Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Общая характеристика и номенклатура лиганд-управляемых каналов нейрональной мембраны .16
1.2. Ионотропные рецепторы глутамата .19
1.3. Ионотропные рецепторы ГАМК .49
1.4. Ионотропные пуринорецепторы P2X .71
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .88
2.1. Изоляция нейронов 88
2.2. Изготовление микропипеток и растворы для регистрации .93
2.3. Идентификация клеток 95
2.4. Экспериментальная установка для регистрации токов от изолированных нейронов 98
2.5. Ход эксперимента .99
2.6. Система для быстрой аппликации растворов 100
2.7. Обработка данных .102
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Модуляторы постсинаптических глутаматных рецепторов .103
3.1.1. Модуляция глутаматных рецепторов NMDA типа гистамином и спермином 104
3.1.2. Механизмы блокады NMDA рецепторов такрином .122
3.1.3. Роль NMDA каналов в эффектах некоторых нейропротекторов 129
3.1.4. Функциональные свойства глутаматных рецепторов AMPA типа в разных популяциях нейронов 135
3.2. Модуляторы ГАМКА рецепторов .155
3.2.1.Влияние -карболина абекарнила на активность ГАМКА рецепторов 155
3.2.2. Модуляция ГАМКА рецепторов ионами меди и цинка .164
3.2.3. Механизмы действия блокаторов хлорных каналов на ГАМКА рецепторы .178
3.2.4. Модуляция ГАМКА рецепторов нестероидными противовоспалительными средствами из группы фенаматов .196
3.3. Свойства пуринорецепторов P2X 232
3.3.1. Фармакологические свойства пуринорецепторов .236
3.3.2.Влияние ионов металлов на активность пуринорецепторов .242
Заключение .261
Выводы 265
Список цитированной литературы .268
- Ионотропные рецепторы ГАМК
- Изготовление микропипеток и растворы для регистрации
- Модуляция глутаматных рецепторов NMDA типа гистамином и спермином
- Механизмы действия блокаторов хлорных каналов на ГАМКА рецепторы
Ионотропные рецепторы ГАМК
Лиганд-управляемые каналы (Ligand-gated ion channels - LGICs) представляют собой интегральные мембранные протеины, содержащие пору, что позволяет осуществлять селективную регуляцию потока ионов через плазматическую мембрану. Открывание канала происходит после связывания нейротрансмиттера, который запускает конформационные изменения, результатом которых является проводящее состояние канала. LGICs опосредуют быструю (в миллисекундном диапазоне времени) синаптическую передачу в нервной системе и в нервно-мышечных соединениях, однако экспрессия некоторых LGICs в невозбудимых клетках позволяет предполагать у них и дополнительные функции. По характеру вызываемых эффектов LGIC можно разделить на возбуждающие и тормозные. К числу возбуждающих LGIC относят катион-селективные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Millar and Gotti, 2009), 5-HT3 рецепторы (Barnes et al., 2009), ионотропные глутаматные (Lodge, 2009) и P2X рецепторы (Jarvis and Khakh, 2009). К числу тормозных относят анион-селективные ГАМКА (Olsen and Sieghart, 2008) и глициновые рецепторы (Lynch, 2009). Никотиновые ацетилхолиновые, 5-HT3, ГАМКА и глициновые рецепторы (а также цинк-активируемые каналы) представляют собой пентамеры и часто обозначаются как Cys-петельные рецепторы из-за стабильного наличия у всех представителей этого семейства характерной Cys-петли, образованной дисульфидной связью между двумя цистеиновыми (Cys) остатками в экстраклеточном домене образующих их субъединиц (Рисунок 1). Ионотропные рецепторы глутамата являются тетрамерами, а P2X рецепторы – тримерами (Рисунок 1). Субъединицы LGICs кодируются большим числом генов, и большинство из этих рецепторов являются гетеромультимерами. Комбинации разных субъединиц приводят к образованию большого числа рецепторов с разными фармакологическими и биофизическими свойствами внутри каждого класса LGICs и разнообразному паттерну их экспрессии в нервной системе, что делает эти рецепторы привлекательной мишенью для создания новых терапевтических агентов, способных избирательно взаимодействовать с разными изоформами рецепторов и лишенных побочных эффектов.
Быстрое накопление сведений о новых рецепторах и образующих их субъединицах привело к использованию разнородной терминологии, порождающей разночтения в этой области. В этой связи по рекомендации Номенклатурного комитета Международного общества фундаментальной и клинической фармакологии (The International Union of Pharmacology Committee on Receptor Nomenclature and Drug Classification - NC-IUPHAR) была разработана номенклатура лиганд-управляемых каналов, рекомендуемая к использованию (Collingridge et al., 2009). Эти авторы разработали систематическую номенклатуру индивидуальных субъединиц, образующих эти рецепторы, и рецепторов, образуемых объединением этих субъединиц. Авторами разработаны также критерии, которые помогают в решении вопроса о том, какие из большого числа возможных гетеромерных комбинаций субъединиц, которые могут быть собраны в системах гетерологичной экспрессии in vitro, существуют или могут существовать как функциональные рецепторы in vivo. Эта номенклатура используется в большинстве случаев и в данной работе.
Представление о глутамате как возбуждающем передатчике в ЦНС млекопитающих начало складываться в 1950-х годах. Было обнаружено возбуждающее действие L-глутамата и других кислых аминокислот на нейроны спинного мозга (Curtis et al., 1959). В настоящее время общепризнано, что L-глутамат является основным медиатором для осуществления быстрой возбуждающей синаптической передачи между нейронами позвоночных (Dingledine et al., 1999). Исследования с применением новых фармакологических инструментов, проведенные в 1970 х годах, выявили заметную гетерогенность глутаматных рецепторов. В настоящее время в семействе глутамат-активируемых катионных каналов (ионотропных глутаматных рецепторов) выделяют три основных подсемейства, классифицированных на основании их разной чувствительности к наиболее селективным агонистам: АМРА рецепторы, селективным агонистом которых является -амино-3-гидрокси-5-метил-4 изоксазолпропионовая кислота (-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 isoxazolepropionic acid - AMPA), каинатные (КА) рецепторы и NMDA рецепторы, активируемые N-метил-D-аспартатом (N-methyl-D-aspartate NMDA) (см. Обзоры Dingledine et al., 1999; Barnes and Slevin, 2003; Mayer and Armstrong, 2004). Однако следует отметить, что АМРА рецепторы активируются также каинатом. Позже было обнаружено, что выделенные на основании фармакологических свойств семейства рецепторов кодируются разными семействами генов.
Все эти рецепторы активируются глутаматом, проницаемы для катионов, и их активация приводит к деполяризации мембраны. Ионотропные рецепторы глутамата широко представлены в ЦНС, где они выполняют различные функции. Они участвуют в быстрой синаптической передаче и играют ведущую роль в формировании синапсов, их поддержании и в различных формах синаптической пластичности (Malenka and Bear, 2004; Turrigiano and Nelson, 2004). Кроме того, дисфункция этих рецепторов вызывает развитие различных как острых, так и хронических неврологических нарушений.
Ионотропные рецепторы глутамата представляют собой интегральные мембранные белки, состоящие из четырех больших субъединиц ( 900 аминокислотных остатков), которые образуют пору канала. Сходство аминокислотных последовательностей всех известных субъединиц глутаматного рецептора, включая АМРА, каинатные, NMDA и дельта рецепторы, позволяет предположить, что они имеют общую архитектуру (Рисунок 2). Субъединицы глутаматного рецептора имеют модульную организацию и состоят из четырех дискретных полуавтономных доменов: экстраклеточного аминотерминального домена (amino4erminal domain -ATD), экстраклеточного лиганд-связывающего домена (ligand-binding domain - LBD), трансмембранного домена (transmembrane domain - TMD) и внутриклеточного карбокситерминального домена (carboxylerminal domain -CTD) (Рисунок 2 А). За исключением CTD и сегмента М4, каждый из этих доменов имеет гомологию с бактериальными пептидами известной структуры и, в некоторых случаях, сходными функциями (O Hara et al., 1993; Wo and Oswald, 1995; Wood et al., 1995; Paas, 1998; Kuner et al., 2003). Детальная кристаллографическая структура была описана для встроенной в мембрану части тетрамерного глутаматного рецептора (Sobolevsky et al., 2009), а также для изолированных доменов ATD и LBD, закристаллизованных в комплексе с различными агонистами, антагонистами и модуляторами.
Изготовление микропипеток и растворы для регистрации
Имеются также данные о наличии двух популяций ГАМКА рецепторов с различными кинетическими свойствами в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа: медленные экстрасинаптические рецепторы, которые преобладают во фрагментах мембран, изолированных из сомы и отвечающих на аппликацию экзогенной ГАМК, и быстрые синаптические рецепторы, которые генерируют быстрые постсинаптический токи (IPSCs) (Banks et al., 2000; Semyanov et al., 2004; Farrant and Nusser, 2005). Заряд, переносимый при тонической активации ГАМКА рецепторов, может более чем в три раза превосходить заряд, переносимый при фазическом торможении, даже когда частота фазических разрядов велика (Hamann et al., 2002). Вполне вероятно, что 4-рецепторы могут быть, по крайней мере, частично ответственны за экстрасинаптическое торможение в этих клетках (Adkins et al., 2001). Данные о том, что тоническая проводимость в некоторых случаях может усиливаться под действием бензодиазепинов (Yeung et al., 2003), указывают на то, что тоническое торможение может также опосредоваться рецепторами, содержащими -субъединицу. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что входы от разных нейронов используют разные рецепторы, которые локализованы в различных частях рецептивных нейронов (Klausberger et al., 2002).
Субъединичная композиция рекомбинантных ГАМКА рецепторов. Исследования на рекомбинантных рецепторах позволили показать, что в зависимости от субъединиц, используемых для трансфекции клеток, образуются рецепторы с различающимися фармакологическими и электрофизиологическими свойствами. Некоторые субъединицы ГАМКА рецептора, такие как -субъединицы, устойчиво образуют гомоолигомерные рецепторы (Enz and Cutting, 1998). Каналы, образованные этой субъединицей, обладают свойствами, описанными ранее для ГАМКС рецепторов. Обнаружено, что гомоолигомерные рецепторы могут быть образованы также 1- или 3-субъединицами, однако вероятность образования этих рецепторов, по-видимому, низка (Connolly et al., 1996). Данные о способности других субъединиц формировать гомоолигомерные рецепторы противоречивы (Sieghart and Ernst, 2005), и можно предположить, что гомоолигомерные рецепторы, образованные этими субъединицами, не играют существенной физиологической роли.
В большинстве систем гетерологической экспрессии каналы, образованные из двух различных субъединиц, образуются более эффективно, чем гомоолигомерные каналы, и могут быть активированы более низкими концентрациями ГАМК. Кроме того, вход ионов хлора, вызываемый в гетероолигомерных каналах, выше, чем в гомоолигомерах (Sieghart, 1995). Эффективность образования рецепторов, по-видимому, зависит от комбинации субъединиц и используемой системы экспрессии. Так, -субъединицы способны формировать не только гомоолигомерные, но и гетероолигомерные рецепторы с другими -субъединицами. Хотя первоначально полагали, что -субъединицы не способны объединяться с другими классами субъединиц ГАМКА рецепторов, данные полученные позже, показали, что -субъединицы могут образовывать ансамбль с 2-субъединицами и возможно также с субъединицами глицинового рецептора и формировать функциональные рецепторы, обладающие свойствами, сходными со свойствами рецепторов, обнаруженных в сетчатке, стволе мозга, гиппокампе и других областях мозга (Sieghart and Ernst, 2005). Хотя -и -субъединицы легко образуют гетероолигомерные рецепторы в системах гетерологической экспрессии, дополнительное наличие - или -субъединиц приводит к тому, что преимущественно формируются рецепторы, образованные из - или -субъединиц соответственно (Sieghart, 1995; Sieghart and Ernst, 2005). Таким образом, в настоящее время не ясно, действительно ли в мозге в естественных условиях существуют рецепторы, образованные из -субъединиц.
Выраженная экспрессия ГАМКА рецепторов происходит, когда коэкспрессируют -, - и - субъединицы в гетерологических системах, и только -, - и -субъединицы формируют ГАМКА рецепторы с фармакологическими свойствами, сходными со свойствами нативных рецепторов (Sieghart, 1995). Это свидетельствует о том, что большинство нативных рецепторов образовано из -субъединиц. В меньшем числе рецепторов -, - и -субъединицы, по-видимому, способны заместить -субъединицу в ГАМКА рецепторах, в то время как -субъединица способна заместить -субъединицу в этих рецепторах.
Усилия нескольких групп исследователей были направлены на выявление стехиометрии -рецептров. Большинство этих исследователей сходятся в мнении о том, что эти рецепторы содержат две -, две - и одну -субъединицу (Sieghart and Sperk, 2002; Sieghart et al., 2011). Полученные на рекомбинантных рецепторах данные указывают на то, что рецепторы, содержащие две различные -субъединицы, могут формироваться и обладают свойствами, отличными от свойств рецепторов, содержащих только один тип -субъединицы. Другие исследования указывают на то, что свойства формирующегося рецептора зависят от того, какая -субъединица соседствует с -субъединицей (Sieghart and Sperk, 2002). Кроме того, была показана возможность формирования рецепторов, содержащих два различных типа -субъединиц вместе с одним типом - и -субъединиц, обладающих свойствами, отличными от свойств рецепторов, содержащих только один тип -субъединицы (Sieghart and Sperk, 2002).
Субъединичная композиция нативных ГАМКА рецепторов. В отличие от систем гетерологической экспрессии, субъединицы в мозге не обязательно экспрессируются в одно и то же время или имеют одну и ту же субклеточную локализацию. Кроме того, в мозге экспрессия управляется предпочтительными объединениями субъединиц, что в большинстве случаев приводит к образованию рецепторов с определенной стехиометрией. Это уменьшает гетерогенность рецепторов и лежит в основе детерминированности композиции рецепторов, реально формирующихся в мозге.
Модуляция глутаматных рецепторов NMDA типа гистамином и спермином
Блокада NMDA каналов производн ыми амилорида . Как уже указывалось ранее, интерес к антагонистам NMDA рецепторов связан с возможным их использованием в клинической практике для защиты нейронов от гибели при ишемии и гипоксии, а также как противосудорожных агентов. Однако многие известные неконкурентные антагонисты, такие как кетамин, декстрометорфан и фенциклидин обладают галлюциногенными свойствами и вызывают другие нежелательные побочные эффекты. В связи с этим понятен интерес к поиску новых антагонистов NMDA рецепторов, не обладающих перечисленными нежелательными свойствами. Возможно, что такие препараты могли бы быть созданы на основе амилорида, являющегося блокатором Na+/H+ обмена и используемого в клинической практике в качестве диуретика. Одним из производных амилорида является препарат этилизопропил амилорид (ethylisopropil amiloride – EIPA), который примерно в 100 раз более эффективно, чем амилоид блокирует Na+/H+ обмен в клетках эукариот (Vigne et al., 1983). Для выявления возможной роли Na+/H+ обмена в механизмах отсроченной гибели нейронов при глутаматной токсичности в работе Андреевой с соавт. (Andreeva et al., 1992) исследовали влияние EIPA на гибель нейронов, вызываемую воздействием глутамата. В связи с тем, что активация Na+/H+ обмена усиливает вход ионов натрия в клетку, что, в свою очередь, может приводить к возрастанию обмена цитозольного Na+ на наружный Ca2+, авторы полагали, что блокада Na+/H+ обмена может препятствовать длительному повышению концентрации внутриклеточного кальция. Действительно, в работе Андреевой с соавт. (Andreeva et al., 1992) было показано, что EIPA в микромолярных концентрациях значительно ослабляет отсроченную гибель культивируемых нейронов, вызываемую добавлением 50 мкМ глутамата в культуральную среду, не содержащую магния. Однако в проводившихся параллельно электрофизиологических исследованиях авторы обнаружили, что нейропротекторные эффекты EIPA, по-видимому, связаны не только с блокадой Na+/H+ обмена, но и с прямой блокадой NMDA рецепторов этим препаратом. В настоящей работе был проведен дальнейший анализ блокирующего действия EIPA на ионные токи через NMDA каналы (Воробьев и др., 1992).
Как и в описанных выше сериях экспериментов, эти исследования проводили на пирамидных нейронах гиппокампа, свежеизолированных из срезов гиппокампа с помощью метода вибродиссоциации. NMDA токи активировали аппликацией L-аспартата (50 мкМ) в безмагниевом растворе в присутствии 0.5-2 мкМ глицина. EIPA апплицировали вместе с растворами агонистов. Блокирующие эффекты EIPA наблюдали, начиная с концентрации 2 мкМ, и при дальнейшем увеличении концентрации блокирующие эффекты усиливались. EIPA блокировал как пиковый (IP), так и стационарный компоненты тока (IS), однако при всех концентрациях EIPA пиковая величина тока снижалась в меньшей степени, чем его стационарный компонент в конце первой секунды аппликации аспартата. При концентрации EIPA 10 мкМ величина IP снижалась до 62.5±5.5%, а IS – до 46.6±3.9% от контроля (n=5) (соотношение IP/IS = 1.34±0.03) При поддерживаемом потенциале -90 мВ полублокирующая концентрация (IC50) для пика составляла 15±3 мкМ, а для плато – 6.2±1.1 мкМ (n=6). Блокирующие эффекты EIPA имели выраженный потенциалозависимый характер: блок был более выражен при отрицательных поддерживаемых потенциалах и ослаблялся при сдвиге потенциала в сторону деполяризации. Такой характер зависимости блокады ионного канала от мембранного потенциала указывает на локализацию места связывания блокатора в поре ионного канала. По приблизительным оценкам, полученным при использовании модели Вудхул (Woodhull, 1973), EIPA в участке связывания испытывает на себе влияние 20-30% электрического поля мембраны.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что уменьшение ионных токов через NMDA каналы при наружном воздействии на нейрональную мембрану EIPA является результатом прямого блокирующего действия этого соединения на открытые NMDA каналы. Входя в наружное устье NMDA канала, молекула EIPA достигает участка связывания, расположенного в поре канала, с тем большей вероятностью, чем более отрицателен внутриклеточный потенциал нейрона. Более выраженное угнетающее действие EIPA на стационарный уровень тока указывает на возможное усиление процессов десенситизации под действием этого препарата. Эффекты EIPA были избирательны к токам, связанным с активацией NMDA рецепторов – токи, вызываемые АМРА или каинатом, практически не менялись под действием 20-30 мкМ EIPA.
Мы обнаружили, что блокаду NMDA токов способны вызывать и другие производные амилорида – бензамил, бутил-амилорид и гексаметилен-амилорид. Эффективность и характер блокирующего действия этих соединений были примерно такими же, как и у EIPA, хотя кинетика изменений ответов несколько отличались. Так, при действии 10 мкМ бензамила величина IP снижалась до 68.1±14 %, а IS – до 30.3±4.7% от контроля (n=5) (соотношение IP/IS = 2.4±0.03), при действии 10 мкМ бутил-амилорида величина IP снижалась до 68.5±4.0%, а IS – до 51.7±4.9 % от контроля (n=5) (соотношение IP/IS = 1.35±0.09), при действии 10 мкМ гексаметилен-амилорида величина IP снижалась до 73.3±3.4%, а IS – до 43.3±3.9% от контроля (n=5) (соотношение IP/IS = 1.7±0.12).
Таким образом, поученные данные свидетельствуют о том, что производные амилорида, являющиеся ингибиторами Na+/H+ обмена, способны также блокировать токи через NMDA каналы, что дает возможность использовать эти соединения в качестве основы для синтеза новых производных, обладающих большей избирательностью к NMDA рецепторам и способных проникать через гематоэнцефалический барьер.
Влияние клотримазола на NMDA токи. Клотримазол является антимитотическим препаратом, действующим путем ингибирования стерол-14-деметилазы, цитохром Р-450-зависимого энзима (Vanden Bossche et al., 1989; Yoshida and Aoyama, 1987). Показано также, что клотримазол может взаимодействовать с большим числом ионных каналов и транспортных систем. Так, описано ингибирующее действие клотримазола на Са2+-зависимые К+ каналы в эритроцитах (Alvarez et al., 1992), кальциевые каналы L-типа (Fearon et al., 2000) и показана активация клотримазолом TRPV1 и TRPA1 каналов в системах гетерологичной экспрессии (Meseguer et al., 2008). Важно подчеркнуть, что клотримазол способен модулировать транспорт ионов Сa2+ в разных типах клеток и взаимодействовать с внутриклеточными Са-зависимыми процессами. В связи с тем, что избыточный вход Са2+ в нейроны лежит в основе повреждения нейронов при гипоксии/ишемии и эксайтотоксичности (Choi, 1985), а клотримазол может модулировать транспорт ионов кальция и Ca2+-зависимые внутриклеточные процессы, мы предположили, что клотримазол может обладать нейропротекторными свойствами и исследовали его эффект на модели депривации по кислороду и глюкозе и глутаматной токсичности на культивируемых нейронах гиппокампа и мозжечка (Isaev et al., 2002).
В опытах на культивируемых нейронах гиппокампа и клетках-зернах мозжечка обнаружили, что предварительная обработка культур 10 мкМ клотримазола уменьшает гибель нейронов, вызываемую кислородо-глюкозной депривацией и эксайтотоксической эффект глутамата. Поскольку было показано, что на обеих моделях ишемии дегенерация нейронов происходит в результате избыточной активацией NMDA рецепторов, мы исследовали возможное прямое влияние клотримазола на NMDA рецепторы.
Механизмы действия блокаторов хлорных каналов на ГАМКА рецепторы
Медь является одним из важнейших незаменимых элементов, необходимых для живых организмов. Она входит в состав многих ферментов, таких как цитохромоксидаза, тирозиназа, аскорбиназа и др. Медь присутствует в системе антиоксидантной защиты организма, являясь кофактором фермента супероксиддисмутазы, участвующей в нейтрализации свободных радикалов кислорода. Показано, что ионы меди играют важную роль в нормальном функционировании мозга (см. обзор Gaier et al., 2013), где ее уровень выше, чем в других органах (Hui et al., 1977).
Однако при повышении содержания меди, связанном с наследственным нарушением обмена меди и белков, развивается заболевание, известное как болезнь Вильсона-Коновалова (Иванова-Смоленская, 2006; Das and Ray, 2006; Pfeiffer, 2007). Это заболевание связано с мутацией, приводящей к снижению концентрации в крови белка-переносчика меди церулоплазмина. Значение церулоплазмина заключается в том, что он удерживает медь в крови в связанном состоянии. При нарушении синтеза церулоплазмина увеличивается содержание в крови меди, не связанной с церулоплазмином, и она начинает откладываться в органах и тканях – печени, почках, головном мозге, поджелудочной железе и др. Накопление меди подавляет активность сульфгидрильных групп окислительных ферментов, нарушает тканевое дыхание, гликолиз и оказывает токсическое влияние на головной мозг (Attri et al. 2006, de Bie et al., 2007).
Во время синаптической передачи ионы меди (Cu2+) высвобождаются вместе с медиатором, и их концентрация в синаптической щели может достигать сотен микромолей (Kardos et al., 1989). Концентрация свободной меди в нормальных условиях значительно ниже, и составляет десятки наномолей (Hopt et al., 2003). Повышение содержания меди, связанное с болезнью Вильсона-Коновалова, приводит к развитию неврологических симптомов, включая дистонию, дизартрию, тремор, атаксию (Das and Ray, 2006; Taly et al., 2007) и когнитивные нарушения (Kodama et al., 2011). В настоящем разделе диссертационной работы было исследовано влияние низких (наномолярных) концентраций ионов меди на ГАМК-активируемые токи (Sharonova et al., 1998). В этой серии экспериментов для приготовления растворов использовали воду и соли высокой очистки. В этих условиях были исследованы все эффекты экзогенно вводимых ионов меди (концентрационные зависимости и эффекты хелаторов).
Эту серию экспериментов мы проводили на изолированных клетках Пуркинье. ГАМКА рецепторы в большинстве экспериментов активировали аппликацией ГАМК в концентрации 2 мкМ. Для исследования влияния ионов меди на ГАМК-активируемый ток использовали две формы аппликации Cu2+ – ко-аппликацию с ГАМК в течение 1 с и введение ионов металла в перфузирующий раствор. Мы обнаружили, что короткая ко-аппликация 10-200 нМ Cu2+ с 2 мкМ ГАМК не вызывает каких-либо изменений ГАМК ответов (n=5). Подавление ответов при этой форме аппликации начинали наблюдать лишь при концентрации Cu2+ 1 мкМ и выше. Введение же этих концентраций меди в перфузирующий раствор вызывало необратимое падение амплитуды ответа. В то же время введение ионов меди в концентрации 10-200 нМ в перфузирующий раствор приводило к дозо-зависимому и обратимому уменьшению амплитуды ГАМК-активируемых токов. По-видимому, ионы меди способны подавлять ГАМК рецепторы посредством разных механизмов в зависимости от концентрации.
При введении в перфузирующий клетку раствор, блок ионами меди обнаруживался уже при концентрации ионов металла 10 нМ и возрастал при увеличении концентрации Cu2+ (Рисунок 52 А). Плумаксимальная блокирующая концентрация (IC50) составляла 35±4 нМ, коэффициент Хилла 1.5±0.3 (n=4-8) (Рисунок 52 Б). Максимальный блок, достигавшийся при 200 нМ Cu2+, составлял 0.68±0.04.
Время, необходимое для развития блока, зависело от концентрации Cu2+ и составляло 0.5-1 мин при концентрации Cu2+ 200 нМ и 5-10 мин при концентрации 10 нМ. Восстановление ответов на ГАМК после окончания аппликации Cu2+ превышало 5 мин. Таким образом, время, необходимое для тестирования одной концентрации Cu2+, достигало 10 мин. Поскольку на таком протяжении времени трудно контролировать амплитуду ответа, для облегчения отмыва использовали короткие аппликации хелатора, что ускоряло восстановление ответа и позволяло контролировать возможную контаминацию ионами металлов (Рисунок 54 Г).
Для выявления механизмов блокирующего действия ионов меди исследовали зависимость этого эффекта от концентрации ГАМК (Рисунок 53). Эту серию экспериментом проводили с использованием внутриклеточного раствора с низким содержанием ионов хлора, чтобы избежать возможных искажений, связанных с большим падением потенциала 167 на регистрирующем электроде при аппликации высоких концентраций ГАМК. Кривые доза-ответ для ГАМК строили в контроле и в присутствии 100 нМ Cu2+ в перфузирующем растворе (Рисунок 53 Б). В контрольных условиях амплитуда ГАМК-активируемых токов возрастала при увеличении концентрации ГАМК от 1 до 50 мкМ (Рисунок 53 A). В присутствии 100 нМ Cu2+ наблюдали сдвиг вправо кривой доза-ответ и небольшое снижение амплитуды максимального тока. Поскольку при концентрации ГАМК выше 50 мкМ происходила сильная десенситизация ответов на ГАМК, данные нормировали к амплитуде ответа, вызываемого 50 мкМ ГАМК. В контроле величина EC50 для ГАМК составляла 7.2±0.4 мкМ и коэффициент Хилла 1.7±0.1. Во время аппликации 100 нМ меди в перфузирующий раствор величина EC50 для ГАМК составляла 12.7±3.4 мкМ, коэффициент Хилла 1.7±0.3 (n=4-8; p 0.05 для величины ЕС50). Рисунок 53. Зависимость эффектов Cu2+ от концентрации ГАМК. (A) Ответы на 2, 5, 10 и 50 мкМ ГАМК в контроле (токи, имеющие большую амплитуду) и в присутствии 100 нM Cu2+ (записи меньшей амплитуды). Все записи получены от одного нейрона. Момент аппликации ГАМК показаны горизонтальными чертами над записями токов. (Б) Сдвиг вправо кривой доза-ответ для ГАМК в присутствии 100 нМ Cu2+. Точки на графике – усреднение по 8 клеткам для контроля () и для 4 из этих клеток в присутствии 100 нМ
Как уже упоминалось, описываемый блок ГАМКА рецепторов ионами меди легко устранялся при использовании хелаторов ионов металла. Поскольку этот эффект может иметь значение для регуляции этого блока как в нормальных условиях работы мозга, так и при лечении некоторых заболеваний, мы исследовали эффекты хелаторов боле детально. Одним из эндогенных хелаторов меди является гистидин. Эта аминокислота образует с Cu2+ комплексы с высокой константой стабильности (log K=10.4) (O Sullivan, 1969). Гистидин был выбран еще и потому, что он не взаимодействует с какими-либо каналами нейрональной мембраны. Когда 10 мкМ гистидина апплицировали вместе с ГАМК в присутствии 100 нМ Cu2+ в перфузирующем растворе, наблюдали восстановление подавленного ответа в течение 5 с (Рисунок 54 Г). При использовании более низких концентраций гистидина восстановление ГАМК ответа развивалось медленнее. Так, при концентрации гистидина 0.2 мкМ для восстановления ответа требовалось около 10 с. Эффект гистидина можно было наблюдать не только при его ко-апплицикации с ГАМК, но тогда, когда 10-с аппликация гистидина предшествовала активации ГАМКА рецептора и заканчивалась за 1с до аппликации ГАМК (Рисунок 54 B). Для исследования эффектов хелаторов такая форма предпочтительней, поскольку не требует длительной активации ГАМКА рецептора, которая может вызывать десенситизацию рецептора, и позволяет избежать прямого взаимодействия ГАМК с хелатором.
