Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Пространственно-затрудненные фенолы и их фар фармакологическая активносте (обзор литературы) 9
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 33
2.1. Объекты исследования 33
2.2. Методы исследования 35
2.3. Техника проведения экспериментов 4 4
ГЛАВА 3. Выбор перспективного соединения в ряду производных о-изоборнилфенола 47
3.1. Оценка антирадикальной активности производных о-изоборнилфенола 47
3.2. Изучение антигипоксической активности производных о-изоборнилфенола в условиях острой гипобарической гипоксии 50
3.3. Оценка острой токсичности производных о-изоборнилфенола 54
ГЛАВА 4. Фармакологическая активность и механизмы действия 4-метил-2, б-диизоборнилфенола 58
4.1. Нейропротекторная активность 4-метил-2,б-диизоборнилфенола в условиях модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга 58
4.2. Исследование механизмов нейропротекторной активности 4-метил-2, 6-диизоборнилфенола 61
4.2.1. Антиоксидантная активность 4-метил-2,б диизоборнилфенола в условиях неполной ишемии головного мозга
4.2.2. Исследование влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на показатели гемодинамики. 63
4.2.3. Гемореологические эффекты 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в условиях модели неполной ишемии головного мозга 4.3. Антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на модели артериального тромбоза 7 4
4.4. Изучение механизмов антитромбогенной активности 4-метил-2, б-диизоборнилфенола 77
4.4.1. Оценка влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на агрегацию тромбоцитов 77
4.4.2. Исследование влияния 4-метил-2,6 диизоборнилфенола на антитромбоцитарную ак
тивность сосудистой стенки и функцию эндотелия в условиях модели неполной ишемии головного мозга 7 9
Заключение 84
Выводы 97
Список литературы
- Методы исследования
- Изучение антигипоксической активности производных о-изоборнилфенола в условиях острой гипобарической гипоксии
- Оценка острой токсичности производных о-изоборнилфенола
- Антиоксидантная активность 4-метил-2,б диизоборнилфенола в условиях неполной ишемии головного мозга
Введение к работе
Актуальность проблемы. Нарушения мозгового кровообращения представляют собой важную медицинскую и социально-экономическую проблему. В России ежегодно инсульты переносят более, чем 450 тысяч человек. Около 50% из них умирают к концу года с момента заболевания (25% в течение первого месяца). Острые нарушения мозгового кровообращения занимают второе место среди причин смертности населения и первое место среди причин первичной инвалидности [Виленский Б.С., 2005; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001].
Недостаточно эффективное лечение острых и хронических расстройств кровообращения головного мозга ведет к ухудшению качества жизни пациентов, снижению социальной и семейной адаптации, повышению риска развития повторных острых нарушений мозгового кровообращения и, в конечном счете, к росту смертности и сокращению продолжительности жизни [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001].
Проблеме нарушений мозгового кровообращения посвящается большое количество научных публикаций, отражающих значительную динамику представлений о патогенезе расстройств мозгового кровообращения, различное отношение к тактике и стратегии профилактики, диагностики, лечения данной группы заболеваний. По-прежнему сложной и спорной остается проблема защиты клеток мозга от повреждающих воздействий при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения [Ginsberg M.D., 2008]. Несмотря на огромное количество работ, в настоящее время не существует ни одного средства с абсолютно доказанной эффективностью (нейропротекцией) при ишемии мозга [Ringleb Р.А. et al., 2008].
Одним из основных и универсальных механизмов повреждения клеток ткани мозга в условиях нарушения мозгового кровообращения является окси-дантный стресс. Ввиду этого актуальным является применение в терапии нарушений мозгового кровообращения нейропротекторных средств, обеспечивающих метаболическую защиту головного мозга, к которым относятся антиокси-данты и антигипоксанты [Поварова О.В. и др., 2003; Суслина З.А. и др., 2007].
В Институте химии Коми НЦ УрО РАН синтезирован ряд производных о-изоборнилфенола, относящихся к группе пространственно-затрудненных фенолов, представители которой обладают высокой антиоксидантной активностью [Меньшикова Е.Б. и др., 2006].
Цель исследования: изыскание и изучение соединений, обладающих ней-ропротекторной и антитромбогенной активностью, в ряду производных о-изоборнилфенола.
Задачи исследования:
Провести скрининг в ряду производных о-изоборнилфенола с целью выявления соединения, обладающего высокой ангирадикальной, антигипоксиче-ской активностью и низкой токсичностью.
Исследовать нейропротекторную активность отобранного производного о-изоборнилфенола в условиях модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга.
3. Изучить механизмы нейропротекторной активности отобранного производ
ного о-изоборнилфенола:
влияние на процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга;
эффект на мозговой кровоток;
влияние на реологические свойства крови.
Оценить антитромбогенную активность отобранного производного о-изоборнилфенола на модели внутрисосудистого тромбоза.
Изучить механизмы антитромбогенной активности отобранного производного о-изоборнилфенола:
влияние на агрегацию тромбоцитов;
влияние на антитромбоцитарную активность сосудистой стенки;
эндотелийпротекторный эффект.
Научная новизна. Впервые в ряду новых полусинтетических производных о-изоборнилфенола выявлены соединения, обладающие антирадикальной, ан-тигипоксической активностью и низкой токсичностью.
Впервые установлено, что 4-метил-2,б-диизоборнилфенол обладает нейропротекторной активностью: повышает выживаемость после тотальной транзи-торной ишемии головного мозга и ускоряет восстановление неврологического статуса у животных.
Впервые показано, что в основе нейропротекторного действия 4-метил-2,6-диизоборнилфенола лежит его способность ингибировать процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга, увеличивать мозговой кровоток и улучшать реологические свойства крови.
На модели артериального тромбоза у крыс впервые выявлена антитромбо-генная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, в основе которой лежит его способность снижать агрегацию тромбоцитов, повышать антитромбоцитарную активность сосудистой стенки и проявлять эндотелийпротекторный эффект.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты обосновывают целесообразность проведения клинических исследований 4-метил-2,6-диизоборнилфенола у больных с острыми и хроническими нарушениями мозгового кровообращения.
Результаты исследований 4-метил-2,6-диизоборнилфенола изложены в виде отчета по специфической активности и острой токсичности для предоставления в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения».
Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 6 работ, из них 1 в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.
Патенты. Патент № 2347561 «Средства, обладающие гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью». Патент № 2351321 «Средство, увеличивающее мозговой кровоток».
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 131 странице машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 262 источника, из них 91 на
иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 7 рисунками.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), VI Всероссийском семинаре с молодежной школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), VI международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2007), IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008), IV Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2009).
Эксперименты проведены на 55 беспородных крысах-самцах, 125 беспородных крысах-самках и 172 крысах-самцах Вистар массой 200-350 г, а также на 259 беспородных мышах обоего пола массой 18-22 г. Животных содержали на стандартном пищевом рационе вивария в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты проведены в соответствии с рекомендациями, изложенными в Приказе МЗ СССР за № 755 от 12 августа 1977 г., а также с использованием методик, не противоречащих принципам Европейской конвенции по защите животных 1986 г. Все болезненные процедуры проводили на наркотизированных животных. Эвтаназию проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» передозировкой эфирного наркоза.
В работе использованы образцы производных о-изоборнилфенола, изготовленные на опытном производстве Института химии Коми НЦ УрО РАН. Субстанции представляют собой кристаллические или мелкокристаллические порошки белого цвета.
Антирадикальные свойства производных о-изоборнилфенола оценивали спектрофотометрическим экспресс-методом in vitro [Починок Т.В. и др., 1985; Takebayashi J. et al., 2006]. В качестве стабильного свободного радикала использовали 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ). Оценивали полноту нейтрализации свободных радикалов (за 60 мин) и показатель ETso% - значение времени (мин), за которое происходит уменьшение исходной оптической плотности на 50% [Починок Т.В. и др., 1985].
Моделирование острой гипобарической гипоксии осуществляли в герметичной камере с поглотителем С02 (30%-ный раствор КОН) при внешней температуре 20-22 С и максимальном разрежении 170 мм рт.ст. Скорость подъема на высоту - 50 м/с [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005]. Регистрировали параметры: время жизни (с) на «смертельной площадке», которое отсчитывали от момента подъема на «площадку» до наступления летального исхода; выживаемость - по количеству животных, которое выдерживают пребывание на «смертельной
площадке» в течение 20 мин (в % от общего количества животных в группе). «Смертельная площадка» - разрежение, при котором гибнут все контрольные животные.
Модель тотальной транзиторной ишемии головного мозга (ИГМ) воспроизводили на беспородных крысах-самках по методу W.A. Pulsinelli и J.B. Brier-ley [1979]. Неврологический дефицит у животных определяли по шкале Stroke-index McGraw [McGraw СР., 1977] в нашей модификации. Оценку функционального состояния высшей нервной деятельности проводили на 1-е, 3-й, 5-е и 7-е сутки после создания модели тотальной транзиторной ИГМ, по следующим показателям: спонтанная двигательная активность (нормальная, повышенная или сниженная, отсутствие); расстройства походки (скованность, шаткость, замедленность движений, нарушение ориентации); рефлексы отдергивания хвоста, обеих передних и задних лап; реакция на звук; тремор; судороги; тонус мышц туловища и конечностей (нормальный, повышенный, отсутствие); признаки птоза (отсутствие, односторонний, двусторонний). Каждый показатель оценивали в баллах: 0 баллов - норма; 1 балл - умеренно выраженные изменения; 2 балла - резко выраженные изменения. Тяжесть состояния оценивалась по сумме соответствующих баллов. Кроме того, в каждой группе крыс определяли долю животных с тяжелыми неврологическими расстройствами (6 баллов и более), с нарушениями средней тяжести (3-5 баллов) и с легкими изменениями (до 2 баллов). Кроме того, на 1-е, 3-й, 5-е и 7-е сутки регистрировали выживаемость животных.
Модель неполной ИГМ у крыс воспроизводили под эфирным наркозом путем полной окклюзии левой сонной артерии и ограничения кровотока по правой сонной артерии на 50% от исходного значения [Плотников М.Б. и др., 1994].
Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли в гомогенате мозга крыс. Экстракцию липидов из гомогената проводили смесью гексан-изопропанол [Косухин А.Б., Ахметова Б.С., 1987]. Содержание диеновых (ДК) и триеновых конъюгатов (ТК) оценивали по характерным пикам поглощения при 232 нм и 275 нм соответственно и рассчитывали в единицах оптической плотности на 1 мг липидов. Измерение проводили на спектрофотометре Hitachi модель 557. Основания Шиффа (ОШ) определяли на спектрофлюориметре Hitachi модель 850 (Х.возб=360 нм и Х„сп=460 нм) [Tappel А., 1978]. Содержание ОШ рассчитывали в относительных единицах на 1 мг липидов. Содержание липидов определяли взвешиванием.
Системное артериальное давление (САД) регистрировали прямым методом с непрерывной записью на самописце. Мозговой кровоток (в мл/мин) оценивали методом электромагнитной флоуметрии по притоку крови к мозгу через общую сонную артерию с помощью прибора MFV-1100 фирмы Nihon Kohden.
В работе исследовали такие гемореологические показатели, как вязкость цельной крови, гематокрит, содержание фибриногена в плазме крови, вязкость плазмы, спонтанную агрегацию эритроцитов и их деформируемость. Вязкость цельной крови оценивали на ротационном вискозиметре АКР-2 в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 300 с"1, плазмы - 300 с"1 [Парфенов А.С. и др., 1994]. Гематокрит определяли центрифугированием и выражали в %. Концентрацию
фибриногена в плазме оценивали методом тромбообразования Клаусса на коа-гулометре KG-4 фирмы Cormay с использованием набора реагентов «Фибриноген-тест» [Балуда В.П. и др., 1980]. Спонтанную агрегацию эритроцитов исследовали с помощью метода силлектометрии [Плотников М.Б. и др., 1995]. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полупериод агрегации Tia — время (с), за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза [Богоявленский В.Ф., 1981] Деформируемость эритроцитов оценивали методом лазерной дифрактометрии (эктацитометрии) [Evans Е., Mohandas N., 1986]. Способность эритроцитов к деформации выражали в виде индекса, который рассчитывали как отношение (L-H)/(L+H), где L и Н - соответственно больший и меньший диаметры первого дифракционного максимума. Доступность кислорода для тканей оценивали по соотношению гематокрит/вязкость крови на высоких скоростях сдвига (50-300 с"1) [Stoltz J.F. et al., 1991].
Исследование антитромбогенной активности проводили в условиях модели внутрисосудистого тромбоза [Максименко А.В., Тищенко Е.Г., 1999].
Получение богатой и бедной тромбоцитами плазмы и подсчет числа тромбоцитов проводили стандартным методом [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001]. Амплитуду АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов оценивали в стандартизованной плазме (400±30 тыс. в 1 мм3 пробы) на приборе АТ-02 по методу, предложенному Born [Born G.V.R., 1962]. Агрегатограммы регистрировали с помощью самописца Recorder 2210.
Антитромбоцитарную активность сосудистой стенки оценивали по степени угнетения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов [Балуда В.П. и др., 1987].
Функциональное состояние эндотелия характеризовали коэффициентом эндотелиальной дисфункции (КЭД), который рассчитывали как отношение площади над кривой падения САД в ответ на внутривенное болюсное введение натрия нитропруссида (30 мкг/кг) к площади над кривой падения САД в ответ на введение ацетилхолина гидрохлорида (5 мкг/кг) [Тюренков И.Ю., Воронов А.В.,2008].
Оценку острой токсичности производных о-изоборнилфенола проводили на бодрствующих мышах и крысах обоего пола. Исследуемые образцы соединений вводили внутрижелудочно и внутрибрюшинно. Исследования проводили в соответствии с Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005].
Исследуемые производные о-изоборнилфенола и препараты сравнения вводили внутрижелудочно в виде суспензий в 2% крахмальной слизи. Животные контрольной группы, интактные и ложнооперированные (ЛО) животные получали эквиобъемное количество 2% крахмальной слизи. При оценке влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на показатели гемодинамики опытным животным субстанцию вводили подкожно в масляном растворе (миндальное масло), а контрольным животным - эквиобъемное количество миндального масла.
Забор проб цельной крови проводили из общей сонной артерии крыс. Для этого у животных под эфирным наркозом выделяли общую сонную артерию, сосуд перевязывали и проксимально вставляли тефлоновый катетер. Кровь стабилизировали 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1.
В качестве наркозных средств использовали тиопентал-натрий и этаминал-натрий (60 мг/кг, внутрибрюшинно), уретан (1 г/кг, внутрибрюшинно), а также диэтиловый эфир.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 6.0». В таблицах представлены средние значения показателей и стандартные ошибки среднего значения. Нормальность распределения оценивали с помощью показателей асимметрии и эксцесса; достоверность различий (р<0,05) между сериями определяли с помощью теста Манна-Уитни, t-критерия Стьюдента и критерия х2- Для определения LD50 и ЕТ5о% использовали пробит-анализ по методу Литчфилда-Вилкоксона.
Методы исследования
В настоящее время ионол производится во многих странах мира. Многочисленные методы получения ионола, а также пути выделения и очистки определяют области его применения. Субстанцию ионола с концентрацией основного вещества 99% и выше используют для изготовления лекарственных форм [70].
Ионол относят к классическим антиоксидантам, являющимся акцептором свободных кислородных радикалов, тормозящим перекис-ное окисление липидов (ПОЛ) и белков [70], как іл vitro на культуре клеток, так и при стимулированном усилении образования продуктов ПОЛ in vivo [28].
Он способен образовывать комплексы со свободными жирными кислотами и поэтому создает условия для предотвращения окисления липидов мембран клеток [125], способствует биосинтезу макромолекул, обеспечивая экранирование клетки от токсических воздействий [7 0]
Ионол повышает функцию каталазно-пероксидазной системы, осуществляющей элиминацию гидроперекисей и перекиси водорода [4], восстанавливает микровязкость микросомальных мембран при антиоксидантной недостаточности [44], повышает уровень и активность глутатион-8-трансферазы, подавляет активность пере-кисных радикалов сыворотки крови, повышает функцию неспецифических эстераз и холинэстеразы, снижает количество и активность лактатдегидрогеназы [103] . Ионол играет существенную роль при окислительном стрессе [73], ингибируя радикальные окислительные процессы [101]. Ионол повышает фагоцитоз и другие факторы неспецифического иммунитета, способствует выведению радионуклидов, замедляет синтез нуклеиновых кислот и белка злокачественных клеток [70], проявляет цитостатическии эффект в отношении раковых клеток слизистой мочевого пузыря [144], повышает чувствительность опухолевых клеток к ионизирующему облучению, снижая терапевтическую дозу облучения [7 0].
Ионол обладает выраженной антиоксидантной активностью при различных видах стресса: эмоциональном и эмоционально-болевом стрессе [2, 96, 170], оперативном стрессе у больных раком легкого [9], травматическом шоке [167], судорожном стрессе [108], при механической асфиксии [95], при поражении желудка [30], при острой кровопотере [92], при тепловом ударе [138], при конфликтной ситуации [104], при эндогенных депрессиях, неврозе и тревоге [99, 130], при цереброваску-лярных расстройствах [34], при ишемии и реперфузии головного мозга [16], при глобальной ишемии и острой гипоксии миокарда [12, 42, 98], при ишемическом реоксигенационном повреждении печени [15], при диабете [19], при туберкулезе [3, 48], при гнойно-воспалительных ранах и других инфекциях [б, 107] .
Геронтопротекторное действие ионола показано, как в эксперименте на молодых и старых крысах, так и в клинических исследованиях у лиц пожилого и старческого возраста [7 0] .
Ионол в экспериментальных условиях угнетает свободнора-дикальное окисление при аллоксановом диабете [18], снижает уровень тиреоидных гормонов у старых крыс [43], нормализует процессы дезаминирования азотистых соединений в сердечной мышце при экспериментальном гипертиреозе [70].
Ионол ускоряет выработку и сохранение оборонительного условного рефлекса при максимальной физической нагрузке у экспериментальных животных [100] и увеличивает работоспособность у крыс [153].
Широта проявляемых ионолом эффектов привлекала исследователей из разных областей медицины: кардиологии, онкологии, гастроэнтерологии, стоматологии, дерматологии [70].
Возможность применения ионола в кардиологии была доказана как экспериментально, так и клинически. Ионол в экспериментальных условиях ограничивал зону некроза миокарда [23, 59] , увеличивал уровень естественного антиоксиданта а-токоферола в мембранах эритроцитов и плазме крови при экспериментальном инфаркте миокарда у крыс [51], способствовал нормализации содержания креатинкиназы и гемоглобина в сыворотке крови собак при постишемической реперфузии [40].
Перечисленные свойства ионола, скорее всего, связаны с тем, что препарат устраняет стрессовые воздействия на миокард [94, 97], улучшает микроциркуляцию в бассейне коронарных сосудов, способен уменьшать агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, устраняет повышенную гемокоагуляцию [169].
Антиоксидантные свойства ионола, зафиксированные в экспериментальных условиях, предопределили его включение в комплексную терапию больных с острым инфарктом миокарда, ишемическои болезнью сердца, нарушениями электрической стабильности сердца при постинфарктном кардиосклерозе, при постреанимационной недостаточности сердца, реоксигенационных аритмиях, нарушениях функции сердечной мышцы при гипоксии [39, 70] .
Изучение антигипоксической активности производных о-изоборнилфенола в условиях острой гипобарической гипоксии
Моделирование острой гипобарической гипоксии осуществляли в герметичной камере с поглотителем С02 (30%-ный раствор КОН) при внешней температуре 20-22 С и максимальном разрежении 170 мм рт.ст. (приблизительно соответствует высоте 10500 м). Скорость подъема на высоту - 50 м/с [136]. «Смертельная площадка» - разрежение, при котором гибнут все контрольные животные.
Регистрировали следующие параметры: - время жизни (с) на «смертельной площадке», которое отсчитывали от момента подъема на «смертельную площадку» до наступления летального исхода; - выживаемость (%) оценивали по количеству животных, которое выдерживают пребывание на «смертельной площадке» в течение 20 мин (в % от общего количества животных в группе).
Кроме этого, рассчитывали коэффициент защиты как отношение времени жизни на «смертельной площадке» опытных животных к времени жизни на «смертельной площадке» контрольных животных.
Неврологический дефицит у животных определяли по шкале Stroke-index McGraw [231] в нашей модификации. Оценку функционального состояния высшей нервной деятельности проводили на 1-е, 3-й, 5-е и 7-е сутки после создания модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга, по следующим показателям:
Тяжесть состояния оценивалась по сумме соответствующих баллов. Кроме того, в каждой группе крыс определяли долю животных с тяжелыми неврологическими расстройствами (б баллов и более), с нарушениями средней тяжести (3-5 баллов) и с легкими изменениями (до 2 баллов). Выживаемость животных регистрировали на 1-е, 3-й, 5-е и 7-е сутки после тотальной транзиторной ишемии головного мозга.
Перекисное окисление липидов оценивали по значению показателей первичных (диеновые и триеновые конъюгаты) и вторичных (основания Шиффа) продуктов перекисного окисления и содержанию а-токоферола в гомогенате ишемизированного мозга крыс. Для этого под эфирным наркозом крыс декапитировали, после чего проводили быстрое вскрытие черепа, выделяли головной мозг и помещали его в сосуд Дюара с жидким азотом. Экстракцию липидов из гомогената ткани мозга крыс осуществляли смесью гексан-изопропанол [7 9]. К исследуемому гомогенату, содержащему 1 мг/мл ЭДТА, добавляли смесь гексан-изопропанол (1:1) в соотношении 1:20 (по объему) . Для расслоения фаз использовали раствор НС1 (рН=2). Верхнюю (гек-сановую) фазу отбирали и определяли в ней содержание диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), оснований Шиффа (ОШ) и а-токоферола. Оптическую плотность измеряли на 9 спектрофотометре Hitachi модель 557 (Япония). Содержание ДК оценивали по характерному для сопряжённых двойных связей пику поглощения при 232 нм, содержание ТК - при 27 5 нм. Показатель ДК и ТК рассчитывали в единицах оптической плотности на 1 мг липидов [79, 254] .
Индекс окисления липидов рассчитывали по соотношению показателей оптической плотности ДК и неокисленных липидов при 215 нм [14].
ОШ определяли флюоресцентным методом [Tappel A.L., 1978] на спектрофлюориметре Hitachi модель 850 (Япония) (АВОЗб.=ЗбО нм и Лисп.=4 60 нм) . Содержание ОШ рассчитывали в относительных единицах на 1 мг липидов.
Содержание а-токоферола оценивали также флюоресцентным методом (АВОЗб.=295 нм и Аисп.=330 нм) . Концентрацию а-токоферола рассчитывали в мкг/мг липидов по калибровочному графику, используя метод регрессионного анализа. Содержание липидов определяли взвешиванием.
Системное артериальное давление (САД) регистрировали прямым методом с помощью датчика полиграфа Салют (Россия), сигнал которого усиливали рН-метром рН-340 (Россия), с непрерывной записью на самописце КСП-4(Россия).
Мозговой кровоток оценивали методом электромагнитной флоуметрии по притоку крови к мозгу через общую сонную артерию с помощью прибора MFV-1100 (Nihon Kohden, Япония). В работе использовали датчики, размер которых был на 10% меньше диаметра сосуда, для достаточно плотного контакта поверхности электрода со стенками сосуда. Величину кровотока (мл/мин) рассчитывали по внутренней калибровке расходомеров .
При исследовании гемореологической активности регистрировали следующие показатели: вязкость цельной крови, гематокрит, содержание фибриногена в плазме крови, вязкость плазмы, способность эритроцитов к спонтанной агрегации и деформируемость эритроцитов. Вязкость цельной крови оценивали с использованием ротационного вискозиметра АКР-2 (Россия) в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 300 с-1, плазмы - 300 с-1 [113] . Гематокрит определяли центрифугированием и выражали в %. Концентрацию фибриногена в плазме оценивали методом тромбообразования Клаусса на коагулометре KG-4 (Cormay, Польша) с использованием набора реагентов «Фибриноген-тест» (ОАО «Технология-Стандарт», Россия) [8].
Спонтанную агрегацию эритроцитов исследовали с помощью метода силлектометрии. Метод основан на регистрации яркости света, отраженного от кюветы с кровью. Для установления интенсивности фотометрического сигнала использовали микроколориметр МКМФ-1 (Россия) с графической регистрацией на графопостроителе НЗОб (Россия) [118]. В процессе перемешивания стабилизированной цельной крови мешалкой кюветы, происходит дезагрегация эритроцитов, характеризующаяся изменениями яркости света в ходе перемешивания, а изменения яркости света, возникающие после остановки мешалки, отражают процесс агрегации эритроцитов [85]. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полупериод агрегации Т1/2 - время в секундах, за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза [20] .
Оценка острой токсичности производных о-изоборнилфенола
4-Метил-2,б-диизоборнилфенол при внутрижелудочном введении предотвращал падение кровотока в течение всего периода наблюдения и к 90-й мин его уровень составлял 87% от исходного значения. Через сутки в просвете сонной артерий у крыс этой группы тромбов не обнаружено (табл. 12, рис. б).
Таким образом, на модели внутрисосудистого тромбоза продемонстрирована антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, которая в условиях данной модели по активности не уступала пентоксифиллину.
Изучение механизмов антитромбогенной активности 4-метил-2,б-диизоборнилфенола Для изучения механизмов антитромбогенного действия были выполнены эксперименты по оценке влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на агрегацию тромбоцитов, антитромбоци-тарную активность сосудистой стенки и функцию эндотелия в условиях модели неполной ишемии головного мозга.
Оценка влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на агрегацию тромбоцитов Эксперименты по оценке антитромбоцитарной активности 4-метил-2,б-диизоборнилфенола проведены на 15 крысах-самцах Вистар массой 300-350 г. Амплитуда обратимой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (конечная концентрация АДФ 4-10" М) у интактных животных составила 28+1%. После однократного внутрижелудочного введения пентоксифиллина в дозе 4 00 мг/кг амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в БТП была на 32% ниже аналогичного показателя у интактных крыс (табл. 13, рис. 7). 4-Метил-2, б-диизоборнилфенол при однократном внутрижелу-дочном введении крысам в дозе 100 мг/кг вызывал снижение амплитуды АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов на 3 9% по сравнению со значениями у интактных животных (табл. 13, рис. 7).
Таким образом, 4-метил-2,6-диизоборнилфенол способен снижать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов крыс, не уступая по выраженности эффекта пентоксифиллину, что свидетельствует о антитромбоцитарной активности соединения.
Таблица 13 Влияние однократного внутрижелудочного введения пентокси-филлина (400 мг/кг) и 4-метил-2, б-диизоборнилфенола (100 мг/кг) на амплитуду АДФ-индуцированной (4-Ю-6 М) агрегации тромбоцитов Группа животных Амплитуда агрегации тромбоцитов, % Интактные животные (п=5) 28+1 Пентоксифиллин (п=5) 19±1+ ч р Рис. 7. Влияние однократного внутрижелудочного введения пентоксифиллина (400 мг/кг) и 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг) на амплитуду АДФ-индуцированной (4-Ю-6 М) агрегации тромбоцитов (%). 1 - интактные животные; 2 - пентоксифиллин; 3 - 4-метил-2, б- Исследование влияния 4-метил-2,б-диизоборнилфенола на антитромбоцитарную активность сосудистой стенки и функцию эндотелия в условиях модели неполной ишемии головного мозга
Эксперименты по оценке влияния курсового (5 суток) внутрижелудочного введения 4-метил-2,б-диизоборнилфенола на ан-титромбоцитарную активность сосудистой стенки проведены на 20 крысах-самцах Вистар массой 300-350 г. Исходная амплиту 80 да необратимой агрегации тромбоцитов (индуктор - АДФ в конечной концентрации 4-Ю"5 М) у ЛО животных составляла 41+2%. После инкубации сегмента брюшной аорты ЛО животных с ВТП ЛО крыс амплитуда агрегации уменьшилась до 7+1%, что было на 83% ниже значения до инкубации (табл. 14).
После инкубации БТП ЛО крыс с сегментом брюшной аорты крыс контрольной группы амплитуда амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов составила 20+5%, что в 3 раза превышало значение показателя у ЛО животных (табл. 14). Следовательно, неполная ишемия головного мозга у крыс приводит к истощению антитромбоцитарной активности сосудистой стенки.
Амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов после инкубации сегмента брюшной аорты крыс с неполной ишемией головного мозга, получавших 4-метил-2,б-диизоборнилфенол (5 суток внутрижелудочно, в дозе 100 мг/кг), составила 10±2%, то есть была на уровне значений, близких к норме (табл. 14). Данный факт свидетельствует о способности 4-метил-2,б-диизоборнилфенола повышать антитромбоцитарную активность эндотелия аорты при неполной ишемии головного мозга. Таблица 14 Влияние инкубации сегмента брюшной аорты в богатой тромбоцитами плазме ложнооперированных животных на амплитуду АДФ-индуцированной (4-Ю 5 М) агрегации тромбоцитов
Антиоксидантная активность 4-метил-2,б диизоборнилфенола в условиях неполной ишемии головного мозга
Кроме того, при ишемическом инсульте по типу гемореоло-гической микроокклюзии, эти нарушения (гиперфибриногенемия, повышение вязкости крови, увеличение агрегационной активности форменных элементов крови) играют ключевую роль в формировании очагового поражения мозга [145] .
Известно, что ряд соединений из группы пространственно-затрудненных фенолов и другие антиоксиданты, способны проявлять гемореологическую активность, воздействуя на разные реологические факторы [68, 121, 237].
На выбранной нами модели ишемии головного мозга, адекватно отражающей сдвиги основных гемореологических показателей при нарушении мозгового кровообращения [33], было установлено, что 4-метил-2,б-диизоборнилфенол ослабляет выраженность СПВК, снижая содержание фибриногена в плазме крови и ее вязкость, улучшая деформируемость эритроцитов и снижая их агрегацию в условиях неполной ишемии головного мозга у крыс. Наблюдаемые изменения реологических свойств крови у животных, получавших 4-метил-2,б-диизоборнилфенол, способствовали увеличению доступности кислорода для тканей.
Атеротромбоз и тромбоэмболия сосудов являются основной причиной подавляющего большинства острых ишемических нару 94 шений мозгового кровообращения [146]. Установлено, что в общей структуре развития ишемических нарушений мозгового кровообращения эмболический механизм является превалирующим и по данным разных авторов составляет от 50 до 90% [112, 185]. К тому же, важным в терапии инсульта является предотвращение реэмболий [50]. Недаром борьба с тромбозами является одной из важнейших задач медицины XXI века [145] . В связи с этим целесообразным являлось исследование антитром-богенной активности 4-метил-2,б-диизоборнилфенола.
В используемой нами модели тромб в артерии формируется в результате свободнорадикального повреждения сосудистой стенки [91] . Обработка сосуда железа хлоридом (II) локально активирует процессы перекисного окисления липидов, вследствие чего накапливаются липидные перекиси. Высокий уровень липидных перекисей может подавлять синтез простациклина эндотелием сосудистой стенки, вызывая сдвиг равновесия ПГІ2/ТХА2 в сторону увеличения тромбоксана [38], который является сильным индуктором агрегации тромбоцитов и сосудосуживающим фактором. Повышение его уровня создает условия для активации тромбоцитарного звена и формирования артериального тромба [233] .
4-Метил-2,б-диизоборнилфенол при курсовом внутрижелудоч-ном введении полностью предотвращал тромбообразование. Наблюдаемая антитромбогенная активность производного о-изоборнилфенола может быть обусловлена его антиоксидантными свойствами, благодаря чему ослабляется накопление липидных перекисей в сосудистой стенке и, как следствие, подавляются процессы тромбообразования.
С другой стороны 4-метил-2,б-диизоборнилфенол проявлял антитромбоцитарный эффект, подавляя АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, и повышал антитромбоцитарную активность сосудистой стенки. Это особенно важно, учитывая то, что нарушения мозгового кровообращения, сопровождаются сниженной антитромбоцитарнои активностью эндотелия сосудистой стенки и повышенным риском тромбообразования [116, 148].
Таким образом, большое значение в развитии сосудистых заболеваний головного мозга имеют не только структурные изменения церебрального сосудистого русла, но и нарушения функциональных свойств сосудистой стенки [55] .
Эндотелий, вырабатывая различные биологические вещества, принимает непосредственное участие в поддержании сосудистого тонуса, антитромбогенности сосудистой стенки, регуляции адгезии и агрегации тромбоцитов, проявляет про- и антикоа-гулянтную, фибринолитическую активность, участвует в процессах воспаления и ангиогенеза [54, 257]. Находясь в непосредственном контакте с кровью, эндотелий получает сигналы как гуморальным путем, так и при непосредственном взаимодействии клеток крови с чувствительными структурами эндоте-лиоцитов и при изменении напряжении сдвига.
Понятие «дисфункции эндотелия» включает в себя структурные и функциональные изменения, выражающиеся в неадекватном образовании в эндотелии различных веществ. В более узком смысле зачастую представляют эндотелиальную дисфункцию, как недостаточную продукцию оксида азота, поскольку он принимает участие в регуляции практически всех функций эндотелия и наиболее чувствителен к повреждению [54, 219, 257].
Одним из патологических состояний, сопровождающихся эн-дотелиальной дисфункцией, является ишемия головного мозга. Нарушения функции эндотелия при ишемии наблюдаются у больных, а также воспроизводится на моделях [29, 55, 228].
4-Метил-2,б-диизоборнилфенол способен проявлять эндоте-лийпроекторную активность, снижая выраженность эндотелиаль-ной дисфункции в условиях ишемии головного мозга. Таким образом, среди производных о-изоборнилфенола в опытах in vitro и in vivo выбраны перспективные соединения, обладающие антирадикальной, антигипоксическои активностью и низкой токсичностью. На модели тотальной транзиторнои ИГМ выявлена нейропротекторная, а на модели внутрисосудистого тромбоза - антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (диборнола). Нейропротекторное действие диборнола является комплексным и обусловлено как нейрональ-ным (снижение интенсивности ПОЛ в мозговой ткани), так и экстранейрональными (повышение мозгового кровотока, улучшение реологических свойств крови) эффектами. В основе анти-тромбогенного действия диборнола лежит его способность снижать агрегацию тромбоцитов, повышать антитромбоцитарную активность сосудистой стенки и проявлять эндотелийпротектор-ный эффект.
Полученные данные позволяют рекомендовать диборнол для клинических испытаний в качестве нейропротекторного средства в остром и реабилитационном периодах ишемического инсульта .
