма этих бактерий при их росте, развитии и размножении [186]. Следует отметить, что применяемые в настоящее время пробиотические препараты, как правило, обезвожены (сухие), и бактериальные клетки в них находятся в анабиотическом состоянии. Продуцируемые микроорганизмами биологически активные вещества в этом случае неактивны и не способны проникать в глубокие слои кожи. Жидкие формы пробиотиков, в свою очередь неудобны для наружного применения, поскольку быстро теряют свою специфическую активность. Жировые основы, в случае использования их при создании лекарственных форм для накожного применения также не обеспечивают оптимальных условий для жизнедеятельности клеток, поэтому пробиотики, в этом случае, своего максимального лечебного действия реализовать не в состоянии [32,191]. В тоже время гидрофильные основы, используемые для создания мягких лекарственных форм, обеспечивают более благоприятные условия для прорастания спор, размножения вегетативных клеток, действия ферментов и комплекса биологически актив-
10 ных веществ. Этим требованиям хорошо соответствуют такие современные гелевые препараты как эфтидерм, тизоль, и кремнийорганические соединения, которые обладают способностями активно проникать через кожу, ускорять в ней репаративные процессы, уменьшать явления отечности, инфильтрации, индурации и т.д. [66, 72, 77, 185].
Таким образом, задача использования гидрофильных транскутанных основ для создания новых, на основе пробиотических бактерий, лекарственных форм, применяемых для лечения инфекционных и травматических поражений кожи остается актуальной и до настоящего времени не разработанной.
Цель настоящей работы - теоретическое и экспериментальное обоснование возможности создания новых экспериментальных образцов пробиотических гелей для наружного применения на основе бактерий видов Bacillus subtilis и Lactobacillus plantarum и транскутанных проводников.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить биологические свойства штаммов Bacillus subtilis 3 и Lactobac-tirium plantarum 8P-A3 для обоснования механизмов их специфического действия в составе экспериментальных образцов гелевых пробиотических препаратов.
Обосновать возможность использования эфтидерма, тизоля и кремний-органического глицерогидрогеля (КГТ) в качестве основ для создания экспериментальных образцов пробиотических препаратов для наружного применения.
Провести экспериментальные исследования по разработке оптимального компонентного состава экспериментальных образцов препаратов на основе эфтидерма, тизоля, КГГ.
Провести доклинические испытания разработанных образцов препаратов для наружного применения.
5. Изучить распределение биокомпонентов предлагаемых гелевых пробиотических препаратов в организме лабораторных животных.
Научная новизна. Теоретически и экспериментально доказана возможность создания медицинских пробиотических препаратов для наружного применения. Обоснован компонентный состав экспериментальных образцов пробиотических гелевых препаратов.
Впервые создано три экспериментальных образца пробиотических препаратов на основе эфтидерма, тизоля и КГГ. Экспериментально доказана эффективность предлагаемых гелевых форм пробиотика Субтилакт в отношении таких возбудителей, как стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка, грибы рода Candida. Показано иммуномодулирующее действие предлагаемых образцов. В условиях экспериментального моделирования инфекционного, ожогового и травматического процессов на лабораторных животных подтверждена высокая терапевтическая эффективность разработанных препаратов для лечения данных состояний, в том числе, осложненных гнойным процессом.
Практическая значимость работы. Разработана лабораторная технология получения новых лекарственных форм пробиотических препаратов для наружного применения на основе глубинных культур бактерий видов В. subtilis и L. plantamm и трех видов транскутанных проводников. По результатам выполненных исследований разработаны: 1. Сборник лабораторных методик по выделению, изучению биологических свойств и поддержанию в жизнеспособном и активном состоянии культур В. subtilis и L. plantamm; 2. Регламент по производству пробиотического геля-S; 3. Инструкция по применению пробиотического геля-S; 4. Фармакопейная статья предприятия (проект); 5. Подана заявка на получение патента (регистр, номер 2005128423/13). Результаты исследований внедрены в учебный процесс для студентов фармацевтического, лечебно-профилактического, педиатрического, медико-профилактического и стоматологического факультетов. Данные, полученные в ходе диссертационной работы, внедрены в научно-исследовательскую дея-
12 тельность кафедры фармакологии ГОУ ВПО УГМА Росздрава и Центра ВТП БЗ РФ НИИ Микробиологии.
Разработанные новые экспериментальные образцы медицинских препаратов, содержащие пробиотик в гелевых основах транскутанного действия (эфтидерм, тизоль, КГГ) уже на доклиническом этапе экспериментальных исследований показали высокую терапевтическую эффективность при лечении инфицированных ран, в том числе гнойных, ожогов, механической травмы кожных покровов. Есть все основания полагать, что по результатам клинических испытаний, данные препараты могут быть рекомендованы для использования в практическом здравоохранении.
Основные положения, выносимые на защиту:
Гелевые формы транскутанных проводников (тизоль, эфтидерм, КГГ) в сочетании с пробиотиком Субтилакт, являются новыми эффективными лекарственными средствами для наружного применения. -
Лечебный эффект, предлагаемых экспериментальных препаратов, обеспечивается высокой антагонистической активностью пробиотических бактерий штаммов Bacillus subtilis 3 и Lactobacillus plantarum 8P-A3 в отношении различных видов патогенных и условно-патогенных возбудителей инфекционных заболеваний; комплексом, продуцируемых ими биологически активных веществ, иммуномодулирующими свойствами и специфическим действием выбранных чрезкожных проводников.
Разработанные и изученные в эксперименте гелевые пробиотические препараты могут быть рекомендованы для лечения больных при инфекционных и травматических повреждениях кожных покровов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 работы в реферируемых ВАКом изданиях.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции "Рациональное использование лекарств" (Москва, 10-12 марта 2004); на IV-й международной научно-практической конференции "Клинические исследования лекарственных
13 средств" (Москва, 2004); на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 55-летию образования Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология." (Екатеринбург, 2004); на 58-й, 59-й, 60-й, 61-й межвузовских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2003, 2004,
2005, 2006); Материалы диссертации опубликованы в Вестнике Уральской медицинской академической науки (Екатеринбург, 2006. -Вып.1); в Вест нике Уральской государственной медицинской академии (Екатеринбург,
2006. -Вып.15); в Химико-фармацевтическом журнале (Москва, 2006. -№5) Объем и структура диссертации. Диссертация составлена по обще принятой структуре и состоит из введения, аналитического обзора литера туры, главы о материалах и методах исследований, главы эксперименталь ных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, прктиче- ских рекомендаций ич списка использованных источников литературы. Дис сертация изложена на 221 страницах, содержит 47 таблиц и 18 рисунков. Список использованной литературы включает 303 источника, из них 236 ра бот отечественных и 67 работ иностранных авторов.
Автор принимал непосредственное участие в выборе направления ис-следований, организации, планировании и проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов.
Исследования по изучение биологических свойств бактериальных культур Bacillus subtilis и Lactobacillus plantarum в составе экспериментальных образцов препаратов для наружного применения проведены совместно с сотрудниками Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ.
Инфекционные и травматические поражения наружных покровов тела
Повреждения наружных покровов различными факторами приводят к нарушению защитных механизмов и развитию заболеваний. Это происходит только тогда, когда адаптационно-компенсаторные механизмы организма не способны восстанавливать нормальные функции кожных покровов тела [147, 183]. Факторы, вызывающие повреждения покровов тела, могут быть экзогенного и эндогенного происхождения. Экзогенные раздражители кожных покровов можно разделить на: механические (ушибы, трения и др.); физические (нагрев - охлаждение, элек- трический ток, ионизирующее излучение и др.); химические (кислоты, щелочи, яды, канцерогены и др.); биофакторы (микробы, паразиты и др.). Эндогенными факторами могут быть: патогенные инфекционные агенты, токсины, гипо- и авитаминозы, нарушения метаболизма и гормональной функции, аллергии и т.д. Среди травматических повреждений кожных покровов наибольший удельный вес имеют травмы и ожоги различной степени тяжести [130, 157, 165]. Ожоговая травма чаще всего является локальным (местным) поражением, однако при обширных ожогах она приобретает общий характер. Развивается так называемая ожоговая болезнь, с вовлечением в патологический процесс и внутренних органов. По этиологическим факторам ожоги подразделяются на термические, электротермические, химические, радиационные, от зажигательных смесей и комбинированные [139, 202]. По тяжести поражений ожоги делят на 4 степени. В зависимости от глубины повреждения тканей ожоги подразделяются на 2 группы: ожоги I, II, Ша степеней, относятся к поверхностным ожогам, так как эпителизируются самостоятельно при консервативном лечении. Вторую группу составляют поражения III6 и IV степеней, являющиеся глубокими ожогами, которые лечатся только оперативно [34]. Ожоговые повреждения часто сопровождаются инфекционными осложнениями - 22-46% случаев. Они является причиной от 50% до 75% всех случаев смерти [249]. Раневая поверхность при ожогах с постоянно диффундирующими из плазмы питательными веществами и оптимальный температурный режим, представляют собой благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов.
При обширных ожогах риск инфицирования значительно возрастает. Бактериальная инфекция может вызвать увеличение глубины и площади поражения кожных покровов, одновременно она препятствует эпителизации и спонтанному заживлению раны. В случае не-леченных или трудно поддающихся лечению инфекционных осложнений может наступить бактериемия и сложатся благоприятные условия для развития сепсиса [73]. Потенциальными возбудителями раневых и ожоговых осложнений являются: стафилококки (25-80%), стрептококки (1-46,4%), эшерихии (10,8-73,7%), протеи (3-39%), синегнойная палочка (3,7-44,1%), анаэробные аспо-рогенные бактерии (2,1-39,5%), клостридии (2,1-39,5%), дрожжеподобные грибы рода кандида (0,4-0,9%) [198, 131]. Многообразие видов микроорганизмов, вызывающих осложнения ожоговых ран, обуславливает и необходимость поиска эффективных препаратов для местного применения. Ранее, когда лечение ожогов не включало в себя химиотерапию летальность в результате ожоговых травм составляла 38-45% среди больных, находящихся на лечении в ожоговых центрах. Использование местного применения антибактериальных средств снизило этот показатель до 14-24% и существенно уменьшило вероятность возникновения ожогового сепсиса [73,131,133, 137]. Препараты, включающие в себя антимикробные средства для местного применения при лечении ожоговых ран должны обладать выраженными бактерицидными или бактериостатическими свойствами в отношении микроорганизмов, вызывающих инфекционный процесс и должны способствовать регенерации тканей и их эпителизации, не оказывать аллергизирующе-го действия и быть удобными для применения. Существующие в настоящее время химиотерапевтические препараты чаше всего не соответствует всем вышеперечисленным требованиям [281]. Роль бактерий в раневом инфекционном процессе неоднозначна. С одной стороны, они вырабатывают факторы патогенности [245, 278, 298, 299]. Прежде всего к ним следует отнести инвазивность, т.е. способность микроорганизмов к внедрению в живые ткани. Классическим фактором ин-вазивности считается, например, гиалуронидаза стафилококков [15, 62, 94]. Staphylococcus aureus продуцирует белки, связывающиеся с белками матрик- са, тканей и плазмы, такими как фибронектин, фибриноген, коллаген, эластин, плазминоген и др. Эти белки способствуют колонизации бактериями тканей раны [268]. Pseudomonas aeruginosa образует специфические адге-зины для ламинина - компонента базальной мембраны, что способствует обсеменению этим микроорганизмом поврежденных тканей [277]. Большое количество видов бактерии обладают способностью вырабатывать токсины, которые также являются одним из факторов, патоген-ности. Например а и b токсины стафилококков, гемолизин стрептококков, эндотоксин грамотрицательных бактерий [94], а также низкомолекулярные токсические вещества (фенол, индол и др.) [165].
Бактериальные клетки способны продуцировать факторы, угнетающие иммунитет. Например, некоторые бактерии секретируют вещества, препятствующие слиянию фагосом с лизосомами [ПО], лейкоцидин стафилококков вызывает гибель полинуклеарных лейкоцитов [94], Ps. aeruginosa продуцирует супероксид-дисмутазу, что способствует устойчивости бактерии к генерируемому фагоцитами макроорганизма супероксиду [286], стрептококки группы А образуют гиалуронидазу, препятствующую опсонизации и фагоцитозу [231]. Наряду с факторами патогенности бактерии вырабатывают факторы, оказывающие определенное благоприятное влияние на течение гнойного процесса. Они продуцируют гидролитические ферменты, разрушающие некротические ткани, а также антибиотические вещества, подавляющие рост других патогенных микроорганизмов. Например, синегнойная палочка выделяет протеазы и антибиотик пиоцианазу, подавляющую рост стафилококков [94]. Бактерии могут продуцировать и стимуляторы иммунной системы. Такие, как бактерийные полисахариды, повышающие активность макро-фагов[110] и М-ацетилглюкозамил-КГ-ацетилмурамил-Ь-аланил-Б-изоглу-тамин, представляющий собой общий повторяющийся фрагмент пепти-догликана клеточной стенки всех известных грамположительных бакте- рий и стимулирующий практически все звенья иммунной системы и лей-копоэз, а также являющийся противовоспалительным агентом [67]. 1.3. Пробиотики и перспективы их применения в лечении инфекционных и травматических поражений кожи и слизистых. 1.3.1. Общая характеристика пробиотиков Известно, что эффективное лечение инфекционной патологии, вызванной различными возбудителями, во многом зависит от знания достаточно тонких механизмов, определяющих взаимодействие и отношение в системе "паразит-хозяин" [50, 220, 293]. Что касается состояния нормального, то есть не инфицированного макроорганизма, то и в этом случае также наблюдаются сложные регуляторные и компенсаторные механизмы в единой целостной экологической системе, представленной с одной стороны самим макроорганизмом, а с другой — совокупностью его микробиоценозов. Функционирование этой системы обеспечивает в первую очередь преобладание в микробиоценозах аборигенной (резидентной) микрофлоры, а также приспособление к воздействию различных неблагоприятных факторов внешней среды. Как правило, в нормальных микробиоценозах происходит естественное вытеснение и подавление патогенной или условно-патогенной микрофлоры [22, 50, 97, 293]. При ослаблении иммунного статуса макр о организма, усилении влияния неблагоприятных внешних воздействий и других факторов защитная роль нормальной микрофлоры, колонизирующей кожные покровы, слизистые и полости организма человека может существенно изменяться.
Методы исследований
В исследованиях применяли общепринятые методы определения биологических характеристик микроорганизмов и приготовленных на их основе экспериментальных образцов препаратов [113, 177, 196, 226]. Рост микроорганизмов изучали в анаэробных условиях, когда суточную бульонную культуру засевали уколом в столбик среды. Образование аммиака, индола, сероводорода определяли с помощью индикаторных бумажек, помещенных под пробку пробирки с МПБ. Для определения гидролиза мочевины (наличие фермента уреазы) проводили посев на среду с мочевиной. Покраснение среды через 24 часа роста при температуре 37С свидетельствовало о наличии уреазы в культуре исследуемого штамма. Редукцию нитратов определяли по росту культуры в бульоне с нитратами в течение трех суток. В каждую пробирку с засеянным бульоном добавляли по 1,0 см3 реактива следующего состава: 0,50 г растворимого крахмала; 0,25 г иодида калия; 50,0 см3 дистиллированной воды; 50,0 см3 10%-ного раствора химически чистой серной кислоты. При восстановлении нитратов в нитриты наблюдали образование тем-носинего окрашивания. Гидролиз казеина изучали на молочном агаре. Культуры засевали на среду штрихом, инкубировали в течение 1-2 суток в термостате при температуре 37С, после чего наблюдали за появлением прозрачных зон гидролиза. Для изучения разложения тирозина культуры изучаемых штаммов инкубировали на питательной среде с тирозином. Агар с тирозином готовили следующим образом: 0,5 г L-тирозина суспендировали в 10,0 см3 дистиллированной воды, автоклавировали и смешивали со 100,0 см3 стерильного питательного агара. О разложении тирозина судили по исчезновению кристаллов тирозина в среде вокруг посевов. Гидролиз крахмала наблюдали при посеве культур на картофельный агар. Засеянный агар заливали раствором Люголя. Светлые зоны вокруг ко- лоний свидетельствовали о гидролизе крахмала. Для изучения продукции каталазы агаровую суточную культуру заливали 10 % раствором перекиси водорода. Образование пузырьков газа подтверждало наличие каталазы. С помощью реакции Фогес-Проскауэра устанавливали наличие в среде ацетоина, промежуточного продукта, образующегося при распаде глюкозы. Для постановки этой реакции культуры выращивали на среде Кларка в течение трех суток при температуре 37С. Затем 1,0 см3 культуральной жидкости переносили в пробирку и прибавляли 0,6 см а-нафтола (5% раствор в абсо-лютном спирте) и 0,2 см 40 %-ого раствора гидроксида калия. При положительной реакции через 5 мин наблюдается розовое окрашивание. Продукцию лецитиназы изучали в МПБ с яичным желтком.
При наличии лецитиназной активности появлялась беловатая муть и всплывающие хлопья. Для определения утилизации углеводов исследуемые культуры засевали в полужидкую питательную среду Омелянского с углеводами. При образовании кислоты из углеводов цвет среды изменялся с зеленого на жёлтый. Определение желатиназы проводили по методу, предложенному Вай-тилавичусом. Антагонистическую активность определяли на плотной питательной среде Гаузе методом отсроченного антагонизма по отношению к тест- штаммам в соответствии с существующими рекомендациями [176, 207]. Для этого исследуемый образец высевали штрихом по диаметру чашки Петри петлей диаметром (3,5±0,5) мм на подсушенную агаризованную среду Гаузе. После (72±4) ч инкубации при температуре (37±1)С перпендикулярно к выросшей культуре подсевали штрихом посевной материал тест-штаммов (микробная суспензия в 0,9%-ном растворе хлорида натрия суточной культуры 2-го пас-сажа с МПА в концентрации 5-10 кл.-см ). Через (18±4) ч инкубирования при температуре (37±1)С учитывали зоны угнетения роста тест-штаммов в миллиметрах. Контролем роста тест-штаммов служил их параллельный посев на чашки с той же средой без исследуемой культуры. Все экспериментальные исследования проводили в трех повторностях. Концентрацию КОЕ определяли путем высева серийных разведений культур на питательную среду Гаузе и последующего инкубирования посевов при температуре (36±1)С в течение (24±2) ч [176]. После инкубации проводили подсчет выросших колоний и вычисляли содержание живых бак-терий в 1 см препарата по следующей формуле: где, а - среднее количество колоний на одну чашку данного разведения (п+1) — количество разведений (с учетом высева 0,1 см культуры на одну чашку). Физико-химические свойства экспериментальных образцов изучали в соответствии с методиками, описанными в литературе [53-55]. Определение водородного показателя (рН) проводили с помощью рН-метра (тип И-115М) [55]. Коллоидную стабильность определяли по устойчивости образцов к центрифугированию [53]. С этой целью две пробирки вместимостью 25,0 см наполняли исследуемым препаратом на 2/3 объема и взвешивали. Затем их инкубировали в водяной бане (термостат) при температуре 42-45 С 20 мин, после чего центрифугировали при 100 об-с"1 в течение 10 мин. Образец считался стабильным, если после центрифугирования в пробирках наблюдали появление не более одной капли водной фазы. Испытание стабильности при замерзании-оттаивании проводили следующим образом: отмеряли 20,0 г препарата в прозрачный бюкс, который затем помещали в камеру на 5 ч при температуре минус 18 С.
После этого бюкс выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем визуально определяли стабильность исследуемого препарата на предмет расслоения. Этот же бюкс повторно помещали в камеру при температуре минус 18 С, но уже на более длительный срок - на 24 ч, после чего, как и в первый раз, выдерживали при комнатной температуре 2 ч, а затем визуально определяли стабильность препарата. Данный цикл проводили в третий раз, при этом исследуемый образец помещали в камеру на еще более длительный срок - на 72 ч, далее бюкс вынимали и оставляли на 2 ч при комнатной температуре, а затем определяли коллоидную стабильность препарата. Термостабильность исследуемых препаратов определяли по выделению водной фазы при нагреве до 40-42 С. Для этого три пробирки наполняли этими препаратами на 2/3 объема, следя за тем, чтобы не оставалось пузырьков воздуха, закрывали пробками и инкубировали при температуре 40-42 С 24 ч. Изучение безопасности исследуемых препаратов для лабораторных животных проводили в токсикологических исследованиях. Острую и хроническую токсичность определяли общепринятыми методами на белых мышах, морских свинках и кроликах [56, 64, 113, 116, 118, 159, 172]. В процессе экспериментальных исследований по оценке местных и общих реакций при нанесении испытуемых образцов препаратов на кожные покровы подопытных животных были использованы общеизвестные методики: «открытое поле», биохимические, микроморфологические и др. [25,117]. Исследование биохимических показателей сыворотки крови проводили по следующим показателям: - активность аминотрансфераз (АЛТ, ACT) - колориметрическим ди-нитрофенилгидразиновым методом по Райтману - Френкелю; - активность щелочной фосфатазы - методом конечной точки по Бес-сею, Лоури, Броку; - определение общего белка в сыворотке крови - биуретовым методом (метод Кингслея-Вейксельбаума); - содержание общего билирубина в сыворотке крови - модифициро- ванным методом Иендрашека-Грофа; - тимоловую пробу в сыворотке крови - по методу Хуэрго и Попперу; - содержание мочевины в сыворотке крови - по цветной реакции с ди-ацетилмонооксимом; - активность альфа-амилазы - методом Каравея. Патоморфологическое исследование органов животных; проводили после фиксации отобранного материала в 10% растворе формалина и последующего приготовления парафиновых срезов, окрашенных гематоксилин-эозином.
Экспериментальная оценка эффективности испытуемых препаратов
На первом этапе доклинических испытаний изучали острую и хроническую токсичность. Острую токсичность определяли на двух видах лабораторных животных (белые мыши и белые крысы) при различных путях введения: подкожном и местном (накожном). Препараты применяли однократно в концентрации -10 микробных клеток, содержащихся в объеме 0,5 см , и в концентрации, в 10 раз ее превышающей - 107 микробных клеток на 10 г массы животного (рекомендуемая разовая лечебная доза). В качестве контроля использовали животных, в отношении которых аналогично использовалась гелевая композиция без биокомпонента вводимая или наносимая в объеме 0,5 см . Продолжительность наблюдения за животными после введения препаратов составила 1 сутки. В процессе наблюдения за животными ежедневно фиксировали следующие показатели: общее состояние животных, двигательную активность, интенсивность -потребления корма и воды, изменение массы тела, а также регистрировали количество выживших или погибших животных. В таблице 14 представлены данные изучения острой токсичности новых лекарственных форм препарата Субтилакт для белых мышей. В результате изучения острой токсичности экспериментальных образцов пробиотических препаратов установлено что лабораторные животные во всех группах оставались живыми и признаков интоксикации у них не выявлено в течение срока наблюдения. В отношении других, контролируемых показателей животные подопытных групп не отличались от животных контрольных групп. Согласно полученным данным, можно отметить, что испытуемые препараты как и при используемой дозе равной 1 и 10 млн. микробных клеток на одно животное (рекомендуемая разовая лечебная доза), так и в случае увеличения дозы на один порядок, при исследуемых путях введения не оказы- вают токсического действия на экспериментальных животных (белые мыши). Аналогичные результаты бьши получены при испытании данных препаратов и на белых крысах. В этих исследованиях величины доз составляли 10-10 клеток. Таким образом, полученные результаты по изучению острой токсичности явились основанием для последующих исследований по оценке влияния испытуемых препаратов на лабораторных животных при их длительном применении (хроническая токсичность).
Хроническую токсичность препаратов изучали на белых мышах при их ежедневном накожном нанесении в концентрации 1 млн. микробных клеток в объеме 0,5 см3 на животное (подопытная группа) и гелевых композиций без биокомпонентов в том же объеме (контрольная группа) в течение 30 суток. Наблюдение за животными проводили в течение всего периода нанесения испытуемых образцов препаратов и последующих 7 суток, после прекращения аппликаций. На протяжении всего опыта животные находились под ежедневным наблюдением, при этом регистрировали потребление корма и воды, изменение массы и температуры тела, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек, поведенческие реакции, а также выживаемость (гибель) животных. Результаты изучения хронической токсичности испытуемых препаратов представлены в таблице 15. При наблюдении за поведением белых мышей после ежедневных аппликаций исследуемых препаратов не отмечено каких-либо отрицательных изменений. Внешний вид животных подопытной группы, состояние шерстного покрова, интенсивность потребления корма и воды не имели отличий от животных контрольной группы. Динамика изменения массы тела и температуры подопытных белых мышей за время наблюдения также практически не отличались от таковых для контрольных животных. В месте нанесения препаратов у всех групп экспериментальных животных отсутствовали гиперемия, отечность, шелушение, усиление капиллярного рисунка. Хроническую токсичность новых форм пробиотических препаратов изучали также и на белых крысах. Как и в предыдущем случае ни одно из лабораторных животных не заболело и не погибло. Величины используемых доз, вводимых каждому животному были выше и составляли 10-10 КОЕ Как на 1-е, так и на 14-е сутки макроскопическая картина внутренних органов подопытных животных была сравнима с органами контрольных животных. Не удалось также при микроскопическом исследовании определить наличие на все сроки наблюдения каких-либо патологоанатомических изменений во внутренних органах экспериментальных животных. Так, при вскрытии подопытных животных в головном мозге патоморфо-логических микроскопических изменений не обнаружено. Структура белого вещества не изменена. Микроциркуляторной патологии сосудов не выявлено, цитоархитектоника слоев нервных клеток не изменена (рис. 5,6). При микроскопическом! изучении сердца патоморфологических изменений не обнаружено. Волокна сердечной мышечной ткани без изменений (рис. 7,8). На срезах легочной ткани паренхима органа не изменена. Эпителий бронхов без дистрофических проявлений (рис. 9,10). В структуре почечной ткани также патологические изменения отсутствовали. Эпителий почечных канальцев и клубочков был без изменений (рис. 13,14). Иммунокомпетентные клетки селезенки без реактивных изменений. Белая и красная пульпа находилась в состоянии нормы. Сосудистые изменения не обнаруживались (рис. 15,16). Таким образом, изучение острой и хронической токсичности исследуемых препаратов свидетельствовало об отсутствии у них токсического действия на лабораторных животных.
Следует особенно подчеркнуть тот факт, что эти препараты не вызывали никаких признаков патологического воздействия на организм подопытных животных при различных способах введения в концентрациях, значительно превышающих рекомендуемые для их клинического применения. Результаты патоморфологических исследований органов и систем подопытных животных позволяют сделать заключение о том, что при изучении острой и хронической токсичности всех исследуемых экспериментальных образцов препаратов при различных путях введения патологических изменений не выявлено. Изучение местно-раздражающего действия проводили на кроликах. Было сформировано 4 группы животных, по 15 кроликов в каждой. У подопытных и контрольных групп животных на боковой поверхности была выстрижена шерсть на участках кожи площадью 4,0x4,0 см. Подопытным животным на подготовленный участок кожи однократно наносили исследуемый препарат, содержащий, в концентрации 109 микробных клеток в объеме 0,5 см3, а контрольным - гелевую композицию без биокомпонента в том же объеме. Оценку местного действия осуществляли на основании данных осмотра, проводимого после ежедневного (раз в сутки) нанесения препарата в течение 14 суток и последующих 7 суток наблюдения (без нанесения препарата), а также результатов гистологического исследования. Материал для гистологического исследования (ткани в месте нанесения препаратов) забирали через 24 ч после последней аппликации препарата и через 7 суток. После окончания курса аппликаций в последующие 7 суток после нанесения препарата и гелевой композиции по 5 животных из каждой группы умерщвляли глубоким эфирным наркозом и проводили макроскопическое исследование внутренних органов, а также отбирали материал (кожу) для гистологического исследования. Гистологические препараты готовили после фиксации исследуемого материала раствором 10 % нейтрального формалина и заливки в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Данные ежедневного осмотра свидетельствовали о том, что исследуемые препараты не оказывали местно-раздражающего действия при накожном нанесении: Так, на кожных покровах, в месте их нанесения у всех групп подопытных животных отсутствовали отечность, гиперемия, шелушение.
Биохимические исследования сыворотки крови лабораторных животных при оценке терапевтической эффективности испытуемых препаратов на основе Субтилакта в условиях моделирования локализованной гнойной инфекции кожи
Оценивали биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных групп животных в условиях моделирования локализованной гнойной инфекции кожи, вызванной S. aureus. Исследовали такие показатели как: 1. Активность аспартатаминотрансферазы (ACT), Ед-дм"; 2. Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), Ед-дм"; 3. Активность щелочной фосфатазы, Ед-дм"; 4. Содержание общего белка, г-дм"; 5. Содержание общего билирубина, мкмоль-дм"; 6. Тимоловая проба, ед. S-H; 7. Содержание мочевины в сыворотке крови, ммоль-дм 3; 8. Содержание альфа-амилазы в сыворотке крови, г-(ч-дм)". Забор материала для исследований (сыворотку крови) проводили на 1-е, 7-е и 14-е сутки после начала лечения экспериментальными образцами испытуемых препаратов на основе Субтилакта и левосином (контроль). Полученные экспериментальные данные влияния способов лечения на биохимические показатели сыворотки крови, при лечении инфицированных поражений кожи у экспериментальных животных представлены в таблице 24. Как видно из данных (табл.25), в группе подопытных животных с воспроизведенной моделью локализованной гнойной инфекции кожи (контроль - без лечения), по сравнению с контрольной (интактной) группой животных, на 1-е сутки эксперимента отмечалось повышение всех изучаемых биохими-ческих показателей сыворотки крови на фоне снижения концентрации общего белка сыворотки крови. Обращает на себя внимание выраженная азотемия, обусловленнаяувё- личением количества» мочевины в сыворотке крови до величины 1Г,9±0,4 ммоль-дм3. Активность трансаминаз - АЛТ, ACT возросла в небольшой степени. Показатель отношения АСТ/АЛТ существенно не изменялся. Активность щелочной фосфатазы также увеличивалась до величины 120;2±0;4 Ед дм;3. Тимоловая проба и количественное содержание амилазы в сыворотке крови существенно не изменялись. На 7-е и 14-е сутки эксперимента биохимические показатели сыворотки крови в контрольной группе экспериментальных животных (без лечения) постепенно; нормализовались до величин, полученных в группе интактных животных. На 1-е сутки после начала аппликации трех видов испытуемых гелевых препаратов на основе Субтилакта наблюдали значимое повышение активности трасаминаз, в большей степени в группе подопытных животных, получавших испытуемый препарат Субтилакт и KFF (АЛТ - 72,Г±5;5 Ед-дм"3, АСТ-58,9±4,3 Ед-дм"3). В этой же группе подопытных животных следует отметить и повышение показателя отношения AGT/АЛТ до величины 0:,81±0,041 Во всех группах, без исключения, отмечали повышение активности щелочной фосфатазы, в большей степени выраженное в группе животных, получавших препарат Субтилакт и КГГ (126,7±0,4 Ед-дм" ).
Выраженная азотемия отмечалась в группах подопытных животных, получавших испытуе-мые препараты Субтилакт и тизоль (12,6±0,5 ммоль-дм ) и препарат сравнения левосин (12,5±0,4 ммоль-дм"3). В группе животных, получавших испытуемый препарат Субтилакт и КГГ, концентрация мочевины была наименьшей (11,1±0,5 ммоль-дм"3). Гипопротеинемия в большей степени была выражена в группах подопытных животных, получавших препарат сравнения левосин (43,6±5,4 г дм"), и в группе животных, получавших препарат Субтилакт и тизоль (44,3±5,5 г-дм"). Менее выраженное снижение концентрации общего белка в сыворотке крови наблюдали в группе животных, получавших препарат Субтилакт и КГТ (48,3±5,6 г-дм"3), сравнимое с величиной, полученной в контрольной группе (без лечения) - 48,4±5,7 г-дм". На 7-е сутки, после начала лечения испытуемыми препаратами наблюдали нормализацию биохимических показателей во всех группах подопытных животных. Активность трансаминаз оставалась повышенной в группе животных, получавших препарат Субтилакт и КГГ, но показатель отношения АСТ/АЛТ снижался до нормальных величин - 0,73±0,05. Активность щелочной фосфатазы также оставалась высокой во всех подопытных группах животных, но в большей степени в группе животных, получавших препарат Субтилакт и КГГ - 116,2±0,4 Ед -дм"3. Гипоглобулинемия в меньшей степени была выражена в группе подопытных животных, получавших препарат Субтилакт и КГГ (61,8±5,5 г-дм"3). Повышенное содержание мочевины в сыворотке крови сохранялось во всех группах подопытных животных, получавших препараты на основе Суб-тилакта. В меньшей степени повышение концентрации мочевины наблюдали в группе животных, получавших препарат Субтилакт и КГГ - 8,6±0,6 ммоль-дм"3. На 14-е сутки наблюдения изменение биохимических показателей в группах подопытных животных, получавших испытуемые препараты, было сравнимо с изменением этих же показателей в группах животных, не получавших лечение, и в контрольной группе интактных животных. Концентрация билирубина в сыворотке крови подопытных животных не изменялась в течение всего опыта. Величина активности альфа-амилазы во всех группах экспериментальных животных также соответствовала полученным показателям в контрольной группы животных. Таким образом, исследование по оценке изменений биохимических показателей сыворотки крови при моделировании локализованной гнойной инфекции кожи выявило значимое снижение уровня общего белка и повышение концентрации мочевины во всех подопытных группах животных, что является, по- видимому, следствием подавления протеосинтетической функции печени из-за изменения процесса синтеза и ресинтеза протеинов, вследствие чего, и происходит прогрессирующее снижение общего количества белка в сосудистом русле и увеличение концентрации мочевины.
Явления гипопротеинурии и азотемии в большей степени были выражены в группе подопытных животных, получавших испытуемый препарат сравнения левосини Субтилакт и тизоль, и в меньшей степени, - в группе подопытных животных, получавших испытуемый препарат Субтилакт и KIT, что говорит о более выраженной терапевтической эффективности препарата, содержащего кремнийорганический глицерогидрогель. Также необходимо отметить значимое повышение активности транса-миназ - ACT, АЛТ, щелочной фосфатазы на 1-е сутки, с последующим снижением и их нормализацией на 7-е и 14-е сутки в группе подопытных животных, получавших препарат Субтилакт и КГГ, что может говорить также о определенном гепатотропном действии испытуемого препарата и его прямом или опосредованном влиянии на метаболическую функцию печени. Клеточный (неспецифический) иммунный ответ при оценке терапевтической эффективности испытуемых препаратов у животных с инфицированной S. aureus гнойной раной кожи определяли путем исследования таких показателей как: общий анализ крови; фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов, а также метаболической активности в НСТ-тесте; количество Т- и В-лимфоцитов (методом Е-розеткообразования); количество антителообразующих клеток. Забор крови для исследования проводили на 1-е и 7-е сутки после начала лечения инфицированных лабораторных животных экспериментальными образцами испытуемых препаратов. В таблице 26 представлены показатели общего анализа крови контрольных и подопытных групп животных с инфицированной гнойной раной при их лечении гелевыми препаратами. Как видно из представленных данных, у контрольной группы (без лечения) наблюдается двухкратное увеличение абсолютного количества лейкоцитов по сравнению с группой интактных животных. В опытных группах с применением Субтилакта и тизоля, Субтилакта и эфтидерма и препарата сравнения левосина количество лейкоцитов было в среднем 1,5 раза ниже, чем у контрольной группы нелеченных лабораторных животных. В опытной группе, где для лечения применяли Субтилакт и КІТ, на начальных сроках наблюдения отмечается некоторое увеличение количества лейкоцитов по сравнению с контрольной группой (без лечения) в 1,5 раза, но к 7-м суткам наблюдения количество клеток становится практически равным во всех опытных группах. Отмечается резкое повышение количества палочкоядерного звена нейтрофилов во всех опытных группах и контрольной группы (без лечения).
