Содержание к диссертации
Введение
1. Пути создания лекарственных веществ с рецепторными механизмами действия (обзор литературы) 15
1.1. Рациональные подходы к поиску фармакологических агентов 16
1.2. Рецепторы клеточной мембраны как мишень для создания лекарственных средств 19
1.3. Рецепторная активность производных бензимидазола 29
2. Поиск соединений, модулирующих активность мембранных метаботропных и ионотропных рецепторов, среди производных бензимидазола 35
2.1. Материалы и методы 35
2.2. Поиск модуляторов гистаминовых рецепторов 40
2.2.1. Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией гистаминовых Ні-рецепторов (Ні-антагонистическая активность) 40
2.2.2. Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией гистаминовых Н2-рецепторов (Нг-антагонистическая активность) 43
2.2.3. Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией гистаминовых Н3-рецепторов (Н3-агонистическая активность) 46
2.3. Поиск модуляторов серотониновых рецепторов 48
2.3.1. Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией серотониновых 5-НТ2-рецепторов (5-НТ2-антагонистическая активность) 48
2.3.2. Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией серотониновых 5-НТз-рецепторов (5-НТ3-антагонистическая активность) 52
2.4. Поиск модуляторов пуриновых р2-рецепторов 57
2.4.1. Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией
пуриновых P2Yi-рецепторов (P2Yi -антагонистическая активность) 57
2.5. Заключение 60
3. Структурно-функциональные отношения в ряду исследованных производных бензимидазола 64
3.1. Зависимость типа и выраженности рецепторнои активности от химической структуры исследованных соединений 65
3.1.1. Hi-антагонистическая активность 65
3.1.2. Н2-антагонистическая активность 66
3.1.3. Н3-агонистическая активность 67
3.1.4. 5-НТ2-антагонистическая активность 68
3.1.5. 5-НТз-антагонистическая активность 70
3.1.6. P2Y]-антагонистическая активность 71
3.1.7. Заключение 73
3.2. Зависимость типа и выраженности рецепторнои активности от физико-химических свойств исследованных соединений 74
3.2.1. Материалы и методы 74
3.2.2. Ні-антагонистическая активность 76
3.2.3. Н2-антагонистическая активность 76
3.2.4. Н3-агонистическая активность 79
3.2.5. 5-НТ2-антагонистическая активность 80
3.2.6. 5-ШУантагонистическая активность 80
3.2.7. P2Y]-антагонистическая активность 81
3.2.8. Заключение 82
3.3. Анализ функционально значимых структурных фрагментов веществ с различными типами рецепторнои активности 85
3.3.1. Материалы и методы 85
3.3.2. Структурные дескрипторы веществ, проявляющих Ні-антагонистическую активность 86
3.3.3. Структурные дескрипторы веществ, проявляющих Н2-антагонистическую активность 87
3.3.4. Структурные дескрипторы веществ, проявляющих Нз-агонистическую активность 88
3.3.5. Структурные дескрипторы веществ, проявляющих 5-НТ2-антагонистическую активность 89
3.3.6. Структурные дескрипторы веществ, проявляющих 5-НТ3-антагонистическую активность 89
3.3.7. Структурные дескрипторы веществ, проявляющих P2Yp антагонистическую активность 90
3.3.8. Заключение 91
3.4. Заключение 94
4. Фармакологические свойства производного бензимидазола с н2-антагонистической активностью 97
4.1. экспериментальное изучение антисекреторной активности соединения РУ-64 99
4.1.1. Материалы и методы 99
4.1.2. Влияние соединения РУ-64 на секрецию соляной кислоты в желудке лабораторных животных 101
4.1.3. Заключение 105
4.2. Экспериментальное изучение гастропротективной активности соединения РУ-64 106
4.2.1. Материалы и методы 106
4.2.2. Влияние соединения РУ-64 на развитие эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка лабораторных животных 108
4.2.3. Заключение 118
4.3. Фармакокинетические свойства соединения РУ-64 120
4.3.1. Материалы и методы 121
4.3.2. Фармакокинетические свойства соединения РУ-64 при внутривенном введении 122
4.3.3. Фармакокинетические свойства соединения РУ-64 при пероральном введении 126
4.4. Заключение 127
5. Фармакологические свойства производного бензимидазола с 5-НТ3-антагонистической активностью 131
5.1. Экспериментальное изучение антиэметической активности соединения РУ-63 133
5.1.1. Материалы и методы 134
5.1.2. Влияние соединения РУ-63 на дофаминовый эметогенез 135
5.1.3. Влияние соединения РУ-63 на выраженность цисплатиновой рвоты у собак 136
5.1.4. Заключение 138
5.2. Экспериментальное изучение анальгетической активности соединения РУ-63 138
5.2.1. Материалы и методы 139
5.2.2. Влияние соединения РУ-63 на периферический болевой синдром... 140
5.2.3. Влияние соединения РУ-63 на центральный болевой синдром 142
5.2.4. Заключение 143
5.3. Экспериментальное изучение анксиолитической активности соединения РУ-63 144
5.3.1. Материалы и методы 145
5.3.2. Влияние соединения РУ-63 на уровень тревожности крыс при моделировании «неконфликтного» поведения 146
5.3.3. Влияние соединения РУ-63 на уровень тревожности крыс при моделировании «конфликтного» поведения 149
5.3.4. Заключение 151
5.4. Заключение 151
6. Фармакологические свойства производных бензимидазола с P2y!-антагонистической активностью 154
6.1. Изучение влияния соединений РУ-286 и РУ-722 на агрегацию тромбоцитов и коагулографические показатели...
158
6.1.1. Материалы и методы 159
6.1.2. Влияние соединений РУ-286 и РУ-722 на агрегацию тромбоцитов 160
6.1.3. Влияние соединений РУ-286 и РУ-722 на показатели коагулограммы... 162
6.1.4. Заключение 163
6.2. Экспериментальное изучение антитромботических свойств соединений РУ-286 и РУ-722 165
6.2.1. Материалы и методы 166
6.2.2. Влияние соединений РУ-286 и РУ-722 на процесс тромбообразования in vitro 167
6.2.3. Влияние соединений РУ-286 и РУ-722 на артериальное тромбообразование 168
6.2.4. Влияние соединений РУ-286 и РУ-722 на развитие генерализованного тромбоза 172
6.2.5. Заключение 173
6.3. Заключение 173
7. Обсуждение 176
8. Выводы 205
Список литературы 208
Приложения 244
- Рецепторы клеточной мембраны как мишень для создания лекарственных средств
- Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией серотониновых 5-НТ2-рецепторов (5-НТ2-антагонистическая активность)
- Структурные дескрипторы веществ, проявляющих 5-НТ3-антагонистическую активность
- Влияние соединения РУ-64 на развитие эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка лабораторных животных
Введение к работе
Актуальность темы. Известно, что более половины всех зарегистрированных лекарственных средств, реализуют свой эффект посредством действия на рецепторы биологически активных веществ, в частности суперсемейства G-протеин сопряженных рецепторов (Cavasotto C.N. et al., 2003; Elefsinioti A.L. et al., 2004).
Потребность в новых эффективных и безопасных лекарственных средствах поддерживает повышенный интерес к поиску новых лигандов известных рецепторов (Закусов В.В., 1973; Аничков СВ., 1982; Вальдман А.В., Александровский Ю.А., 1987; Ковалев Г.В., Тюренков И.Н., 1989; Середенин СБ. и др., 1998, 2001; Харкевич Д.А., 1998; Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И., 1999; Елисеев В.В., Сапронов Н.С., 2000; Зефирова О. Н., Зефиров Н. С, 2001; Васильев П.М., Спасов А.А., 2006).
Исследования в области геномики, протеомики и биоинформатики позволили изучить структурные и функциональные особенности некоторых известных рецепторов, однако, до сих пор точно не выяснено строение функционально активных участков целого ряда мембранных рецепторных образований, а так же фармакофорных дескрипторов их агонистов и антагонистов (Сергеев П.В. Шимановский Н.Л., Петров В.И., 1999; Комиссаров И.В., 2001; Karchin R. et al., 2002; Kristen L. et al., 2002; Кубиньи Г., 2006).
Известно, что подавляющее количество веществ, селективно взаимодействующих с рецепторами биологически активных веществ, являются производными циклических азотсодержащих гетеросистем, к которым относятся производные бензимидазола. Так, например, описаны бензимидазолы - антагонисты гистаминовых Hi- (Cuberes M.R. et al., 1997; Kobayashi T. et al., 1998; Спасов А.А. и др., 2000, 2001), H2- (Katsura Y. et al., 1992; Nawrocka W., 1996), H3- (Мог M. et al., 2004; Rivara M. et al., 2006) и Щ-рецепторов (Terzioglu N. et al., 2004), парциальные агонисты серотониновых 5-НТіЛ- (Lopez-Rodriguez MX. et al., 2003, 2004), антагонисты 5-HT3- (Fujikawa M. et al., 2001; Venkataraman P., et al., 2002; Cooper M. et al., 2002; Lopez-Rodriguez M.L. et al., 2003, 2004), агонисты и антагонисты 5-НТ4-рецепторов (Lopez-Rodriguez M.L. et al., 2002, 2003; belong V. et al., 2003).
Наряду с данными литературы, результаты предварительных исследований также свидетельствуют, что производные бензимидазола обладают различными видами фармакологической активности, в том числе и рецепторно опосредованными. Учитывая вышесказанное, к производным бензимидазола вполне применимо определение «привилегированные структуры», введенное в научный оборот за последние несколько лет (Muller G., 2003; Kamal A. et al., 2006; Leach A.R. etal., 2006).
Данный факт позволяет считать актуальным дальнейшее изучение конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола на предмет взаимодействия с мембранными рецепторными структурами, относящимися к различным рецепторным семействам.
Таким образом, проблема поиска новых соединений, взаимодействующих с различными мембранными рецепторами биологически активных веществ и выявления струтурно-функциональных взаимоотношений у лигандов рецептор-ньгх структур, в настоящее время весьма актуальна и значимость ожидаемых результатов достаточно высока.
Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения». Тема утверждена на заседании Ученого Совета ВолГМУ (протокол № 10 от 14 апреля 2004 г.) и включена в план НИР.
Целью настоящего исследования является изучение способности производных бензимидазола к функциональному взаимодействию с мембранными рецепторами и обоснование возможности использования данных веществ для создания новых лекарственных средств.
Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:
1) поиск веществ, демонстрирующих агонистическую и антагонистическую активность к гистаминовым Нг, Н2- и Н3-рецепторам;
2) поиск веществ, демонстрирующих агонистическую и антагонистическую активность к серотониновым 5-НТ2- и 5-НТз-рецепторам;
3) поиск веществ, демонстрирующих агонистическую и антагонистическую активность к пуриновым Р2Угрецепторам;
4) анализ зависимости между химической структурой и функциональной активностью исследованных производных бензимидазола по отношению к различным типам рецепторов биологически активных веществ;
5) анализ зависимости между физико-химическими свойствами и функциональной активностью исследованных производных бензимидазола по отношению к различным типам рецепторов биологически активных веществ;
6) разработка рекомендаций по оптимизации направленного синтеза и поиска веществ, модуляторов функции рецепторов биологически активных веществ;
7) углубленное доклиническое изучение наиболее активных соединений на моделях in vitro и in vivo с целью обоснования перспективы создания на их основе новых лекарственных препаратов.
Научная новизна.
Впервые изучена способность 136-ти новых веществ, производных бензимидазола, взаимодействовать с рецепторами биологически активных веществ, относящихся к различным рецепторным семействам, и модулировать их функциональную активность на различных моделях in vitro и in vivo.
Проведен анализ зависимости между структурой, физико-химическими свойствами и функциональной активностью, в том числе и с использованием компьютерных технологий, выделены дескрипторы, определяющие влияние веществ из группы производных бензимидазола, на функции различных G-протеин сопряженных и ионотропных рецепторов биологически активных веществ.
Впервые изучены гастропротективные свойства конденсированного производного бензимидазола с Нг-антагонистической активностью под лабораторным шифром РУ-64, на модели геликобактероподобных повреждений слизистой оболочки желудка лабораторных животных.
Проведено доклиническое изучение фармакодинамических свойств конденсированного производного бензимидазола под лабораторным шифром РУ-63, проявившего выраженные антагонистические свойства по отношению к серотониновым 5-НТ3-рецепторам.
Выполнены доклинические исследования фармакодинамических свойств конденсированных производных бензимидазола под лабораторными шифрами РУ-286 и РУ-722, проявивших выраженные антагонистические свойства по отношению к пуриновым Р2Угрецепторам. Обоснована возможность создания новых антиагрегантных и антитромботических средств с принципиально новым механизмом антитромбоцитарного действия.
Научно-практическая значимость.
Результаты комплексного анализа химической структуры, физико-химических свойств исследуемых соединений и их способности модулировать функциональную активность гистаминовых Нь Н2, Н3, серотониновых 5-НТг, 5-НТз и пуриновых P2Yi-рецепторов, позволяют расширить представления о дескрипторах химических соединений, ответственных за функциональное взаимодействие с соответствующими рецепторами.
На основе результатов анализа зависимости между структурой и функциональной активностью исследованных соединений по отношению к гистаминовым Нь H2, Нз, серотониновым 5-НТ2, 5-НТз и пуриновым P2Yr рецепторам, разработаны рекомендации по направленному синтезу и поиску веществ, модуляторов функции вышеуказанных рецепторов, что позволит оптимизировать выявление новых субстанций с данными свойствами.
Результаты доклинического изучения соединения с Н2-антагонистической активностью под лабораторным шифром РУ-64, проявляющего выраженные антисекреторные и противоязвенные свойства, позволяют считать перспективным создание на его основе нового антисекреторного противоязвенного средства.
Результаты доклинического изучения соединения с 5-НТ3-антагонистической активностью под лабораторным шифром РУ-63, проявляющего выраженные противорвотные, транквилизирующие и обезболивающие свойства, свидетельствуют о перспективности создания на его основе средства для терапии цитотоксической рвоты, тревожных и аффективных расстройств и периферических болевых синдромов.
Результаты доклинического изучения соединений с P2Yp антагонистической активностью под лабораторными шифрами РУ-286 и РУ-722 проявляющих выраженные антиагрегантные и антитромботические свойства, позволяют рассматривать данные соединения в качестве основы для создания новых антиагрегантных и антитромботических средств.
Реализация результатов исследования.
Рекомендации, разработанные на основе выявленных закономерностей между соответствующими видами рецепторнои активности производных бензимидазола и их химической структурой, используются при синтезе новых веществ в НИИ фармакологии ВолГМУ, НИИ физической и органической химии Южного федерального университета.
Система методических подходов к изучению и анализу рецепторнои активности новых веществ применяется при проведении исследований в лаборатории экспериментальной фармакологии ВНЦ РАМН и АВО.
Результаты работы включены в лекционные курсы на кафедре фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, на кафедрах фармакологии Кубанского, Саратовского и Ростовского государственных медицинских университетов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Вещества, относящиеся к производным бензимидазола, а именно: N1- и N9- замещенным имидазо[1,2-а]бензимидазола, N1- и №-замещенным 2,3-дигидроимидазо[ 1,2-а] бензимидазола, Ы4-замещенным 1,2,4-триазоло[1,5-а] бензимидазола, ї -замещенньїм 2-аминобензимидазола, 2,5-замещенным бензимидазола и г г -замещенным 2-иминобензимидазолина, способны проявлять свойства лигандов гистаминовых Нг, Но- и Н3-, серотониновых 5-НТ2- и 5-НТ3-, а также пуриновых Р2Угрецепторов.
2. Наиболее перспективными для- дальнейшего изучения являются следующие группы дериватов бензимидазола: - для поиска новых веществ с Нг, 5-НТ2- и 5-НТз-антагонистической активностью - производные N9- имидазо[1,2-а]бензимидазола; для поиска новых веществ с Н2-антагонистическими свойствами - как производные №-имидазо[1,2-а]бензимидазола, так и - N4-l,2,4-триазоло[1,5-а]бензимидазола; для поиска новых веществ с Нз-агонистической активностью - все типы трициклических производных - N9-, N1- имидазо[1,2-а]бензимидазола и К4-1,2,4-триазоло[1,2-а]бензимидазола; для поиска новых веществ с P2Yj -антагонистическими свойствами - производные N1-имидазо[1,2-а]бензимидазола.
3. Соединение с Н2-антагонистической активностью под лабораторным шифром РУ-64 проявляет выраженные антисекреторные и противоязвенные свойства и является перспективной основой для создания нового антисекреторного противоязвенного средства.
4. Соединение с 5-НТз-антагонистической активностью под лабораторным шифром РУ-63 обладает выраженными противорвотными, транквилизирующими и обезболивающими свойствами, что позволяет считать его перспективной основой для создания лекарственных средств для терапии цитотоксической рвоты, тревожных и аффективных расстройств и периферических болевых синдромов.
5. Соединения с P2Yi-антагонистической активностью под лабораторными шифрами РУ-286 и РУ-722 проявляют выраженные антиагрегантные и антитромботические свойства, позволяющие рассматривать их в качестве основы для создания новых антиагрегантных и антитромботических средств.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на IX научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств: «Лекарства - человеку», Минск, Беларусь, 1999; Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии», Санкт-Петербург, 1999; 55-й и 56-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров, Пятигорск, 2000, 2001; Второй международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2001; Научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики», Курск, 2001; II Съезде Украинского общества нейронаук, Донецк, Украина, 2002; II Съезде Российского Научного Общества Фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии», Москва, 2003; Научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы фармакологии», Барнаул, 2003; 8h ECNP Regional Meeting Moscow Russia, 2005; 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва: ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова, 2006; Всероссийской конференции с международным участием «Новые информационные технологии в медицине», Волгоград, 2006; Третьей Международная конференция «Химия и биологическая активность азотсодержащих гетероциклов», посвященная памяти проф. А.Н. Коста, Черноголовка, 2006; XIV национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007; Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxocology and Pharmacology Integrating Internet Recources, Moscow, 2007; III Съезде Фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе 1 монография.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 267 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами, 32 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II-VI), обсуждения результатов (глава VII), выводов и приложения. Список литературы включает 72 отечественных и 294 иностранных источника.
Рецепторы клеточной мембраны как мишень для создания лекарственных средств
В качестве агонистов и антагонистов соответствующих типов рецепторов были использованы: гистамина дигидрохлорид (SIGMA, США), дима-прита дигидрохлорид (ICN Biomedicals, США), Я-(-)-а-метилгистамина дигидрохлорид (ICN Biomedicals, США), ацетилхолина хлорид (SIGMA, США), 5-гидрокситриптамина гидрохлорид (серотонина гидрохлорид) (SIGMA, США), ос-метил-5-гидрокситриптамина малеат (ICN Biomedicals, США), ди-натриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) («Реанал», Венгрия), дифенгидрамина гидрохлорид (SIGMA, США), циметидин (SIGMA, США), атропина сульфат (SIGMA, США), кетансерина тартрат (ICN Biomedicals, США), MDL 72222 (3-тропанил-3,5-дихлорбензоат)(1СЫ Biomedicals, США), Трописетрон (SIGMA, США), Basilen Blue (ICN Biomedicals, США).
Эксперименты выполнены на изолированных органах 486 половозрелых неинбредных морских свинок обоего пола - массой 450-550 г, а также образцах плазмы крови 28-ми кроликов породы «Шиншилла» массой 4,0 - 4,5 кг. Препараты изолированных органов и образцы крови были получены у ин-тактных животных, которые содержались в условиях вивария ВолГМУ с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96).
При исследовании влияния веществ на эффекты, опосредованные гис-таминовыми Нь Нг, Н3 и серотониновыми 5-НТз-рецепторами, регистрацию биологического ответа производили с использованием комплекса аппаратуры для работы на изолированных органах UGO BASILE (Италия): термостати-руемая ванночка, изотонический датчик типа 7006 и самописец Unirecord 7050.
При изучении влияния веществ на эффекты, связанные с активацией серотониновых 5-НТ2 и пуриновых P2Y]-рецепторов, использован лазерный анализатор малоуглового светорассеяния «Лайтскан» (Люмекс, Санкт-Петербург, Россия).
Нггисталшноблокирующую активность соединений определяли на изолированной подвздошной кишке морской свинки (Блаттнер Р. и др.., 1983) и оценивали по степени подавления спазмогенного эффекта гистамина в концентрации 1 10"6M. Время инкубации исследуемых веществ и препарата сравнения - селективного блокатора гистаминовых Hi-рецепторов дифен-гидрамина составляло 2 минуты.
Н2-гистаминоблокирующую активность оценивали на изолированном правом предсердии морских свинок (Black J.W.et al., 1972) по степени подавления положительного хронотропного эффекта селективного агониста H2-рецепторов димаприта в концентрации 1 10"6 М. Время инкубации исследуемых веществ и препарата сравнения — селективного антагониста гистаминовых Н2-рецепторов циметидина также составляло 2 минуты.
Влияние на гнстаминовые Нз-рецепторы изучали на изолированной тощей кишке морской свинки. При этом регистрировали степень подавления спазмолитического эффекта, оказываемого селективным агонистом гистаминовых Н3-рецепторов Я-(-)-а-метилгистамином в концентрации Зх10"8М, на электроиндуцированную сократительную реакцию (Vollinga R.S. et al., 1992). Стимуляцию электрическими импульсами (амплитуда 15±3 В, длительность импульса 0,5 мсек, прямоугольной формы, частота 0,1 Гц) производили при помощи электростимулятора ЭСЛ-2 (Россия). Время инкубации исследуемых веществ и препарата сравнения тиоперамида составляло 20 минут.
Ввиду того, что методика основана на подавлении Нз-агонистом выделения из нервных сплетений мышечной стенки тощей кишки ацетилхолина, первоначально была проверена М-холиноблокирующая активность всех соединений в концентрации 1 1(Г5М на модели спазма изолированной подвздошной кишки морской свинки, вызванного ацетилхолином в концентрции 1x10" М (Блаттнер Р. и др., 1983) при аналогичных условиях проведения эксперимента.
Изучение влияния на серотониновые 5-НТз-рецепторы проводили на изолированных атропинизированных предсердиях морских свинок (Nishio Н. et al, 1996). В качестве агониста серотониновых рецепторов использовали 5-гидрокситриптамин в дозе 1 10"6 М, а в качестве препаратов сравнения - селективные антагонисты серотониновых 5-НТ3-рецепторов - MDL-72222 (бе-месетрон) и трописетрон. Время инкубации исследуемых веществ и препаратов сравнения составляло 2 мин. Величину 5-НТз блокирующей активности оценивали по изменению степени выраженности положительного хроно-тропного эффекта, вызванного 5-гидрокситриптамином.
Влияние на серотониновые 5-НТ2 и пуриновые P2Yi-рецепторы исследовано на модели серотонининдуцированной активации тромбоцитов с использованием метода малоуглового светорассеяния (Деркачев Э.Ф. и др., 1998). Богатую тромбоцитами плазму получали из венозной крови краевой ушной вены кроликов, стабилизированной 3,2% раствором цитрата натрия. Конечная концентрация тромбоцитов не превышала 10 клеток/мл вследствие разбавления плазмы в трис-HCl буфере. Регистрацию сигнала осуществляли датчиком с угловыми координатами 10 градусов, при этом регистрировали прирост уровня сигнала определяемый как разница уровня светопропускания до и после внесения индукторов активации тромбоцитов — селективного агониста серотониновых 5-НТ2-рецепторов - а-метил-5-гидрокситриптамина в концентрации 1x10" Ми агониста пуриновых Р2-рецепторов - АДФ в кон-центрации 1x10" М. Время инкубации исследуемых веществ и препаратов сравнения - селективного 5-НТ2-антагониста — кетансерина и относительно селективного Р2У-антагониста - Basilen Blue составляло 2 минуты.
Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием парного критерия Стьюдента при предварительной проверке выборки на нормальность распределения. При расчете показателей рА22 и рА]03 использовали метод наименьших квадратов.
Изучение влияния веществ на эффекты, связанные со стимуляцией серотониновых 5-НТ2-рецепторов (5-НТ2-антагонистическая активность)
Понятие «фармакофор» согласно рекомендациям ШРАС определяется как: «совокупность пространственных и электронных особенностей, которые необходимы для обеспечения оптимальных супрамолекулярных взаимодействий со структурой специфической биологической мишени и приводящих в действие ее биологический отклик» (СИС «Химический ускоритель»).
Таким образом, при анализе способности тех или иных веществ, в данном случае исследованных производных бензимидазола и трициклических систем на его основе, модулировать определенный биологический ответ, пре--жде всего, необходимо детально рассмотреть взаимосвязь химической структуры каждого вещества, как в целом, так и отдельных его фрагментов, и степени выраженности конкретного вида активности. При этом представляется возможным выделить основные структурные дескрипторы, которые в случае исследования эффектов, опосредованных мембранными рецепторами различных семейств, предопределяют как собственно способность к проявлению рецепторнои активности, так и селективность к тому или иному типу рецептора, а также в ряде случаев направленность модулирующего воздействия. Кроме того, для уточнения выявленных структурно-функциональных зависимостей, необходим анализ некоторых физико-химических свойств (геометрических параметров, липофильности, величины зарядов) исследуемых соединений. И, наконец, в качестве завершающего этапа целесообразным представляется проведение фармакофорного анализа при помощи компьютерных технологий.
Как следует из таблицы 1, из 52-х исследованных на наличие Нг антагонизма веществ, у 42-х соединений (81%) была обнаружена соответствующая активность, различной степени выраженности, при этом лишь у 4-х веществ она была сопоставима с препаратом сравнения и может быть расценена как высокая.
Таким образом, соотношение высоко активных и неактивных соединений в целом составляет 1:2,4 (рис.1). Учитывая то, что среди бициклических производных, представленных ІЧГ -аминобензимидазолами, не обнаружено ни высоко активных веществ, ни полностью неактивных, а в группе трицикли-ческих производных бензимидазола 21% веществ оказался неактивным, а 9% соединений показали высокий уровень активности, ранее приведенное соотношение для совокупности трициклических производных практически не меняется и составляет 1:2,3. Однако, при дальнейшем изолированном рассмотрении N1- и №-ИМБИ обнаружено, что все высоко активные вещества расположены в группе №-производных и соотношение ВА:НА составляет 1:2, а в группе N1-производных это соотношение равно нулю.
Из полученных данных следует, что наиболее активной группой соединений, обладающих выраженными Ні-антагонистическими свойствами, оказались №-замещенные ИМБИ. Кроме того, более подробный анализ заместителей в различных положениях циклического ядра показывает, что абсолютно у всех высоко активных веществ в положении у второго атома углерода имеется галогензамещенный (моно или дизамещенный) фенил.
Исходя из данных, приведенных в таблице 2, из 30-ти исследованных на наличие Н2-антагонизма трициклических производных бензимидазола, у 25-и из них (83%) была обнаружена соответствующая активность, различной степени выраженности, при этом лишь у 2-х веществ она превышала таковую у препарата сравнения и, соответственно, может быть расценена как высокая. Соотношение высоко активных и неактивных соединений в целом также составляет 1:2,4 (рис.2).
Структурные дескрипторы веществ, проявляющих 5-НТ3-антагонистическую активность
Показатели уровня корреляционных зависимостей между Н3-агонистической активностью исследованных производных бензимидазола и их физико-химическими свойствами представлены в таблице 7.
Отрицательная корреляция между уровнем Н3-агонистической активности и геометрическими параметрами радикала у атома N9 может свидетельствовать о возможных пространственных затруднениях для молекул, имеющих большой размер ключевого для взаимодействия фрагмента, а именно заместителя у 9-го атома азота гетероциклического ядра, при позиционировании молекулы в рецепторном кармане. Сходная по направленности зависимость от липофильности радикала у N9 гетероциклического ядра указывает на то, что в отличие от Hi - и Н2-антагонистических свойств, для проявления Н3-агонистической активности, гидрофобные взаимодействия между лигандом и рецепторной молекулой не только не являются необходимыми, но и препятствуют функциональной активации гистаминового Н3-рецептора.
Данные корреляционного анализа между 5-НТ2-антагонистической активностью исследованных производных бензимидазола и их физико-химическими свойствами представлены в таблице 7.
Высокая отрицательная корреляция с максимальным положительным зарядом радикала у 3-го атома С гетероциклического ядра в сочетании с положительной корреляционной зависимостью от липофильности этого же заместителя, может говорить о том, что электростатическое взаимодействие с одноименно заряженными структурами рецепторнои молекулы приводит к затруднению позиционирования молекулы вещества в рецепторном кармане, и кроме того, о возможности гидрофобного взаимодействия радикала в данном положении с фрагментами рецепторнои молекулы с образованием дополнительной точки фиксации.
Позитивная зависимость от липофильности заместителя у 9-го атома азота гетероциклического ядра показывает, что именно радикал в данном положении участвует в формировании гидрофобных взаимодействий с рецепторнои молекулой. И напротив, отрицательная корреляция с липофильно-стью гетероциклического ядра указывает на его вероятную не вовлеченность в образовании гидрофобных связей.
Положительная корреляция между уровнем 5-НТ2-антагонистической активности и геометрическими параметрами ядра и радикала в положении N9 свидетельствует об отсутствии пространственных затруднений при взаимодействии с соответствующим рецептором (в пределах вариабельности размеров исследованных веществ) и о несколько лучшей стерической комплементарное молекул веществ с ключевыми фрагментами сайта связывания рецепторнои молекулы при относительном увеличении размеров как гетероциклического ядра, так и заместителя у атома N9.
Результаты корреляционного анализа между 5-НТ3-антагонистической активностью исследованных производных бензимидазола и их физико-химическими свойствами представлены в таблице 7.
Так же как и в случае с 5-НТ2-антагонистической активностью, положительная корреляция между уровнем 5-НТз-блокирующих свойств и геометрическими параметрами ядра и радикала в положении № свидетельствует об отсутствии пространственных затруднений при взаимодействия с соответствующим рецептором (в пределах вариабельности размеров исследованных веществ) и о несколько лучшей комплементарности молекул веществ с сайтом связывания при относительном увеличении размеров как гетероциклического ядра, так и заместителя у атома №.
Положительная корреляция с максимальным положительным зарядом гетероциклического ядра, сочетание положительной корреляции с максимальным положительным зарядом радикала в положении N9 и отрицательной - с максимальным отрицательным зарядом этого же радикала, свидетельствуют о том, что взаимодействие веществ изученной группы с 5-НТ3-рецептором, по всей видимости осуществляется за счет электростатических взаимодействий с несколькими точками рецепторного сайта. В этом, скорее всего, участвуют протонированный третичный атом азота в 1-м или 9-м положении гетероциклического ядра и также протонированный атом азота ал-киламинной цепи в положении N , взаимодействуя со структурными фрагментами рецепторной молекулы, несущими отрицательный заряд.
Коэффициенты корреляции, полученные при анализе P2Yr антагонистической активности исследованных производных бензимидазола и их физико-химических свойств, представлены в таблице 7.
Отрицательная корреляция умеренной степени выраженности с величиной молекулярной рефракции гетероциклического ядра может свидетельствовать о возможных пространственных затруднениях для молекул, имеющих большой размер ключевых для взаимодействия фрагментов, при пози-ционировании молекулы в рецепторном кармане, а негативная корреляция с максимальным положительным зарядом на г -радикале - о возникающих электростатических несоответствиях заместителей в ключевом для взаимодействия с данным рецептором положении.
Таким образом, сопоставление уровня биологической активности, опосредованной различными типами рецепторов, с некоторыми физико-химическими свойствами исследованных веществ, не только подтвердило структурно-функциональные закономерности, полученные на этапе полуколичественного анализа, но и позволило выявить дополнительные структурные фрагменты, не столь очевидные при полуколичественном анализе, но, по всей видимости, имеющие достаточно важное значение для проявления специфической биологической активности.
Кроме того, более подробное рассмотрение отдельных, статистически значимых корреляционных зависимостей, сделало возможным выдвинуть предположения относительно типа и характера возможных взаимодействий между структурными фрагментами веществ и соответствующими рецепторами.
Влияние соединения РУ-64 на развитие эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка лабораторных животных
Детальное рассмотрение 5-НТ2-антагонистов обнаружило, так же как и в случае с Нр и Нг-антагонистами, значимость углеродной цепочки с третичной аминогруппой, в том числе и соединенной с ароматической системой, а также, как в случае с Нг- и Н3-лигандами, пятичленного карбо- или гетероа-роматического цикла.
Согласно литературным данным, молекула 5-НТ2-рецептора, подобно другим рецепторам биогенных аминов, содержит остаток аспартата, локализованного в ТМIII. Исследования по точечному мутагенезу свидетельствуют, что взаимодействие между основным азотом лигандов и боковой цепью аспартата 155 в ТМ III, содержащего карбоксильную группу, приводит к «зая-кориванию» лиганда (Almaula N. et al., 1996; Roth B.L. et al., 1997; Kristiansen K. et al., 2000; Shapiro D.A. et al., 2000).
Кроме того, данные по точечному мутагенезу показывают, что высоко стабильные остатки ароматических аминокислот в ТМ VI и VII, также прямо участвуют в связывании лигандов. Эти остатки образуют гидрофобный карман, и принимают участие в связывании лигандов посредством %-п взаимодействий (Roth B.L. et al., 1997; Kristiansen К. et al., 2000; Shapiro D.A. et al., 2000).
QSAR-анализ 5-НТ3-лигандов выявил высокую значимость третичной аминогруппы и ароматических систем, причем в наиболее ярких случаях, как сочетание в виде третичной аминогруппы (возможно в составе цикла) и окси-группы ароматической системы, соединенных сопряженной углеродной цепочкой.
Полученные результаты полностью согласуются с данными литературы, которые свидетельствуют, что ключевыми требованиями для 5-НТз антагонистов являются: ароматическая/гетероароматическая группа, промежуточная группа, содержащая карбоксил, и основный амин (Mahesh R. et al., 2004).
В случае P2Yi-антагонистов, наиболее значимыми фрагментами оказались либо оксидруппа либо оксогруппа, но не азотсодержащий фрагмент. Немногочисленные доступные литературные данные так же не указывают на роль азотсодержащих групп в связывании лигандов с Р2Уі-рецептором. Напротив, в связывании лиганда участвуют в первую очередь положительно заряженные аминокислотные остатки в ТМ III, ТМ IV и ТМ VII. К ним относятся аргинин в положениях 128 и 310, а также серии 314 (Jiang Q. et al., 1997).
При сопоставлении данных, полученных при проведении рутинного анализа «структура-активность», сопоставления физико-химических и фармакологических свойств соединений, а также сравнительного QASR-анализа известных лигандов соответствующих рецепторов и исследованных веществ, были выявлены и уточнены некоторые общие и частные закономерности между химическим строением и рецепторной активностью производных бензи-мидазола.
Так, к числу общих закономерностей можно отнести обязательное присутствие в структуре веществ, способных взаимодействовать с катионными рецепторами биогенных аминов - гистамина и серотонина, азотсодержащего структурного дескриптора. В четырех случаях из шести это третичная аминогруппа, соединенная углеродной цепочкой с ароматической системой. Данный фрагмент характерен для веществ с активностью по отношению к гиста-миновым Нр, Н2- и серотониновым 5-НТг-, 5-НТ3-рецепторам. Еще одним азотсодержащим фрагментом, характеризующим вещества с подобной активностью, является иминогруппа, в том числе и в составе пятичленного ге тероароматического цикла. Она весьма характерна для веществ с активностью по отношению к гистаминовым Н2-, Н3- и серотониновым 5-НТ2-рецепторам. Кроме того, для всех групп соединений общим является наличие гетероциклической ароматической системы, что, однако, представляет собой характерную черту подавляющего числа веществ с различными видами биологической активности. В отличие от соединений, влияющих на аминергические рецепторные структуры, для веществ с антипуринергической активностью, то есть модулирующих активность нуклеотидных рецепторов, азотсодержащий структурный дескриптор не является необходимым для проявления данного вида ре-цепторной активности, а в качестве наиболее функционально значимого структурного фрагмента определяется оксогруппа либо оксигруппа, присоединенные к сопряженной углеродной цепочке произвольной длины. Среди достаточно четких закономерностей более частного характера, представляется необходимым отметить специфичные для веществ с Нг антагонистической активностью фрагменты, состоящие из атома галогена (хлора или брома), соединенного с ароматической системой углеродной цепочкой или атома хлора, непосредственно присоединенного к шестичленному карбо- или гетероциклу. В дополнение к выявленным структурно-функциональным зависимостям, описанным выше, отдельно хотелось бы отметить наиболее перспективные (в пределах изученных нами би- и трициклических типов производных) для дальнейшего изучения группы дериватов бензимидазола: - для поиска новых веществ с Нг, 5-НТ2- и 5-НТз-антагонистической активностью - производные ]М9-ИМБИ: - для поиска новых веществ с Н2-антагонистическими свойствами - как производные №-ИМБИ, так и - М4-1,2,4-триазоло[1,5-а]бензимидазола; - для поиска новых веществ с Нз-агонистической активностью - все ти пы трициклических производных - N9-, N -ИМБИ И 1чГ4-1,2,4-триазоло[1,2-а]бензимидазола; - для поиска новых веществ с P2Yj-антагонистическими свойствами -производные Ї -ИМБИ. Таким образом, обнаружение в рядах производных бензимидазола веществ, способных изменять функциональную активность различных рецепторов биологически активных веществ, как G-ПСР (гистаминовых Hi, Н2, Н3, сертониновых 5-НТ2 и пуриновых P2Yi), так и ионотропных (серотониновых 5-НТз) рецепторов, позволяет в полной мере соотнести класс производных бензимидазола с категорией «привелигированных структур».
![Местнообезболивающая активность производных индола и имидазо[1,2-а]бензимидазола в сочетании с вискоэластиком визитоном-ПЭГ при эпибульбарной и внутрикамерной анестезии глаза](/i/i/4711/548429.png "Местнообезболивающая активность производных индола и имидазо[1,2-а]бензимидазола в сочетании с вискоэластиком визитоном-ПЭГ при эпибульбарной и внутрикамерной анестезии глаза Киселев Александр Владимирович")
