Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Фармакология ноотропных препаратов 9
1.2. Цереброваскулярные и нейродегенеративные расстройства и их фармакологическая коррекция 18
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Изучение влияния веществ на обучение 34
2.1.1. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином 35
2.1.2. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком 35
2.2. Методика обучения условной реакции активного избегания (УРАИ), в условиях модели челночная камера 36
2.3. Исследование анксиолитических и анксиогенных свойств новых веществ 36
2.3.1. Методика конфликтной ситуации 36
2.3.2. Методика приподнятого крестообразного лабиринта 37
2.4. Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности в условиях методики открытое поле 37
2.5. Оценка миорелаксантных свойств 38
2.5.1. Исследование нарушения координации движений в тесте вращающегося стержня. 38
2.5.2. Оценка миорелаксации в тесте подтягивание на горизонтальной перекладине
2.5.3. Тест залезания на сетку 38
2.6. Оценка неврологического дефицита 38
2.7. Оценка противогипоксического эффекта 39
2.7.1. Изучение противогипоксического эффекта на модели гипобарической гипоксии в барокамере 39
2.7.2. Изучение противогипоксического эффекта на модели гемической гипоксии .40
2.7.3. Изучение противогипоксического эффекта на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме 40
2.8. Моделирование интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) 40
2.9. Методика моделирования холинергического дефицита у крыс 41
2.10. Определение содержания моноаминов в мозге животных 42
2.11. Морфологические исследования 43
Результаты исследования
ГЛАВА 3. Поиск веществ с ноотропной активностью 44
3.1. Изучение производных 4-фенилпирролидона 44
3.1.1. Изучение антиамнестического эффекта новых соединений 46
3.1.2. Изучение влияния веществ на обучение УРАИ 52
3.1.3. Исследование противогипоксического эффекта производных 4- фенилпирро-лидона 53
3.1.4. Изучение общего спектра фармакологической активности производных пирролидона 54
3.2. Исследование ингибиторов пролилэндопептидазы 58
3.2.1. Изучение антиамнестических свойств веществ 58
3.2.2. Исследование анксиолитической активности ингибиторов пролил -эндопептидазы 61
3.2.3. Исследование общего спектра фармакологической активности ингибиторов пролилэндопептидазы 64
3.2.4. Изучение нейрохимического механизма действия ИФ 8 65
3.3. Изучение новых соединений с заданными свойствами (по программе PASS). 69
3.3.1. Антиамнестический эффект соединений 71
3.3.2. Изучение противогипоксической активности новых соединений на моделях гипобарической и гемической гипоксии 75
ГЛАВА 4. Изучение нейропротекторных свойств соединений 79
4.1. Исследование эффективности веществ на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) 79
4.1Л. Исследование неврологического дефицита и гибели крыс с ГИ 81
4.1.2. Изучение особенностей поведения и памяти крыс с геморрагическим инсультом 86
4.1.3. Морфологические исследования (морфоконтроль) 92
4.2. Изучение влияния веществ на поведение и память крыс с дефицитом холинергической системы 97
4.2.1. Влияние веществ на обучение УРАИ 97
4.2.2 Изучение влияния веществ на обучение УРПИ крыс с дефицитом холинергической системы 101
4.2.3. Влияние веществ на эмоциональное состояние и анксиогенез у крыс с дефицитом холинергической системы в условиях методики ПКЛ 102
Заключение 105
Выводы 116
Список литературы
- Цереброваскулярные и нейродегенеративные расстройства и их фармакологическая коррекция
- Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком
- Изучение антиамнестического эффекта новых соединений
- Изучение особенностей поведения и памяти крыс с геморрагическим инсультом
Введение к работе
Актуальность темы: В последние годы в связи с ростом числа заболеваний, протекающих с нейродегенеративными изменениями и сопровождаемых нарушениями когнитивных функций (инсульты, сенильные деменции, в том числе болезнь Альцгеймера, старческое слабоумие, травмы мозга, интоксикации, инфекционные поражения центральной нервной системы) осуществляется активный поиск новых эффективных препаратов с ноотропным и нейропротективным действием. Одним из наиболее распространенных методов поиска является модификация структуры пирацетама (родоначальника группы ноотропов), путем изменения размеров цикла, строения боковой цепи, заместителей при экзоциклическом азоте (Воронина Т.А., 2000; Gumine, 1987), поиск среди антагонистов NMDA (Chazot and Hawkins, 1999; Brauner-Osborne, 2000; Hatton, 2001) и AMPA (Filial et. al., 1998; Brauner-Osborne, 2000) рецепторов глутаматергической системы, модуляторов AMPA рецепторов (ампакины) (Раевский К.С., 2002; Ingvar et. al., 1997; Hampson, 1998), среди лигандов мускариновых и никотиновых рецепторов холинергической системы (Levin, 1998; Eglen, 2001; Lachowicz et. al., 2001). Исследуются вещества, влияющие на различные стадии глутамат - кальциевого каскада, вызванного инсультом (Скворцова В.И., Гусев Е.И., 2001; Takasago et. al., 1998; Danbolt, 2001; Floyd et. al., 2002), в том числе антагонисты глутаматергической системы, блокаторы кальциевых каналов L-ти па (Taya et. al., 2000; Cano-Abad et. al., 2001; Bogaert et. al., 2001), ингибиторы кальций -активируемых нейрональных протеиназ (Wang and Yuen, 1994; Kinloch et. al., 1999), ингибиторы цитокинов (Kinloch et. al., 1999), вещества, влияющие на нейротрофил ингибирующий фактор (Yiang et. al, 1999) и др.
В ГУ НИИ фармакологии в течение ряда лет осуществляется поиск веществ с ноотропным и церебропротективным типом действия (Середенин СБ., Воронина Т.Л 2000). Найдены эффективные вещества среди производных пирролидона, пептидных аналогов пирацетама, ингибиторов пролилэндопептидазы, производных 3-оксипиридина, аминокислотных производных оксиникотиноилуксусной кислоты, и ряда других химических соединений. (Воронина Т.А., 2000; Гудашева Т.А. и соавт., 2002; Островская Р.У. и соавт., 1994; Середенин СБ., Воронина Т.А 2000). Внедрен в клиническую практику антиоксидант мексидол, обладающий ноотропной, анксиолитической и нейропротективной активностью (Дюмаев К.М. и соавт., 1994; Воронина Т.А., 2002). На стадии клинических испытаний находятся препараты нооглютил (Воронина Т.А. и соавт., 1992; Гарибова Т.Л., 2000) и дипептид ноопепт (Ostrovskaya et.al, 1994; Gudasheva, Voronina, Ostrovskaya, 1996).
Последнее десятилетие для отбора наиболее перспективных потенциальных лекарственных препаратов используются разнообразные компьютерные программы. В частности с помощью QSAR, 3D молекулярного моделирования, методов молекулярного сходства и кластеризации успешно прогнозируют биологическую активность химических соединений. Одной из таких программ является PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) (Авидон B.B., 1974; Поройков B.B. и соавт., 1996; Hansen, 1993; Brown et. al„ 1996; Lagunin, 2000; Douglas et. al., 2001). Прогноз компьютерной системы PASS основан на анализе взаимосвязей «структура-активность» (structure-activity relationships - SAR) с использованием обучающей выборки, содержащей большое количество разнородных химических соединений с различными видами биологической активности (более 1000 видов, включая основные фармакологические эффекты, механизмы действия и нежелательные свойства -мутагенность, канцерогенность, тератогенность и др.). Будучи обученной, PASS позволяет прогнозировать спектры биологической активности для новых веществ по их структурным формулам. С помощью программы PASS и биологической оценки, выявлены вещества с противоязвенным, антигипертензивным и ангиотензивным эффектами (Мартынова Н.Б. и соавт., 2000; Филимонов Д.А., 2000; Лагунин А.А, 2001).
Методология изучения фармакологической активности потенциальных ноотропов и нейропротекторов хорошо разработана и включает исследование влияния веществ на обучение и память, в том числе нарушенные различными факторами; гипоксии; состояния, вызванные экспериментальными ишемическими нарушениями и травмами мозга, холинергическим дефицитом и другие (Воронина Т.А., 2000; Мирзоян Р.С., 2000; Voronina, 1994; Smith et al., 1997; Camps, 2002). Между тем, у большинства экспериментальных моделей имеются существенные недостатки, в связи с этим представляется целесообразным разработка новых методов исследования. Особенно сложно моделирование геморрагических повреждений мозга, так как они приводят к высокой летальности животных, а используемые в эксперименте субарахноидальные геморрагии, не всегда адекватны патологиям, наблюдаемым у людей с интрацеребральными геморрагиями (Choi, 1995; Hickenbottom et. al., 1998).
Целью настоящей работы является поиск веществ с ноотропной и нейропротективной активностью при использовании традиционных методов и аналитической компьютерной программы.
Были поставлены следующие задачи:
Осуществить поиск веществ с антиамнестическим и противогипоксическим действием среди новых N-алкильных и N-ацильных производных 4-фенилпирролидона и ингибиторов пролилэндопептидазы;
Исследовать ноотропную активность веществ с высокой прогностической активностью полученных с использованием программы PASS;
3. Разработать систему тестов оценки нарушений функций ЦНС при
нейродегенерации, вызванной интрацеребральной посттравматической гематомой
(геморрагическим инсультом);
Изучить нейропротективный эффект наиболее перспективных соединений на модели геморрагического инсульта;
Исследовать свойства веществ на модели нейродегенеративной патологии, вызванной дефицитом холинергической системы;
Провести изучение эффектов нооглютила на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы и холинергического дефицита.
Научная новизна исследования: Модификация молекулы 4-фенилпирролидона, путем введения N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с антиамнестическим эффектом в 45% случаев. Наиболее высокой антиамнестической и противогипоксической активностью обладает соединение под шифром ГИЖ 283 - N-алкильное производное 4-фенилпирролидона-2 (анилид-2-оксо-4-фенил-пирролидин-1-уксусной кислоты).
Впервые показана высокая прогностическая значимость компьютерной программы PASS, для поиска веществ с ноотропной активностью. Показано, что из 14 синтезированных соединений, различной структуры, с выявленным при использовании PASS высоким уровнем вероятности наличия ноотропной активности (Pi<05), 12 веществ (85,7 %) обладают антиамнестическими свойствами на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином. При этом 56 % соединений удовлетворяли жесткому критерию оценки антиамнестического эффекта — достоверному увеличению процента животных с полным сохранением памятного следа.
Разработан новый методический подход к оценке поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, вызванной деструкцией мозговой ткани в области capsula interna. Показано, что наиболее значимыми и отчетливыми нарушениями являются изменение неврологического
статуса, ослабление процессов обучения, памяти и гибель животных; при этом
динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения. Выявлены новые соединения (AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8% которые введенные однократно через 4 часа после операции обладают способностью уменьшать гибель, ослаблять неврологические дефициты, улучшать процессы обучения и памяти у животных с ИПГ, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте. По своей активности новые соединения не уступают, а в некоторых случаях и превышают действие нимодипина.
На модели нейродегенеративных нарушений, вызванных дефицитом холинергической системы (субхроническое введение скополамина) показана способность новых соединений (ГИЖ 283, ИФ 8) улучшать когнитивные функции и устранять тревожность животных.
Впервые показано, вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ8. Вещество в дозе 1 мг/кг (ноотропной) увеличивало содержание 5-ОИУК, а в дозе 5 мг/кг (анксиолитической) снижал уровень метаболита.
Впервые показано, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях патологий: интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы, вызванной повторным введением скополамина.
Научно-практическая значимость работы; В результате проведенного исследования выявлены новые перспективные соединения, различной структуры (ГИЖ 283, ИФ 8, AG 4а, AG 4b), обладающие антиамнестическими свойствами. Методика оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой позволяет оценить комплекс патологических изменений возникающих у животных после операции и может применяться для разработки и создания современных лекарственных средств, эффективных при лечении повреждений мозга. Получены данные, расширяющие показания для клинического применения нооглютила.
Цереброваскулярные и нейродегенеративные расстройства и их фармакологическая коррекция
Нарушение интегративных функций ЦНС возникает в результате различных повреждений коры головного мозга, в частности, при ишемических и геморрагических инсультах (инфарктах мозга), травмах, сопровождающихся стойким очаговым морфологическим дефектом мозговых структур. При этих формах патологий мозга деструктивные изменения являются главенствующими, приводящими к выпадению функций вследствие перерыва функциональных связей, повреждения и дезинтеграции существующих физиологических систем (Романова Г.А., 2002).
Инсульт - сосудистое поражение мозга, обусловленное или недостаточным кровоснабжением (ишемический инсульт) или кровоизлиянием в над- и подоболочечные пространства мозга (геморрагический инсульт) (Нурмухаметов Р., 1999; Парфенов В.А., 2001; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Robinson., 1998). Церебральные инсульты представляют наиболее частые заболевания головного мозга особенно в зрелом и пожилом возрасте. Распространенность инсультов в мире 460 - 560 случаев на 100 тыс. населения в год. Среди экономически развитых стран этот показатель наиболее высок в Японии - 569 случаев на 100 тыс. в год, а самый низкий - в Великобритании и Скандинавских странах - 355 - 365, в России он составляет 1050. Частота вновь выявленных случаев ОНМК колеблется от 100 до 200 на 100 тыс. населения в год. Среди индустриально развитых стран этот показатель наиболее высок в Японии - 213, а самый низкий - в Канаде, Франции, Дании - 120 125. Уровень смертности от ОНМК в разных странах колеблется в достаточно больших пределах. В 1990 году в странах Восточной Европы он составил 200 - 250 на 100 тыс. населения, а в странах Западной Европы 100 на 100 тыс. населения. В среднем, в экономически развитых странах с 1970 года происходит ежегодное понижение уровня смертности от ОНМК на 7 %. Например, в США в течение последних 10 лет смертность при этом виде патологии снизилась на 50 %. Подавляющее большинство случаев геморрагических инсультов приходится на зимние месяцы - 41 %, а ишемических - на январь, март и май. Наиболее уязвимыми днями недели оказались понедельник, вторник и пятница, наиболее спокойными воскресенье и четверг. Ишемический инсульт чаще всего начинался в первую половину суток - до 76 % случаев. Начато же геморрагического инсульта наиболее часто отмечалось с 12.00 до 18.00 (56 %). Местом начала ишемического инсульта чаще всего являлся дом пациента (77 % случаев), геморрагического - улица, дом (по 34 %), и работа (28 %) (Скоромен Л.А., Ковальчук В.В., 1997). В России ежегодно возникает около 400 тысяч инсультов, среди которых ишемические составляют 70-80% случаев, кровоизлияние в мозг - 20 - 25% случаев, субарахноидальное кровоизлияние — 5% случаев (Виленский Б.С., 1999; Гусев Е.И., Гехт А.Б., 2000; Верещагин Н.В., 1997; Гусев Е.И., Скворцова В.И, 2001; Фишер М., 2001; Парфенов В.А., 2000). В течение первого месяца, по данным разных авторов, умирает 15 - 30 % больных ишемическим инсультом и 30-70% больных геморрагическим инсультом, поэтому через месяц в живых остается в среднем 65-80% больных инсультом (Adams, 1997). Исходя из этого, количество больных, перенесших инсульт (или выживших в течение первого месяца заболевания), составляет в России ежегодно около 300 тысяч человек (Парфенов В.А., 2001).
Инсульт возникает либо вследствие разрыва сосудов головного мозга (кровоизлияние в мозг, геморрагический инсульт), либо их обструкции (инфаркт мозга, ишемический инсульт). Последняя форма встречается значительно чаще, по некоторым данным почти в 80 — 85 % всех случаев мозгового инсульта. Основными причинами ишемического инсульта являются атеросклероз, а чаще атеротромбоз магистральных артерий или пенетрирующих артерий головного мозга (лакунарный инсульт) и тромбоэмболия, по происхождению как кардиогенная (тромботические массы из полостей и клапанов сердца), так и артериальная (брахиоцефальный бассейн и дуга аорты), при которой эмболом могут быть фрагменты атеросклеротической бляшки. Атеротромбоз и артерио-артериальная эмболия составляют около 50 % причин ишемических нарушений мозгового кровообращения (Карпов Ю.А., Сорокин Е.В., 2002; Парфенов В.А., 2002).
Существует множество способов классификации широкого спектра поражений, именуемых инсультом. С одной стороны, цереброваскулярное нарушение может пониматься, как анатомически - патологический процесс изменений кровеносных сосудов. Такая классификация будет включать длинный список патологий: нарушения вызванные инфекциями, болезнями соединительной ткани, неопластическими процессами, гематологическими изменениями, процессами связанными с фармакологическими и травматическими изменениями. Классификация инсультов может базироваться и на механизме, посредством которого эти сосудистые патологические процессы проявляются. Например, влиянии системной гипертензии и атеросклероза на эластичность больших артерий и целостность сосудистых просветов, образовании продуктов ишемии в органах - мишенях (накопление в клетках продуктов перекисного окисления липидов, глутамата и т.д.) (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Robinson, 1998).
Механизмы повреждающего действия ишемии головного мозга достаточно хорошо изучены и описаны в ряде монографий (Верещагин Н.В., 1997; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Котов СВ., 2001; Парфенов В.А., 2002; Robinson, 1998). Известно, что при острой локальной ишемии головного мозга вокруг участка с необратимыми изменениями формируется зона, кровоснабжение которой ниже уровня, необходимого для нормального функционирования, но выше критического порога необратимых изменений - «ишемическая полутень» или пенумбра (penumbra). Размер инфаркта и последующая клеточная реакция (нейрональные нарушения, астрацидоз, микроглиальная активация, а также сочетанные с ними изменения нейтрофилов, макрофагов, эндотелиальных клеток) определяют зону пенумбры. В области «ишемической полутени» быстрее ив большей степени поражаются клетки глии, чем нейроны коры головного мозга. При этом процессы повреждения всех клеточных пулов мозга взаимосвязаны и зависимы друг от друга. Глиальные клетки количественно преобладают над нервными и занимают весь объем между сосудами и нейронами. Глия является не только трофическим клеточным компонентом нервной системы, но и принимает активное участие в специфическом функционировании нервной ткани, участвует в синтезе иммунных медиаторов - цитокинов и других сигнальных молекул, в синтезе глиальных ростовых факторов. Кроме того, астроциты способны реагировать на увеличение синоптической концентрации нейромедиатоов и изменения электрической активности нейронов, изменениями концентрации внутрикеточного Са2 \ Первые изменения в нейронах проявляются признаками сморщивания, на данном этапе выявляется группировка гетерохроматина, расширение эндоплазматического ретикулума, вакуолизация и набухание внутреннего митохондриального матрикса - все это потенциально обратимые изменения. Признаки необратимого клеточного повреждения - разрушения цитоплазматических и ядерных мембран, отложения богатых кальцием солей во внутренней митохондриальной мембране. Наряду с перечисленными признаками некротической смерти нейронов в зоне «ишемической полутени» наблюдаются клетки, погибшие по механизму программированной смерти - апоптоза.
Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком
Для получения экспериментальной амнезии крысам за 15 минут до обучения УРПИ вводили внутрибрюшинно блокатор М-холинергических рецепторов -скополамин в дозе 2 мг/кг, затем проводили процедуру обучения УРПИ и через 24 часа воспроизводили рефлекс по схеме описанной выше.
Для оценки антиамнестических свойств соединений использовали методику амнезии УРПИ у крыс, вызванной максимальным электрошоком (МЭШ). Выработку УРПИ проводили на установке пассивного избегания (Passive Avoidance) - фирмы Lafayette Instrument Со (США). МЭШ применяли непосредственно после обучения через корниальные электроды силой тока 44 мА частота тока 50 Гц, продолжительность 0,3 секунд. Тест на воспроизведение осуществляли через 24 часа после обучения и воздействия МЭШ.
У животных вырабатывали навык двустороннего избегания в челночной камере в установке «Ugo Basile» (Италия). Конструктивно установка состоит из прямоугольной камеры размером 20x40x16 см разделенной поперек перегородкой с квадратным отверстием 7x7 см. При выработке навыка отверстие располагалось на уровне пола и на равных расстояниях от стенок камеры. Условным сигналом служил звук, после 10 секундного действия которого, через пол, наносилось электроболевое раздражение, сила которого подбиралась индивидуально для каждого животного: при достаточной силе тока у крыс наблюдалась моторная активация. Переход животного в соседнее отделение приводил к выключению звука или комбинации звука и тока. Если в течение 10-ти секундного болевого раздражения крыса не перебегала в соседнее отделение, звук и ток выключались автоматически. Минимальный интервал между сочетаниями составлял 40 секунд, максимальный — 60 секунд. Таким образом, изолированно звуковой сигнал действовал до 10 секунд, совместно условный и болевой раздражители действовали, также 10 секунд. Обучение проводилось в двух вариантах: в течение одного сеанса обучения и 5 дней. В случае однократного обучения за один сеанс предъявляли 50 сочетаний звука и тока. Животное считалось обученным, если в течение 10 последовательных сочетаний перебегало в соседнее отделение до подачи тока. При обучении 5 дней в опытном сеансе давали 20 сочетаний. Избеганием считалось перебежка животного в соседний отдел после включения условного сигнала до подачи электроболевого раздражения. Критерием обученности животных условному рефлексу активного избегания считалось выполнение животным этого рефлекса 18 из 20 сочетаний.
Для оценки анксиолитического действия в опытах на крысах был использован метод наказуемого поведения на модели конфликтной ситуации, основанный на столкновении (конфликте) питьевой и оборонительной мотивации. В работе была использована многомерная установка - модифицированная модель Vogel-тест (Vogel et al., 1971), разработанная в лаборатории психофармакологии ГУ НИИ фармакологии РАМН (Молодавкин Г.М. и соавт., 1993; Воронина Т.А., 1993). Опыт проводили в течение трех дней. В первый день крысы лишались питьевой воды. На следующий день, т.е. после 24-х часовой депривации проводили выработку навыка взятия воды из поилки (слизывание). Для этого животных на пять минут помещали в экспериментальные камеры размером 27,5x27,5x40 см с поилками - стеклянными сосудами с пробирками из нержавеющей стали и электродным полом, соединенным со стабилизаторами тока. Животные, не подходившие к поилке в течение 5 минут из опыта исключались. На третий день крыс снова помещали в экспериментальные камеры, но на этот раз, через 10 секунд после первого взятия, на соски поилок и на электродный пол подавали постоянный ток силой 0,8 мА, так, что каждое взятие воды становилось наказуемым. Регистрировали число наказуемых взятий воды в течение 10 минут. Мерой выраженности анксиолитического эффекта вещества считали достоверное увеличение числа наказуемых взятий воды из поилок животными в опытной группе по отношению к контролю, анксиогенного - уменьшение этого показателя.
Для оценки анксиолитического действия веществ был использован ПКЛ и методика оценки поведения животных согласно Pellow и соавт., (1985). Лабиринт представляет собой перекрещенные полоски размером 50x10 см. Два противоположных отсека имеют вертикальные стенки высотой 40 см. Лабиринт приподнят от пола на 50 см. В месте перекрестка плоскостей находится центральная платформа 10x10 см. Крыс помещали на центральную площадку хвостом к открытому рукаву. Регистрировалось время, проведенное животными в открытых, закрытых рукавах и на центральной площадке, а так же число заходов в открытые и закрытые рукава. Общее время наблюдения для каждого животного составляло 5 минут. В качестве критерия анксиолитического действия использовали показатель времени проведенного в открытых рукавах установки. Число пересечений центральной платформы (общее число заходов в темный и светлый рукава лабиринта) использовали для оценки влияния соединений на двигательную активность крыс.
Изучение антиамнестического эффекта новых соединений
Исследование антиамнестического эффекта N-ацильных производных 4— фенилпирролидона-2 проводили на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином показало, что вещество под шифром ГИЖ 183 с пиперидинметильным радикалом, было эффективным в дозе 10 мг/кг, статистически достоверно увеличивая латентное время рефлекса и количество животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении рефлекса. Соединение ГИЖ 185, с морфолинометильным радикалом обладало антиамнестическими свойствами в дозе I мг/кг. Соединения ГИЖ 280, ГИЖ 281 и ГИЖ 257 оказались не эффективными (табл. 3.1.Б, рис. 3.1). Наблюдалась лишь тенденция увеличения всех показателей, а именно, увеличение латентного времени рефлекса, времени, проведенного на освещенной платформе и количества животных, не зашедших в темную камеру при воспроизведении навыка через 24 часа после обучения (табл. 3.1.Б).
В качестве эталонных ноотропных препаратов сравнения использовались нооглютил и пирацетам. Нооглютил, в дозе 10 и особенно 50 мг/кг обладал выраженными антиамнестическими свойствами на данной модели и при воспроизведении рефлекса через сутки после обучения достоверно увеличивал латентное время и количество животных, не зашедших в темную камеру установки. Пирацетам, введенный в дозе 300 мг/кг статистически достоверно увеличивал только количество животных, не зашежших в темную камеру при воспроизведении.
Исследование антиамнестической активности N-алкильных производных 4-фенилпирролидона на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ показало, что соединение под шифром ГИЖ 283 обладало отчетливым антиамнсстичсскнм эффектом в дозах 1 и 10 мг/кг, а в дозе 50 мг/кг этот эффект ослабевал (табл. 3.2.А). Соединение под шифром ГИЖ 18 улучшало воспроизведение рефлекса на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ в дозах 1 и 10 мг/кт увеличивая, как латентное время рефлекса и количество животных, не зашедших в темную камеру (табл. 3.2.А). Исследование соединения, 1-бензил-4-фенил пирролидона-2 под шифром ГИЖ 179 показало, что на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной МЭШ, вещество в дозах 10 и 50 мг/кг не обладало антиамнестическими свойствами. Соединение иод шифром ГИЖ 286, в дозе 10 мг/кг в значительной степени устраняло у крыс амнезию УРПИ, вызванную МЭШ. При этом отмечалось значительное увеличение латентного времени рефлекса, времени, которое животное проводило в темной камере, в дозе 10 мг/кг - увеличение количества животных, не зашедших в темную камеру установки (табл. 3.2.А, рис. 3.2).
Обучение условной реакции активного избегания проводилось согласно методике, описанной в разделе материалы и методы. Каждое животное обучали УРАИ однократно при 50-ти предъявлениях. Были исследованы наиболее эффективные по антиамнестическому эффекту соединения под шифрами ГИЖ 185 и ГИЖ 283. Установлено, что в контрольной группе животных к концу сеанса обучения, критерия обученности (8 из 10 условных последовательно выполненных реакций) достигли 10 % животных. ГИЖ 185, в дозе 1 мг/кг статистически достоверно увеличивал количество условно - рефлекторных избеганий на удар током, уменьшал количество отказов от выполнения рефлексов, но не влиял на количество обучившихся животных (табл. 3.3). Под влиянием ГИЖ 283 в дозе 2,5 мг/кг значительно, статистически достоверно, увеличивалось количество животных, обучившихся условному рефлексу активного избегания (табл. 3.3).Исследование влияния N-ацильных производных 4-фенилпирролидона-2 на ориентировочно - исследовательское поведение и двигательную активность в открытом поле показало, что ГИЖ 183 в диапазоне доз от 10 до 100 мг/кг не изменяло поведения животных. Соединение ГИЖ185 в дозе 10 мг/кг не влияло, а в дозе 50 и 100 мг/кг вызывало седативное действие, статистически достоверно уменьшая количество горизонтальных, вертикальных перемещений и суммарные показатели. Под влиянием ГИЖ 281 наблюдалось достоверное снижение обследования отверстий без изменения других показателей, включая суммарную двигательную активность, отмечалось в дозах 10 и 50 мг/кг (табл. 3.5.Б).
Исследование миорелаксантных свойств новых N-Алкильных производных 4-фенилпирролидона-2 показало, что вещество под шифром ГИЖ 286 в дозах 10 и 50 мг/кг, не вызывало миорелаксации животных в тесте вращающегося стержня, а в дозе 100 мг/кг нарушение координации движений регистрировалось лишь у 16 % животных. ГИЖ 283 в дозах 10 и 50 мг/кг не оказывал влияния на координацию движений крыс, а в дозе 100 мг/кг — 40 % животных не удержалось на вращающемся стержне, и этот показатель был статистически достоверным, по сравнению с контрольной группой крыс. Соединение под шифром ГИЖ 18 в дозе 10 мг/кг не оказывало влияния на способность животных удерживаться на вращающемся стержне, а под влиянием 100 мг/кг - 100 % животных падали со стержня. Сходные результаты были получены в тесте подтягивание на горизонтальной перекладине. Соединение под шифром ГИЖ 286 в дозах 10 и 50 мг/кг не оказывало влияния, а в дозе 100 мг/кг вызывало миорелаксантный эффект у 16% животных. Соединение под шифром ГИЖ 283 во всех использованных дозах (10, 50 и 100 мг/кг) не влияло на мышечный тонус, животные легко подтягивались на горизонтальной перекладине. Соединение ГИЖ 18, в дозе 10 мг/кг вызывало 100 % миорелаксантный эффект.
Изучение особенностей поведения и памяти крыс с геморрагическим инсультом
Как отмечалось в обзоре литературы, ряд препаратов с ноотропной активностью обладают и церебропротективными свойствами, т.е. восстанавливают вызванные инсультом, травмой или другими факторами повреждение ЦНС на морфологическом, биохимическом и функциональном уровне. Ранее было показано, что нооглютил в эксперименте на животных эффективен при черепно-мозговых травмах (Новиков, 1997), транзиторной ишемии (Алиев, 1999), кроме того, препарат обладает сильным противогипоксическим эффектом (Воронина Т.А. и соавт., 1997), который по ряду данных является прогностическим признаком наличия церебропротективных свойств (Воронина Т.А., 2000).
В связи с этим, целью исследования в настоящем разделе работы явилось изучение церебропротективных свойств нооглютила на модели геморрагического инсульта предложенной Макаренко А.Н. и соавт., (1990). Кроме того, представляло интерес изучить церебропротективные свойства ИФ 8, а так же веществ под шифрами AG 5, AG 29 и Е 4172 у которых были выявлены ноотропные свойства и, согласно программе PASS прогнозировалась церебропротективная активность с уровнем вероятности 0,6 - 0,8.
Моделирование локального кровоизлияния в головном мозге проводилось согласно процедуре описанной в разделе материалы и методы. С этой целью крысам, наркотизированным нембуталом (50 мг/кг, в/м) при помощи специального устройства (мандрен-нож) и стереотаксиса осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы, с последующим (через 2-3 минуты) введением, в место повреждения, крови, взятой из-под языка животного (0,02-0,03 мл) (схема 4.1.). Морфологические исследования показали, что таким способом достигается локальный аутогеморрагический билатеральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр - 2 мм, глубина - 3 мм) без существенных повреждений выше расположенных образований мозга и неокортекса (Макаренко А.Н. и соавт., 1990).
Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно через 3 — 3,5 часа после операции. Через 24 часа регистрировалась гибель животных, неврологический дефицит, координация движений в тесте вращающегося стержня, мышечный тонус в тесте подтягивания на горизонтальной перекладине, ориентировочно исследовательское поведение в условиях методики отрытого поля, уровень тревоги в тесте ПКЛ. Динамику развития нарушений, вызванных интрацеребральной посттравматической гематомой и влияние новых соединений на поведение крыс, наблюдали в течение 14 суток после операции с регистрацией поведения и состояния животных на первые, третьи, седьмые и четырнадцатые сутки после операции. Животные были поделены на несколько групп: интактные (I группа); ложно оперированные (II группа); животные с инсультом (III группа); крысы с ГИ, которым после операции вводили нооглютил, в дозе 10 мг/кг (IV группа) и 20 мг/кг (V группа,), ИФ 8, в дозе 1 мг/кг (VI группа) и 5 мг/кг (VII группа); AG 5, в дозе 5 мг/кг (VIII группа); AG 29, в дозе 1 мг/кг (IX группа); Е 4172, в дозе 10 мг/кг (X группа) и крысы, которым после операции вводили нимодипин в дозе 0,03 мг/кг (XI группа), 0,1 мг/кг (XII группа). Контрольным - 1, 2 и 3 группам животных вводили физиологический раствор с Твин-80. Каждая из групп в начале эксперимента состояла из 10-20 животных. В качестве эталонного препарата сравнения, в эксперименте исследовался известный препарат, обладающий церебропротекторным действием - нимодипин, который используется в клинике при лечении ишемических и геморрагических инсультов. Морфологические исследования проводили в контрольной группе крыс с геморрагическим инсультом и в группе животных с ГИ, получавших нооглютил в дозе 10 мг/кг с использованием методики описанной в главе материалы и методы.
Как видно из таблицы 4.1 с первых по седьмые сутки после операции в группе ложно оперированных крыс не наблюдалось гибели, а на 14-е - 2 крысы из 28 погибли. В группе крыс с ГИ в течение первых суток погибло 30 % животных, а к 14-му дню этот показатель достиг 64 %. Нооглютил, в дозе 10 мг/кг почти полностью предупреждал гибель крыс с ГИ. Только 4 — 8 % крыс погибли в течение всего времени наблюдения.
