Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1. Болезнь Альцгеймера. Определение понятия, клинические проявления 9
1.2. Патогенетические механизмы БА 13
1.2.1. Образование амилоидных бляшек 13
1.2.2. Образование нейрофибрилл 17
1.2.3. Оксидативный стресс 18
1.2.4. Дефицит холинергической системы 19
1.2.5. Дефицит нейротрофических факторов 20
1.2.6. Воспаление, повышение уровня глютамата и Са2+ 23
1.2.7. Гибель нейронов 24
1.3. Терапевтические подходы к лечению БА 28
1.3.1. Предотвращение образования амилоидных бляшек 30
1.3.2. Снижение количества гиперфосфорилированного белка тау 31
1.3.3. Заместительная и нейропротективная терапия 31
1.4. Основные характеристики препарата ноопепт 35
1.5. Модели для изучения БА 40
1.5.1. Трансгенные животные, как модель развития пресенильной БА 41
1.5.2. Исследование старых животных, как модели спорадической БА 42
1.5.3. Имитация нарушений, характерных для БА 42
1.5.4. Модель введения диабетогенного токсина, стрептозоцина 44
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Экспериментальные животные 47
2.2. Фармакологические препараты 47
2.3. Методы тестирования когнитивных способностей 48
2.3.1. Водный лабиринт Морриса 48
2.3.2. Трехкамерная модель УРПИ 50
2.4. Примененные модели БА 52
2.4.1. Введение амилоидного пептида 25-35 (Ар 25-35) в ядра Мейнерта 52
2.4.2. Моделирование холинергического дефицита 53
2.4.2.1. Острое введение холиноблокаторов мышам 53
2.4.2.2. Однократное введение холиноблокаторов крысам 54
2.4.2.3. Хроническое введение холиноблокаторов 55
2.4.3. Введение диабетогенного токсина стрептозоцина 56
2.4.3.1. Системное (внутрибрюшинное) введение стрептозоцина 56
2.4.3.2. Оценка когнитивных эффектов в тесте УРПИ у крыс в условиях внутрижелудочкового введения стрептозоцина 57
2.4.3.3. Внутрижелудочковое введение стрептозоцина (исследование биохимических параметров) 59
2.4.3.3.1. Изучение влияния ноопепта на изменение биохимических параметров тканей мозга, у крыс после внутрижелудочкового введения стрепозоцина 59
2.4.3.3.1.1. Определение уровня экспрессии генов BDNF uNGF. 61
2.4.3.3.1.2. Измерение уровня окисления липидов (измерение малонового диалъдегида) 65
Глава 3. Результаты экспериментов 66
3.1. Изучение влияния ноопепта на обучаемость и память у крыс, нарушенные введением амилоидного пептида Ар 25-35 в ядра Мейнерта 66
3.2. Эффект ноопепта на моделях холинергического дефицита 69
3.2.1. Влияние ноопепта на обучаемость и память мышей линий BALB/c и C57BL/6J в упрощенном тесте водного лабиринта Морриса 70
3.2.2. Влияние ноопепта на обучаемость и память мышей линий BALB/c, нарушенные однократным введением скополамина или мекамиламина в тесте водного лабиринта Морриса 74
3.2.2.1. Нарушения, вызванные скополамином 74
3.2.2.2. Нарушения, вызванные мекамиламином 76
3.2.3.1. Амнезия, вызванная скополамином 78
3.2.3.2. Амнезия, вызванные мекамиламином 81
3.2.4. Влияние ноопепта на способность выполнять упрощенный тест водного лабиринта Морриса при длительном введение скополамина 84
3.3. Изучение влияния ноопепта на животных, подвергшихся действию стрептозоцина. 86
3.3.1. Изучение влияния ноопепта на когнитивные способности животных, подвергнутых внутрибрюшинному введению стрептозоцина 86
3.3.2. Оценка влияния ноопепта на обучаемость и память у крыс, нарушенные стрептозоцином, введенным в желудочки моза 89
3.3.2.1. Изучение влияния ноопепта на биохимические показатели тканей мозга крыс, подвергшихся внутрижелудочковому введению стрептозоцина 91
3.3.2.1.1. Влияние ноопепта на экспрессию нейротрофических факторов у крыс, подвергшихся внутрижелудочковому введению стрептозоцина 91
3.3.2.1.2. Влияние ноопепта на экспрессию нейротрофических факторов у интактных крыс 93
3.3.2.1.3. Влияние ноопепта на оксидативный стресс, вызванный введением стрептозоцина в э/селудочки мозга. 95
Заключение 97
Выводы 111
Список сокращений из
Список литературы: 114
- Образование амилоидных бляшек
- Заместительная и нейропротективная терапия
- Водный лабиринт Морриса
- Эффект ноопепта на моделях холинергического дефицита
Введение к работе
Актуальность проблемы. Спорадическая болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее значимой причиной старческого слабоумия. Каждые 5 лет после 65-летнего возраста частота заболевания БА удваивается. В мире каждый год в ряды больных БА вливается новые 4.6 миллионов человек, а число больных, одномоментно страдающих БА в мире по данным современных статистик достигает 26 млн. человек (Ferri et al., 2005). Общая численность больных, страдающих БА, в России приближается к 1,4 млн. человек.
Болезнь Альцгеймера представляет собой сложный комплекс различных патогенных процессов, основными из которых являются накопление амилоидных бляшек и нейрофибрил, дефицит холинергической передачи, гибель нейронов, снижение количества ростовых факторов, нарушение когнитивных функций. Данные процессы тесно взаимосвязаны, развитие одного из них активизирует остальные. Совокупность патогенетических факторов БА характеризуется отношениями "замкнутого круга", в котором все факторы связаны закономерностями прямой и обратной связи (Longo et al, 2004; Гаврилова, 2004; Shelat et al., 2008). В связи с этим терапевтические воздействия на течение болезни Альцгеймера должны быть направлены на поиск возможностей разорвать этот замкнутый круг в максимальном количестве звеньев. Оптимальный сценарий терапии должен состоять в применении препаратов, влияющих одновременно на несколько основных патогенетических звеньев заболевания. Другим важным требованием к этим препаратам является отсутствие токсических эффектов при длительном превентивном применении. Это требование обусловлено необходимостью начала терапии на самых ранних этапах аккумуляции бета-амилоида, когда клинические проявления БА еще не диагностируются — на фазе мягкого когнитивного нарушения (МКН), представляющей собой промежуточную
стадию между "успешным" старением и деменцией, и обуславливающей
повышенный риск развития деменции в течение ближайших 3-5 лет. Таким
разнонаправленным действием в сочетании с низкой токсичностью могут
обладать пептиды, как многокомпонентные регуляторы эндогенной природы.
Известно, что практическое применение пептидов в качестве лекарственных
препаратов затруднено ввиду их низкой биологической устойчивости. В
качестве рациональных подходов к преодолению этих затруднений описаны
такие приемы как использование активных фрагментов сложных пептидов,
модификация их структуры, например введением D-изомеров аминокислот,
стабилизирующих группировок (Каменский и др., 1989; Ашмарин и др. 1997;
Мясоедов и др., 1999; Гривенников, 2006).
Оригинальный подход, развиваемый в НИИ Фармакологии РАМН в
течение более чем двух десятилетий, может быть охарактеризован как дизайн
коротких пептидов на основании имитации структуры непептидного
нейротропного средства (Гудашева и др., 1985). В случае поиска веществ,
улучшающих когнитивные функции, в качестве непептидного прототипа
выбран стандартный ноотроп, пирацетам, а в качестве пептидного-
вазопрессин (АВП), точнее его основной метаболит, АВП 4-9. Из
синтезированной на основании этого подхода серии производных ацил-
пролил-глицинов (Gudasheva et al., 1996, Seredenin et al 1995) был отобран для
более подробного изучения этиловый эфир г\[-фенилацетил-Ь-пролилглицина
(соединение ГВС-111, ноопепт). Детальное экспериментальное изучение
этого соединения выявило наличие у него совокупности ноотропных и
нейропротективных эффектов (Ostrovskaya et al., 1994; Островская и др.,
2002). Последующее клиническое изучение Ноопепта, выполненное в рамках
I, II и III фаз, на больных с мягкими когнитивными нарушениями
цереброваскулярного и посттравматического генеза, показало, что препарат
оказывает отчетливое терапевтическое действие в отношении основных
проявлений психоорганического синдрома, ослабляя когнитивные нарушения
и оказывая анксиолитическое действие (Бочкарев и др., 2008; Незнамов и др.,
2007; Аведисова и др., 2007). Учитывая также тот факт, что ноопепт обладает многокомпонентным нейропротективным действием и усиливает выработку антител к Р-амилоиду (Ostrovskaya et al, 2007), представляет интерес изучить его эффект при более тяжелых формах когнитивной недостаточности, в частности при БА. Для оценки перспективности этих исследований необходимо исследовать эффект препарата на экспериментальных моделях БА. Известно, что моделирование спорадической БА осуществляется с помощью хирургических и инъекционных моделей (Van Dam, 2006), при том последняя группа является наиболее информативной (Степаничев и др., 2002).
Целью данного исследования являлось комплексное изучение поведенческих и нейрохимических эффектов ноопепта на следующих типах моделей БА: введение В-амиломдного пептида 25-35 в ядра Мейнерта, моделирование холинергического дефицита, введение диабетогенного токсина стрептозоцина.
Основные задачи исследования.
1. Изучение эффекта ноопепта при нарушениях когнитивных функций,
вызванных введением амилоидного пептида 25-35 в ядра Мейнерта.
2. Изучение влияния ноопепта на обучаемость и память животных в условиях
холинергического дефицита различного характера.
Сравнение эффектов диабетогенного токсина стрептозоцина при системном и внутримозговом введении.
Изучение когнитивных эффектов ноопепта на отобранной модели воздействия стрептозоцина.
Оценка влияния ноопепта на экспрессию нейротрофических факторов NGF и BDNF в коре головного мозга и гиппокампе у интактных животных и после воздействия стрептозоцина.
Исследование влияния ноопепта на выраженность оксидативного стресса в условиях стрептозоциновой модели.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что ноопепт ослабляет амнестическое действие амилоида 25-35, введенного в ядра Мейнерта. Этот эффект проявляется как в условиях профилактического введения, так и при введении на фоне развившейся патологии. В последнем случае он продемонстрирован в условиях введения препарата, начатого спустя 15 дней после нанесения повреждающего воздействия, что свидетельствует о большом "терапевтическом окне" действия препарата на этой модели. При сравнении обучаемости и долговременной памяти у мышей линии BALB/c и C57BL/6J показано, что у мышей первой линии имеется дефицит долговременной памяти, который устраняется введением ноопепта. На двух моделях пространственной ориентации и памяти (водный лабиринт и трехкамерная версия УРПИ) показано, что нарушение этих процессов более выражено в условиях блокады мускариновых, чем никотиновых рецепторов. Разработана модель хронического холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина (с последующей отменой) мышам линии BALB/c. Выполнено сравнительно изучение эффекта диабетогенного токсина стрептозоцина в условиях его системного (внутрибрюшинного) введения и введения в желудочки мозга. Поскольку при системном введения стрептозоцина развивается гипергликемия, а при его введении в желудочки мозга сохраняется нормальный уровень глюкозы в крови, модель внутрижелудочкого введения является предпочтительной. Показано, что стрептозоцин вызывает снижение экспрессии нейротрофических факторов в гиппокампе и накопление продукта перекисного окисления липидов - МДА. Установлено, что ноопепт ослабляет изученные метаболические эффекты стрептозоцина и сопутствующий поведенческий дефицит, проявляющийся в отношении долговременной памяти.
Научно-практическая значимость. Предложенные экспериментальные
подходы расширяют методологию изучения веществ эффективных для
профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний. Совокупность
выявленных эффектов ноопепта, направленных на некоторые базовые механизмы БА, свидетельствует о целесообразности изучения этого препарата у больных Б А (начальные и умеренные формы).
Образование амилоидных бляшек
Амилоидные бляшки образуются из коротких секретируемых пептидов, образующихся при разрезании белка - предшественника амилоида (АРР). Показано, что эти образования обладают нейротоксичностью и ответственны за развитие дегенеративных изменений в близлежащих нейронах (Citron, 2004).
Интерцеребральное введение определенных фрагментов АРР (например, амилоидогенного фрагмента АВ 25-35), приводит к агрегации этих пептидов с образованием амилоидных бляшек. Введение таких пептидов приводит к развитию картины нарушения когнитивных способностей, характерной для БА (Liao et al., 2007), что подтверждает важную роль образования амилоидных бляшек в патогенезе БА.
Предшественник амилоида является трансмембранным белком, синтезируемым клетками нервной ткани. Предполагаемыми функциями данного белка являются участие в процессе миграции нейронов и Прганел транспорте. Недостаток АРР у мышей ведет к небольшим изменениям фенотипа — снижению веса тела и снижению локомоторной активности. Утрата АРР и его гомолога APLP2 ведет к более тяжелым последствиям -ранней постнатальной гибели без выраженных морфологических аномалий в мозге (von Koch et al., 1997).
Образование амилоидных пептидов происходит в организме постоянно. Сразу после секреции эти пептиды проявляют достаточно слабую склонность к агрегации и достаточно быстро уничтожаются протеазами, это предотвращает образование таких бляшек в норме. Однако если время жизни амилоида увеличивается, в этих пептидах может произойти переход остатка аспартата в другую изоформу (Roher et al., 1993). Такой пептид уже обладает высокой способностью к агрегации. Таким образом, для образования амилоидных бляшек необходимо, чтобы амилоидные пептиды долгое время накапливались в межклеточной жидкости. Для этого необходимо, чтобы происходило либо увеличение продукции амилоида, либо снижение активности протеаз, расщепляющих амилоидный пептид в межклеточной жидкости. Активность протеаз, расщепляющих внеклеточный амилоид, снижается с возрастом. Продукция амилоида, как правило, определяется действием протеаз, осуществляющих вырезание амилоида из полипептидной цепочки белка -предшественника. Высокая активность этих протеаз может быть вызвана мутациями. В норме повышение активности этих ферментов может быть ответом на окислительный стресс, воспалительные процессы и на снижение уровня нейротрофических факторов (White et al., 1999; Villa et al., 2001).
Амилоид образуется из АРР в результате двух протеолитических расщеплений (Рис 1). Сначала АРР расщепляется Р-секретазой или р-сайт АРР - разрезающим ферментом, с образованием мембрано-связанного фрагмента длинной в 99 аминокислоты, названного С99 или P-CTF (Vassar et al., 1999). В исследованиях Apelt и соавторов было показано, что активность р-секретазы возрастает в случае оксидативного стресса (Apelt et al., 2004).
Второе расщепление происходит в гидрофобном трансмембранном домене и приводит к образованию Р-амилоида (Brown et al., 2000). Это расщепление осуществляется у-секретазой (Рис 1). Важной молекулой, ассоциированной с у-секретазой, является пресенилин. Семейство пресенилинов состоит из двух близкородственных членов - PS1 и PS2 и неродственных членов, один из которых является сигнальной пептидазой, которая удаляет связанные с мембраной сигнальные белки. Пресенилины являются многофункциональными белками, которые могут функционировать как протеазы в каталитическом центре у-секретазного комплекса, осуществляющего расщепление АРР и других субстратов. Кроме пресенилина в данный комплекс входят никастрин и усилитель пресенилина- 2. Коэкспрессия всех этих четырех белков (но не трех из них) увеличивает активность у-секретазы в трансфицированных клетках. Более того, этих 4-х белков достаточно для восстановления активности у-секретазы, экспрессированной в дрожжах. Пока неясно, какую роль играет каждый из них в формировании активного у-секретазного комплекса (Wolfe, 2008).
Разрезание, осуществляемое у-секретазами, может происходить с образованием различных по патогенности продуктов. При расщеплении белка АРР в у-сайте происходит образование пептида, содержащего 40- или 42-гидрофобных аминокислотных остатка, склонных к агрегации в растворе. Наибольшей патогенностью обладает 42-аминокислотный пептид(Епкзеп et al., 2003).
Не всегда протеолитическое разрезание АРР приводит к образованию патогенного пептида; а-секретаза расщепляет АРР в области , характерной для патогенных пептидов. Разрезанный таким образом АРР уже не способен продуцировать при дальнейшем протеолизе опасные пептиды (Etcheberrigaray et al., 2004; Qin et al., 2006). Недавние исследования показали, что активность данного фермента зависит от функционирования сигнального пути М-холинергической передачи. Так, было показано, что при инъекции мышам, трансгенным по АРР, блокатора М-холинергической передачи скополамина снижается активность а-секретазы и ускоряется процесс образования амилоидных бляшек (Liskowsky et al, 2006).
Негативное влияние амилоида обусловлено его способностью воздействовать на ряд клеточных рецепторов, вызывающих активацию стресс-киназного каскада. Активизация данного каскада приводит к образованию нейрофибрилл, развитию оксидативного стресса и гибели клеток. Амилоид воздействует на рецепторы ацетилхолина, нейротрофина, на АРР белок, экспонированный на поверхности клеток, и ряд других рецепторов (Рис 2).
До недавнего времени предполагалось, что именно процесс образования амилоидных бляшек приводит к развитию слабоумия Альцгеймерового типа. Однако, подробные исследования биопсийного и аутопсийного материала показали, что тяжесть деменции альцгеймеровского типа, отражающая прогрессирование заболевания, в большей мере коррелирует не с количеством амилоидных бляшек, а с плотностью нейрофибриллярных клубков и утратой синапсов (Masliah et al, 1994; Masliah, 1995). По мнению H.Braak и E.Braak (1996), патогенетически более значимым процессом, вызывающим гибель нейронов и развитие деменции, является накопление гиперфосфорилированного нерастворимого тау-протеина, который составляет основу парноскрученных филамент, образующих нейрофибриллярные клубки. Гиперфосфорилирование белка тау осуществляется целым рядом киназ, наиболее значимой из которых является киназа гликогенсинтетазы 3(3 (glycogen synthase kinase-3 (GSK-3)) (Gozes, 2002). Активация этого фермента происходит по целому ряду причин: воздействие на клетки токсичных амилоидных пептидов, оксидативный стресс, снижение уровня ростовых факторов и нарушение холинергической передачи (Вгаак and Вгаак, 1994; Вгаак and Вгаак, 1996). Фактами, подтверждающими справедливость гипотезы о важности процесса образования нейрофибрилл в патогенезе БА, служат данные об иерархическом распространении нейрофибриллярной патологии, соответствующей последовательным переходам в развитии болезни от инициальных доклинических симптомов к мягкой и далее к умеренной и тяжелой деменции (Braak and Вгаак, 1996; Berg et al., 1993).Однако механизм патогенного действия нейрофибрилл на данный момент изучен достаточно слабо.
Заместительная и нейропротективная терапия
Заместительная терапия в настоящее время представлена, в основном, препаратами, преодолевающими холинергический дефицит. К холинопозитивным препаратам относятся, прежде всего, ингибиторы холинэстераз (ИХЭ). Эта группа препаратов хронологически является первой и до настоящего времени наиболее развитой среди препаратов, предлагаемых для лечения Б А. Три ингибитора холинэстеразы: донепецил, галантамин, ривастигмин в настоящее время используются для лечения начальных и умеренных форм БА. Донепецил, как и галантамин, характеризуются селективным угнетением АХЭ, ривастигмин угнетает также и бутирил-ХЭ. Эти препараты проявляют близкий спектр побочных эффектов (токсическое поражение печени, желудочно-кишечного тракта). Важным направлением холиномиметической стратегии лечения БА является поиск агонистов мускариновых (мАХР) и никотиновых холинорецепторов. В настоящее время на различных стадиях испытаний находятся следующие препараты: частичные агонисты мАХР, AF102B, AF150(S), селективный агонист Ml и М4-подтипов рецепторов Xanomeline, препарат АВТ 418. Холиномиметические функции могут быть реализованы холин-высвобождающими веществами (Gliatilin), а также путем ингибирования обратного захвата холина (соединение МКС-231).
Важнейшими нейропротективными веществами могли бы быть нейротрофические факторы, дефицит которых играет важную роль в патогенезе БА. Однако, попытки их клинического применения путем введения в желудочки мозга (с целью преодоления ГЭБ), были осложнены возникновением тяжелых побочных эффектов, таких как боль, потеря веса, нарушения сна. Указанная совокупность фактов определяет целесообразность разработки различных синтетических низкомолекулярных нейротрофических факторов и пептидомиметиков нейротрофинов, эффективных при системном введении. Альтернативой этого подхода может служить введение синтетических стимуляторов образования NGF, идебенона и пропентофиллина.
Нейропротективное направление лечения БА представлено веществами, ослабляющими нейротоксические эффекты глютамата, а также препаратами, влияющими на два других элемента патологической "метаболической триады" - накопление избыточного кальция и свободных радикалов. Исходя из представлений о значении чрезмерной активации NMDA - подтипа глютаматных рецепторов в механизмах нейродегенерации, очевидна целесообразность использования антагонистов этого типа рецепторов. Антагонисты NMDA- рецепторов с высокой аффинностью, МК-801 и фенциклидин, вследствие свойственного им психотомиметического эффекта, не могут быть применены в качестве терапевтических средств. Однако препарат мемантин, сочетающий свойства неспецифического антагониста NMDA-рецепторов с умеренной аффинностью и агониста АМРА/каинатных рецепторов, продемонстрировал эффективность у больных с умеренно-тяжелой деменцией (Гаврилова и др., 2003, Klafki et al., 2006). Антиоксидантная стратегия создания препаратов для лечения БА может быть представлена двумя основными направлениями: введением экзогенных антиоксидантов и стимуляцией внутриклеточных антиоксидантных систем. К числу препаратов первого типа можно отнести альфа-токоферол (витамин Е), селегилин. Эффективных препаратов, индуцирующих эндогенные антиоксидантные системы, до настоящего времени не описано.
Анализируя всю совокупность патогенетических факторов БА, следует подчеркнуть, что взаимоотношения этих факторов следует охарактеризовать как систему "замкнутого круга", в которой все факторы связаны закономерностями прямой и обратной связи (Longo et al., 2004; Гаврилова и др., 2008). Например, оксидативный стресс является и последствием токсического действия амилоидов, и фактором, усугубляющим амилоидогенез. Он усиливает нарушение ионного гомеостаза, накопление кальция увеличивает чувствительность нейронов к повреждающему действию амилоида. Токсические формы бета-амилоида нарушают ацетилхолиновую передачу и функции нейротрофических факторов, в ответ на это нейроны повышают продукцию бета-амилоида, который, в свою очередь, усиливает холинергичский дефицит. Дефицит холинергической нейро-трансмиссии также интенсифицирует фосфорилирование ТАУ. Представления об этом "замкнутом круге" дает рис.3. Терапевтические воздействия на течение БА должны быть направлены на поиск возможностей разорвать замкнутый круг.
Водный лабиринт Морриса
Прибор, предложенный впервые автором метода, Д. Моррисом (Morris, 1984), для оценки пространственной ориентации и памяти (круглый бассейн, заполненный непрозрачной водой, в которую погружена небольшая «безопасная платформа», невидимая животному), в дальнейшем нашел широчайшее применение в различного рода нейробиологических исследованиях, связанных с изучением механизмов пространственной ориентации и памяти и выявлением путей фармакологического воздействия на них. В литературе описано много вариантов режима эксперимента на лабиринте Морриса, при этом бассейн обычно имел размеры, аналогичные предложенным в оригинальной работе (диаметр 150-200 см, высота 50-60 см). В настоящей работе использовали модифицированный вариант теста Морриса (Лильп и др., 1997). Размер бассейна был значительно меньше, чем в оригинальном варианте. Экспериментальная установка представляла собой пластиковый бассейн (70x55x60 см), который наполняли водой на высоту 25 см , 27-28С, забеленной молоком. В одном из углов этого бассейна помещали платформу диаметром 7 см.
В нашей работе эксперимент проводили по двум протоколам: без предварительного ознакомления и с предварительным ознакомлением. Ранее при использовании теста УРПИ было показано, что в случае предварительного ознакомления обучение является более эффективным, чем в его отсутствии (Трофимов и др., 1992). Исходя из этого, для демонстрации наличия улучшающего эффекта препарата применялся протокол без предварительного ознакомления, ведущий к исходно низкому уровню обучаемости. Режим с предварительным ознакомлением применялся в том случае, когда в задачу исследования входило выявление роли той или иной медиаторной системы (в частности холинергической) в реализации эффекта изучаемого вещества. В этом случае введение блокатора соответствующей медиаторной системы вело к ухудшению обучаемости; вводя на этом фоне ноотроп, мы могли выявить нормализующий эффект вещества и таким образом установить играет ли данная медиаторная система роль в реализации эффекта изучаемого соединения.
Протокол проведения опыта без предварительного ознакомления животного с установкой. В данной версии опыта платформа была сразу погружена под воду на 0,5 см. При обучении мышь помещали в дальний от платформы угол, и регистрировали время нахождения ею платформы. Если в течение 60 сек животное платформу не находило, его помещали туда вручную и оставляли на ней на 10 сек. Для каждой мыши проводили 5 повторных предъявлений с интервалом 15 минут. Через 10 дней тестирование следа памяти проводили по той же схеме, что и в первый день опыта. За 15 мин до начала тестирования мышей каждой из 2 линий (BALB/c, C57BL/6J) делили на 2 группы по 15 животных в каждой. Схема введения препарата при проведении теста ВЛ без ознакомления. Протокол проведения опыта с предварительным ознакомлением животного с установкой. В этом эксперименте использовался аналогичный бассейн, но с платформой, выступающей на 1 см над поверхностью воды, схема приведена на рис.9. Эксперименты по этому протоколу проводили только на мышах линии BALB/c, поскольку в экспериментах первого типа было показано, что у них имеется дефицит долговременной памяти, предположительно связанный с более низким содержданием ацетилхолина в тканях мозга. Для ознакомления каждую мышь запускали в бассейн с 8 различных стартовых позиций (N, S, Е, W, N-W, N-E, S-W, S-E). Если в течение 60 сек животное не находило платформу, его помещали туда вручную и оставляли на ней на 10 сек. Эксперименты выполнены на 3-х группах животных (подробное описание на стр.51). Через 24 часа проводили тестирование - серию из 5 предъявлений теста, аналогичного протоколу, описанному в предыдущем подразделе. Через 10 дней проводили повторное тестирование следа памяти по тому же протоколу.
Проведено исследование на двух вариантах экспериментальных установок: широкоиспользуемой двухкамерной (Буреш и Бурешова, 1991) и трехкамерной (Иноземцев и др., 1998). Трехкамерная установка УРПИ, позволяющая, наряду с оценкой состояния кратковременной и долговременной памяти оценить также ее пространственный компонент, имеет размеры 60x30x35 см и разделена на три равные отсека.
Все эксперименты выполнялись по общей схеме. В первый день проводилось ознакомление с камерой в течении 3-х минут. Обе дверцы, ведущие в темные отсеки, были открыты. Крысу помещали в центральный отсек экспериментальной установки. На второй день производилась выработка УРПИ, для чего дверца животное помещалось в камеру с закрытой дверцей, ведушей в левый отсек. Когда животное заходило в правый отсек, ему через электрифицированный пол наносились 5 неизбегаемых ударов тока силой 1 мА с интервалом 5с. Фиксировался латентный период (ЛП) захода в темный отсек.
Эффект ноопепта на моделях холинергического дефицита
Ранее в электрофизиологических экспериментах Т.А. Греченко на изолированных нейронах виноградной улитки было показано, что ноопепт усиливает выраженность нейронального ответа на микроионтофоретическое подведение ацетилхолина к постсинаптической мембране. Поскольку было установлено, что ноопепт не подавляет активность ацетилхолинэстеразы, этот эффект трактовался как доказательство его холино сенсибилизирующего действия на пост-синаптическом уровне (Островская и др. 2001). В свете современных представлений о холинергическом дефиците как одном из ведущих патогенетических механизмов БА (Coyle et al., 1983; Lawrence and Sahakian, 1998; Tong and Hamel, 1999) изучение вопроса о значении холинергического механизма в реализации поведенческих эффектов ноопепта представляет специальный интерес. Этот аспект действия ноопепта изучен нами в несколько этапов. На первом этапе было изучено влияние ноопепта на способность к обучению в тесте водного лабиринта. Данный тест использовался нами для оценки пространственной ориентации и долговременной памяти у двух линий мышей BALB/c и C57BL/6J. Мыши этих линий характеризуются рядом поведенческих и биохимических особенностей (Середенин и др., 2004), и в их числе различие в уровне активности холинергической системы (Ingram and Corfman, 1980). На следующем этапе исследования эффект ноопепта изучался в условиях дефицита холинергической передачи, моделируемого у мышей и крыс однократным либо длительным введением холиноблокаторов.
Известно, что характерной чертой деменций Альцгеймеровского типа, связанной, в основном с холинергическим дефицитом, является нарушение пространственной ориентации и памяти (Coyle et al., 1983; Lawrence and Sahakian, 1998; Гаврилова, 2003). Наиболее распространенным тестом для определения способности животных к пространственной ориентации является тест водного лабиринта Морриса (D Hooge and Deyn, 2001). С помощью данного теста была исследована способность ноопепта влиять на процесс формирования пространственной памяти и сохранность памятного следа. Для тестирования препарата были использованы мыши двух линии: BALB/c и C57BL/6J.
Предполагалось, что использование животных указанных линий позволит установить, отличаются ли они по показателям памяти, если отличаются, то каковы эффекты ноопепта в отношении памяти у каждой из этих линий. Поскольку одной из причин этих межлинейных различий может быть разная представленность холинергической системы, на следующем этапе планировалось получить более прямые доказательства связи эффекта ноопепта с его холинотропным действием в экспериментах с использованием различных приемов блокады холинергической системы.
Мыши C57BL/6J. У мышей данной линии в первой серии предъявлений (обучение) время поиска скрытой платформы от 1-ой к 5-ой высадке снижалось. Введение ноопепта не влияло на динамику обучения. При отставленном тестировании (сохранение навыка) через 10 дней мыши линии C57BL/6J быстрее находили скрытую платформу, чем при обучении. Тот факт, что время, затраченное на поиск скрытой платформы при первом предъявлении в сеансе отсроченного тестирования следа памяти было статистически значимо короче такого для первого предъявления при обучении, соответствует представлениям Р.И. Крутикова об отставленной дополнительной консолидации (Крутиков, 1981). Во время тестирования воспроизведения навыка достоверных различий во времени отыскания платформы между контрольной и опытной группами также не было обнаружено (Рис. 17), что вероятнее всего является следствием исходного высокого уровня обучаемости и памяти у мышей C57BL/6J. Рис. 17. Динамика отыскания подводной платформы в тесте с упрощенным лабиринтом Морриса мышами линии C57BL/6J при обучении и при тестировании воспроизведения навыка через 10 дней.
Мыши BALB/c. Для мышей линии BALB/c было показано снижение времени поиска скрытой платформы от первой к пятой высадке (Рис. 18). Животные, которым за 15 мин до эксперимента вводился ноопепт (0,5 мг/кг, в/б), тратили на поиск платформы меньше времени, чем животные контрольной группы. Таким образом, у мышей данной группы в контроле происходит обучение в данном тесте и ноопепт облегчает процесс обучения.
При тестировании воспроизведения навыка через 10 дней у мышей контрольной группы время, затраченное на отыскание скрытой платформы в первом предъявлении, не отличалось от этой величины на этапе обучения. Это указывает на то, что долговременный компонент пространственной памяти у мышей линии BALB/c реализуется хуже, чем у мышей C57BL/6J. При этом, как и при обучении, время, затраченное на поиск платформы, уменьшалось от первого к пятому предъявлению. Иными словами, у мышей контрольной группы практически не сформировалось следа памяти при данном режиме обучения.
Поскольку для линии BALB/c характерен меньший уровень ацетилхолина в гиппокампе и коре головного мозга по сравнению с мышами линии C57BL/6J (Ingram and Corfman, 1980), можно полагать, что этот факт и определяет худшую долговременную память у мышей линии BALB/c. Таким образом, эта линия может рассматриваться в качестве модели нарушения холинергической системы мозга, являющейся мишенью для действия ноопепта, как препарата с холинопозитивной активностью. Однако дефицит холинергической системы не является единственной и основной чертой, отличающей мышей BALB/c от C57BL/6J. В связи с этим представлялось целесообразным установить, будет ли ноопепт эффективен в случае избирательного дефицита холинергической системы, создаваемого введением ее блокаторов. При этом на первом этапе исследования были выполнены эксперименты с их однократным, а затем, с повторным введением на мышах линии BALB/c.
