Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Механизмы гибели нейронов при ишемическом инсульте 10
1.1.1. Современные представления о биохимических изменениях при локальной ишемии 10
1.1.2. Механизм апоптотической гибели нейронов при ишемии 13
1.1.3. Взаимосвязь стресса, развития депрессий и нейродегенеративных заболеваний 16
1.2. Мозговой нейротрофический фактор - BDNF 18
1.2.1. Характеристика нейротрофинов 19
1.2.2. BDNF - член семейства нейротрофинов 20
1.2.3. Строение и регуляция гена BDNF 22
1.2.4. Рецепторы нейротрофинов 24
1.2.5. Экспрессия BDNF в нервной системе 28
1.2.6. Взаимовлияние различных факторов и экспрессии BDNF 30
1.2.6.1. Связь с нейромедиаторами 30
1.2.6.2. Связь с гормонами 34
1.2.7. Влияние стресса на экспрессию BDNF в различных структурах мозга 35
1.2.8. Фармакологические подходы к регуляции уровня BDNF 38
1.3. Афобазол - новый селективный анксиолитик 40
2. Материалы и методы исследований 45
2.1. Определение уровня BDNF методом иммуноферментного анализа 46
2.2. Тест «Открытое поле» 48
2.3. Моделирование окислительного стресса и глутаматнои токсичности in vitro 50
2.3.1. Модель глутаматной токсичности 50
2.3.2. Модель окислительного стресса 51
2.4. Методы оценки жизнеспособности нейронов в культуре
2.4.1. МТТ-тест 52
2.4.2. Окраска флюоресцентным ядерным красителем Хёхст 53
2.5. Иммунофлюоресцентный метод определения активной каспазы-3 53
2.6. Статистическая обработка результатов 54
3. Нейропротекторные свойства афобазола в экспериментах IN VITRO
3.1. Исследование нейропротекторного действия афобазола на модели окислительного стресса 55
3.2. Исследование нейропротекторного действия афобазола на модели глутаматной токсичности 60
3.3. Исследования влияния афобазола на активную каспазу-3 67
3.4. Изучение влияния афобазола на уровень BDNF в культуре клеток НТ-22 70
4. Оценка влияния афобазола на уровень bdnf в различных структурах мозга в экспериментах IN VIVO
4.1. Исследование содержания BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в различное время года 72
4.2. Изменения уровня BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c при стрессовых воздействиях 77
4.3. Влияние афобазола на содержание BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в условиях эмоционального стресса 83
Заключение 104
Выводы 116
- Мозговой нейротрофический фактор - BDNF
- Афобазол - новый селективный анксиолитик
- Исследование нейропротекторного действия афобазола на модели глутаматной токсичности
- Влияние афобазола на содержание BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в условиях эмоционального стресса
Введение к работе
Актуальность темы
Эпидемиологические данные свидетельствуют, что по распространенности инсульт занимает третье место после болезней сердца и нововобразований, являясь ведущей причиной смертности. В России ежегодно регистрируется свыше 400 тыс. случаев инсульта (Дамулин И.В. и соавт., 2003; Захаров В.В. и соавт., 2004).
В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении патогенетических механизмов сосудистых заболеваний мозга. Ишемия головного мозга имеет следствием последовательное развитие патобиохимических реакций глутамат-кальциевого каскада, сопровождаемых активацией свободно-радикальных процессов. Гиперпродукция активных форм кислорода на фоне дефицита антиоксидантной защиты приводит к развитию «окислительного стресса». Избыточное накопление Са вызывает активацию внутриклеточных ферментов - фосфолипаз, протеинкиназ и эндонуклеаз, за которым следует повреждение и гибель клеток (Berridge М., 1985; Hakim A. et al., 1989; Orrenius S. et al., 1992; Olney J., 1994; Гусев E. и соавт., 2001). Установлена роль апоптоза в формировании очагов поражения нервной ткани (Deshmukh М. et al., 1996). Определена роль нейротрофинов, в частности мозгового нейротрофического фактора BDNF, в защите нейронов от повреждений (de Luca A. et al., 1996).
Анализ литературных данных показывает, что биохимические механизмы повреждения нервных клеток при ишемии сходны с вызванными стрессовыми воздействиями (Ecsh Т. et al., 2002). Стрессовые события рассматриваются в качестве этиопатогенетического фактора ишемических нарушений. С другой стороны, усиление анксиогенеза отмечается в симптомокомплексе постишемических расстройств и неиродегенеративных заболеваний. Патофизиологические исследования показывают, что при ишемических повреждениях включаются эндогенные механизмы
нейропротекции (Knusel В. et al., 1992; Sendtner M., 1999). Терапия инсультов также основана на применении неиропротекторных средств, в составе которых присутствуют транквилизаторы и антидепрессанты (Гусев Е. и соавт., 2001).
Таким образом, разработка и изучение новых лекарственных средств, сочетающих анксиолитические и нейропротекторные свойства, является актуальной задачей современной фармакологии.
В ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН разработан и
внедрен в медицинскую практику селективный анксиолитик афобазол
(Seredenin S., 2003). Накоплены сведения о наличии у афобазола
нейропротекторной активности. Так, установлено, что афобазол усиливает
мозговой кровоток и повышает выживаемость крыс в условиях глобальной
преходящей ишемии, вызванной перевязкой сонных артерий (Силкина И.В. и
соавт., 2004), снижает выраженность патоморфологических изменений
«пенумбры» в условиях локальной ишемии, вызванной перевязкой средней
мозговой артерии (Баласанян М.Г., 2003), снижает выраженность
неврологических нарушений на модели интрацеребральной
посттравматической гематомы (Галаева И. и соавт., 2005). Полученные данные подтверждают перспективность дальнейшего изучения механизмов реализации сочетанного анксиолитического и нейропротекторного эффекта афобазола, что будет способствовать расширению спектра его применения в клинической практике.
Цель исследования
Доказать наличие нейропротекторной активности афобазола в опытах in vitro и участие в механизме действия препарата мозгового нейротрофического фактора BDNF на экспериментальных моделях in vitro и in vivo.
Задачи исследования
1. Изучить нейропротекторную активность афобазола на модели
окислительного стресса в культуре нейронов.
2. Изучить нейропротекторную активность афобазола на модели глутаматной
токсичности в культуре нейронов.
3. Исследовать влияние афобазола на активную каспазу 3 в культуре
нейронов.
4. Изучить влияние афобазола на уровень BDNF в культуре нейронов.
Выявить изменения уровня BDNF в мозговых структурах инбредных мышей C57BL/6 и BALB/c при стрессовых воздействиях.
Фармакологически изучить влияние афобазола на динамику изменения содержания BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c, вызванных стрессовыми воздействиями.
Научная новизна
В результате впервые проведенного исследования нейропротекторной активности нового селективного анксиолитка афобазола в культуре клеток показано, что афобазол в концентрациях, близких к зарегистрированным в плазме крови, после системного введения в терапевтических дозах, обладает защитным действием при повреждении гиппокампальных нейронов перекисью водорода и глутаминовой кислотой. Установлено, что в условиях глутаматной токсичности афобазол препятствует гиперактивации каспазы-3 в культуре клеток линии НТ-22.
Впервые установлены межлинейные различия в содержании мозгового нейротрофического фактора BDNF в структурах головного мозга инбредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Показано, что у интактных животных уровень нейротрофина выше у мышей линии BALB/c. Стрессовое воздействие вызывает длительное снижение уровня BDNF у мышей BALB/c, в отличие от C57BL/6, у которых вслед за
кратковременным снижением уровня нейротрофина, следует его восстановление до исходных значений.
Впервые показана способность афобазола повышать уровень BDNF в культуре нейронов. Доказано, что афобазол в дозе 5 мг/кг при повторных введениях восстанавливает уровень мозгового нейротрофического фактора в коре, гипоталамусе и стриатуме мышей BALB/c, сниженный в результате стрессовых воздействий.
Одновременно установлены межлинейные различия в эффектах стрессирующих воздействий и афобазола на уровень BDNF у мышей C57BL/6 и BALB/c, что подтверждает генетически детерминированные различия в механизмах формирования эмоционально-стрессовой реакции животных этих линий.
Научно-практическая значимость
Установленные защитные свойства афобазола и способность регулировать содержание BDNF раскрывают механизмы его нейропротекторного и анксиоселективного эффекта и обосновывают дальнейшие фармакологические исследования с использованием BDNF в качестве мишени.
Специфика изменений BDNF, выявленная у животных с различной эмоционально-стрессовой реакцией, указывает на необходимость учета фенотипа ответа на стресс не только при терапии анксиолитиками, но и при проведении лечебных мероприятий, направленных на нейропротекцию.
Результаты выполненных исследований являются составляющей материалов доклинического изучения афобазола в качестве нейропротекторного средства, необходимых для представления в регистрационную систему Минздравсоцразвития РФ.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на XII Российском Национальном
Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2005), на 8-й
Региональной конференции Европейской коллегии по
нейропсихофармакологии (Москва, апрель 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, сентябрь 2005), на 4-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, март 2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающий 20 отечественных и 224 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 44 рисунками.
Мозговой нейротрофический фактор - BDNF
Большое значение в развитии процессов ишемического повреждения ткани мозга имеет недостаточность трофического обеспечения. Естественной защитной реакцией мозга в первые минуты ишемии является синтез трофических факторов и рецепторов к ним. При быстрой и активной экспрессии генов, кодирующих нейротрофины, ишемия мозга может длительно не приводить к инфарктным изменениям (Takeda A. et al., 1992). В случае же формирования ишемического повреждения высокий уровень трофических факторов обеспечивает регресс неврологического дефицита даже при сохранении морфологического дефекта, его вызвавшего (Гусев В. и соавт., 2001). Нейротрофины - семейство структурно-родственных белков, которые способствуют выживанию и дифференцировке нейронов центральной и периферической нервной системы. Нейротрофины могут также регулировать рост аксонов и дендритов, формирование, созревание и стабилизацию синапсов (McAllister A. et al., 1999; Poo М., 2001). В зрелой нервной системе нейротрофины регулируют как краткосрочную синаптическую передачу, так и долговременное потенцирование (LTP), участвуя, таким образом, в обеспечении пластичности нервной системы, необходимой для её нормального функционирования (Katz L. et al., 1996). Семейство нейротрофических факторов представлено следующими белками: 1) Фактор роста нервов (nerve growth factor - NGF) (Levi-Montalcini R. et al., 1953) - был идентифицирован первым из нейротрофинов и является наиболее изученным. NGF играет важную роль в процессах созревания и поддержания жизнедеятельности холинергических нейронов нижних отделов переднего мозга и нейронов симпатической нервной системы (Levi-Montalcini R., 1987). 2) Мозговой нейротрофический фактор (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) (Leibrock J. et al.,1989).
Его основными мишенями являются некоторые сенсорные нейроны периферической нервной системы (ПНС), холинергические нейроны переднего мозга, ГАМК-ергические нейроны переднего, промежуточного мозга и стриатума, нейроны гиппокампа, мотонейроны, нейроны ресничного ганглия, дофаминергические нейроны черной субстанции (Segal R. et al.,1992; Alderson R. et al.,1990; Ventimiglia R. et al.,1995; Oppenheim R. et al.. 1992; Johnson J. et al.,1986; Hyman С et al., 1991). 3) Нейротрофин-3 (neurotrophin-3, NT-3) (Hohn A. et al.,1990; Maisonpierre P. et al.,1990) - способствует созреванию и выживанию дофаминергических и ГАМК-ергических нейронов среднего мозга, нейронов гиппокампа, мотонейронов спинного мозга, мышечных сенсорных нейронов (Чекалина Н., 1997). 4) Нейротрофин-4/5 (neurotrophin-4/5, NT-4/5) (Hallbook F. et al., 1991) - воздействует на сенсорные нейроны, мотонейроны, нейроны ресничного ганглия (Davies A. et al.,1993). 5) Нейротрофип-6 (neurotrophin-6, NT-6) - был обнаружен у рыб Xiphophorus. Оказывает воздействие, подобно NGF, на сенсорные нейроны и нейроны симпатической нервной системы (Gotz R. et al., 1994). 6) Нейротрофин-7 (neurotrophin-7, NT-7) — был выделен из рыбы Danio rerio. (Nilsson A. et al., 1998). Показано, что NT-7 в основном экспрессируется в периферических тканях (Lai К. et al., 1998) Нейротрофины первоначально синтезируются как предшественники белков или пронейротрофины (30-35 Кд), которые под действием N- гликозилирования и протеолиза превращаются в зрелые формы (Mowla S. et al., 2001). Эти последние белки имеют ряд частичных особенностей: сходное число аминокислот (118-120), близкий молекулярный вес мономера (13.2-15.9 Кд) и 50% идентичности в первичной структуре. Они формируют стабильные, не ковалентные димеры и обладают 6 цистеиновыми остатками, которые формируют три дисульфидных мостика (Maisonpierre P. et al., 1991). Основная структура состоит из различных доменов, которые определяют специфичность отдельных членов семейства, связывание со специфическими рецепторами и в результате их биологическое действие (Heumann R., 1994). 1.2.2. BDNF — член семейства нейротрофинов Нейротрофический фактор BDNF представляет собой белок с молекулярной массой 27кД. Мозговой нейротрофический фактор был впервые обнаружен в ткани головного мозга свиньи, а позже получен и из человеческого мозга (Barde Y. et al.,1982). Он обладает высокой гомологией с NGF, NT-3 и NT-4/5 (Robinson R. et al., 1995) и влияет на разные типы нейронов в ЦНС, кроме NGF-чувствительных симпатических нейронов (Henderson С. et al.,1996). Так, тригеминальные нейроны, которые в период раннего развития отвечают на воздействие BDNF и NT-3, в последствии переключаются и становятся зависимыми только от NGF (Buchman V. et al.,1993).
Мыши с низким уровнем мозгового нейротрофического фактора проявляют повышенную агрессивность, двигательную активность и склонность к ожирению (Lyons W. et al., 1999; Kernie S. et al., 2000). Это связано с нарушением функции серотонинэргической системы, введение, флуоксетина (селективный ингибитор обратного захвата 5-НТ) устраняет эти симптомы (Lyons W. et al., 1999). Введение BDNF снижает уровень глюкозы в крови и увеличивает содержание инсулина (Tsuchida A. et al., 2001). Нейротрофин усиливает процессы LTP в гиппокампе и блокирует процессы длительной нейрональной депрессии в зрительной коре (Kinoshita S. et al., 1999). Показано, что уровень мРНК для BDNF увеличивается в гиппокампе после тренировки в лабиринте Морриса (Kesslak J. et al., 1998) и 8-рукавном радиальном лабиринте (Mizuno М. et al., 2000). Однако следует иметь в виду, что при некоторых патологических-состояниях нейротрофины, включая BDNF, могут играть роль пронекротических факторов. В смешанной культуре клеток коры крыс, содержащей клетки глии и нейроны в среде без антиоксидантов показано, что длительное воздействие нейротрофинов приводит к развитию массового некроза. Он сопровождался возрастанием продукции активных форм кисорода, экспрессией цитохрома Ь558 (the plasma membrane-spanning subunit of NADPH oxidase). После воздействия BDNF увеличивалась экспрессия и активация NADPH оксидазы. Селективное ингибирование NADPH оксидазы предотвращало гиперпродукцию АФК и нейрональнукг гибель без воздействия на антиапоптотическое действие BDNF (Kim S. et al., 2002). Таким образом, нейротрофический эффект возрастает при блокаде пронекротического воздействия.
Афобазол - новый селективный анксиолитик
В НИИ фармакологии РАМН поиск новых селективных анксиолитиков ведется с использованием фармакогенетических позиций. Экспериментально было установлено, что у животных с выраженной реакцией страха бензодиазепины в низких дозах вызывают активирующее поведение действие, интерпретируемое как анксиолитическое. У животных, устойчивых к эмоционально-стрессовому воздействию бензодиазепины обладают дозо-зависимым седтшшш.м влиянием. Так, феназепам вызывал дозозависимый седативный эффект в тесте «открытое поле» у мышей линии C57BL/6 и активировал поведение мышей BALB/c (Середенин СБ. и соавт., 1998). Введение феназепама вызывало дозозависимое снижение уровня АКТГ у мышей С57В1У6. тогда как у мышей BALB/c снижение концентрации гормона происходило только после-введедия еназепама в дозе 0,05 мг/кг, т.е. в единственной дозе, вызывавшей у мышей этой линии анксиолитичеслий эффект (Seredenin S., 2003). Другие биохимические показатели: кортикостерон, циклические нуклеотиды, продукты перекисного окисления лигам лов также специфичны для фенотипа ЭСР (Бадыштов Б. А. и соавт., 1988; С:реденин СБ. и соавт., 1982, 1985, 1989). Эти данные были подтверждены ч п лабораторных экспериментах на здоровых добровольцах при анализе продуктивности операторской деятельности в условиях эмоционально-стрессового воздействия. В случаях, когда применяемый стресс стимулировал деятельность, бензодиазепины снижали ее продуктивность (Seredenin S., 2003). Таким образом, очевидно, что эффекты бензодиазепиновмх транквилизаторов зависят от генетически детерминированных типов ЭСР. С другой стороны, было установлено, что у животных с выраженной реакцией страха эмоционально-стрессовое воздействие вызывает резкое снижение рецепторных способностей ГАМК-бензодиазепинового рецептора. Рецепторы этих животных теряют чувствительность к эндогенным регуляторам рецепции - ГАМК и ионами СГ. У животных, устойчивых к применяемому виду стресса, эти параметры не изменяются. Во-вторых, обнаружено, что изменение заряда возбудимых мембран животных с выраженной реакцией страха приводит к значительному увеличению продукции активных форм кислорода. Данные изменения значительно меньше выражены у устойчивых к стрессу животных (Середенин СБ. и соавт., 1998).
Полученные /данные демонстрируют возможность конформационных, мембранозависиммх изменений в ГАМК-бензодиазепиновом рецепторе, приводящих к снижению доступности бензодиазепинового рецепторного участка к лигаьду, что, в свою очередь, должно привести к снижению ГАМК-трансмиссии и ЗІ-ксиогенному действию. Таким образом, была сформулирована гипотеза о новой мишени фармакологического воздействия, направленного на коррекцию мембранных изменений, развивающихся при эмоционально стрессовой реакции. На основе лой гипотезы в НИИ фармакологии РАМН был создан, препарат афобспол — 5-этокси-2-[2-(морфолино) -этилтио]бензимидазола дигидрохлориц. В экспериментах на животных с различными фенотипами ЭСР -мышах BALB/c и крысах линии MR (Maudsley Reactive) с реакцией замирания "freezing" и мышах C57BL/6 и крысах MNR (Maudsley Nonreactive) - с активным поведением в стрессовой ситуации, установлен селективный анксполитический эффект афобазола, направленный на "freezing" фенотип. Афобазол в дозах. 0,5-10 мг/кг эффективно устранял проявления реакции страха и не влиял на поведение активных животных. Клинические исследования подтвердили отсутствие у препарата седативных, ги.шотических и миорелаксантных свойств и свидетельствуют о наличии избирательного эффекта афобазола - в частности, у больных с астеническими личностными особенностями выявлено анксиолитическое действие пре урата, тогда как со стеническими особенностями -стимулирующее (11е?намов Г.Г. и соавт., 2005). При изу"-.а:н! .л .механизма действия афобазола было установлено, что препарат в концентрациях от 10"9 М до 10"4 М обладает выраженными антирндикальны - и свойствами (Seredenin S., 2003). С помощью теста ОП установлено, чти афобазол предотвращает падение бензодиазепиновой рецепции у МЬІІІ!СЙ ...янии BALB/c и восстанавливает чувствительность мембран к стимулирующему действию ионов СГ и ГАМК (Середенин СБ. и соавт.. 1998). Т.= ким образом, афобазол препятствует нарушениям функций ГАМК-бензодип?епинового рецепторного комплекса в процессе формирования ЭСР. На различных моделях нейрональных повреждений у животных показано, что афобазол обладает нейропротекторным механизмом. В условиях локальной ишемии, вызванной перевязкой средней мозговой артерии, препарат снижает выраженность патоморфологических изменений «пенумбры», как при предварительном введении, так и в пределах терапевтического окна. Цереброзащитный эффект афобазола при ишемии мозга реализуемся путем активации энергетического обмена за счет восстановления активности сукцинатдегидрогеназы, сниженной при ишемии. Также показана способность афобазола подавлять NO-синтазный путь образования оксида азота в нейронах головного мозга крыс путем предотвращен и :і повышения активности нейрональной NOS. Этот эффект афобазола сопровождался снижением тревожности у животных, наблюдаемой н условиям локальной ишемии мозга (Баласанян М.Г., 2003). Установлено, что афобазол усиливает мозговой кровоток и повышает выживаемость у ыс в условиях глобальной преходящей ишемии, вызванной перевязкой сон-их артерий (Силкина И.В. и соавт., 2004). Препарат повышает усто Фшкслт- мембранных структур нейронов коры и стриатума к свободнорадик; .тьным процессам, вызванным глобальной преходящей ишемией голокчемо мозга. В этих условиях препарат увеличивает в коре активность антиоксидантного фермента каталазы (Силкина И.В., 2005). На мої.І ли экспериментально вызванной интрацеребральной поеттравматич .чкои гематомы (геморрагического инсульта) Галаевой и соавт. (2005) показано повышение выживаемости крыс при курсовом применении афобззола, улучшение процессов обучения, памяти и снижение неврологических нарушений (парезы, параличи, боковые положения).
Представленные в опытах in vivo данные указывают на наличие анксколитически.ч и нейропротекторных свойств у селективного, анксиолитика апооачола и подтверждают перспективность его дальнейшего изучения на други моделях in vivo и in vitro. Необходимо выяснить обладает ли афооазол ненропрогекторными свойствами в экспериментах in vitro на модели окисли к."ьного стресса и глутаматной токсичности. Представляется важным изучить влияние афобазола на уровень мозгового нейротрофического фактора BDNF, с целью выяснения роли нейротрофинов в реализации чеипопротекторной активности препарата. Выявление механизмов реализации сочетанного анксиолитического и нейропротектописго эффекта афобазола будет способствовать расширению-спектра его применения в клинической практике. Исследования проводили на 102 мышах-самцах инбредной линии BALB/c, 102 мышах-самцах инбредной линии C57BL/6 массой 18-20 г., полученных из питомника «Столбовая» РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН не менее 2 недель до начала эксперимента по 10 особей в клетке на обычной диете, при свободном доступе к воде и нормальном 12-ти часовом световом режиме. Эксперименты выполняли утром от 9 до 12 ч. In vitro эксперименты проводили на клетках линии НТ-22 (иммортализованные клетки гиппокампа), любезно предоставленные профессором Ф. Виегантом из отдела молекулярно-клеточной биологии Утрехтского университета (Голландия). В работе использовали селективный анксиолитик афобазол, синтезированный в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, антитела и буферные растворы для определения BDNF, культуральную среду ДМЕМ (ICN), ростовую сыворотку (FBS) (ICN), фосфатно-солевой буфер (PBS) (Sigma), поли-Ь-лизин гидробромид (ICN), МТТ-реагент (3-(4,5 диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (ICN), диметилсульфоксид (DMSO) (ICN), Tris-HCl (Serva), ингибиторный протеазный коктейль (Biomol), реактив Фолина (Merck), бычий сывороточный альбумин (Sigma), культуральные флаконы, пробирки, планшеты (Corning and Costar).
Исследование нейропротекторного действия афобазола на модели глутаматной токсичности
Моделирование глутаматной токсичности способствует гибели нейронов подобно ишемическому инсульту и хроническим нейродегенеративным заболеваниям (Stanciu М. et al., 2000). Экзогенный глутамат блокирует обратный захват цистеина в клетках, путем ингибирования глутамат-цистеинового антипорта, который приводит к снижению уровня внутриклеточного цистеина и глутатиона. Истощение, глутатиона сопровождается накоплением свободных радикалов, избытком Са2+ и гибелью клетки (Maher P. et all., 1996; Tan S. et al., 1998). В наших экспериментах мы исследовали влияние афобазола в разные промежутки времени на выживаемость клеток после моделирования глутаматной токсичности. Нейропротекторное действие афобазола исследовали при внесении препарата в культуральную среду за 24 часа, за 30 минут, сразу после введения глутаминовой кислоты и через 1, 16, и 20 часа в конечных концентрациях 10"8 М и 10"5 М. Для этого использовали глутаминовую кислоту в конечной концентрации 5 тМ с последующей инкубацией в течение 8 часов, которая, как и перекись водорода, вызывала снижение жизнеспособности нейронов на 25% (р 0.05). Эти результаты согласуются с литературными данными, в которых инкубация клеток с глутаминовой кислотой (5 тМ) в течение 8, 10 и 12 часов вызывала значительную гибель клеток с морфологическими признаками апо-некроза (Tan S. et all., 1998; Stanciu M. et al., 2000). При предварительном внесении афобазола в культуру за 24 часа до повреждения защитное действие зарегистрировано в конечной концентрации 10"8 М (рис. 3.4), поэтому в дальнейших экспериментах использовалась именно эта концентрация. вызванной окклюзией средней мозговой артерии (Баласанян М., 2003; Мирзоян Р.С. и соавт., 1996). Таким образом, полученные результаты показали, что афобазол в концентрациях, близких к имеющимся в плазме крови после системного введения в терапевтических дозах, обладает защитным действием при повреждении гиппокампальных нейронов перекисью водорода и глутаминовой кислотой. Известно, что апоптоз сопровождается активацией каспазного каскада и развертыванием биохимических и морфологических изменений в клетке (конденсация хроматина, фрагментация ДНК, сжатие клетки) (Nicholson D. et al., 1997).
Каспазы играют ключевую роль в апоптозе, расщепляя специфические белки и приводя к клеточной смерти (Wei L. et al., 2004). Среди всех каспаз выделяется каспаза-3, т.к. она часто активируется рядом клеточных сигналов смерти и расщепляет ряд важных клеточных протеинов (Namura S. et al., 1998; Troy С. et al., 2002). Активация каспаза-3 подобных протеаз вероятно имеет место в неирональном апоптозе и инсульте мозга (Wei L. et al., 2004), к тому же выявлена активная форма каспазы-3 в зоне ишемической пенумбры (Zhu Н.С. et al, 2004). Имеется много литературных данных об активации каспазы-3 от 12 до 48 часов после ишемии у крыс (Manabat С. et al., 2003; Zhu Н. et al., 2004) и внесение ингибиторов каспаз в этот временной промежуток значительно снижает гибель клеток (Tan S. et al., 1998). Нами было в предыдущей серии экспериментов показано, что афобазол обладает защитными свойствами при моделировании окислительного стресса и глутаматной токсичности нейронов через 1, 16, 20 и 24 часа после повреждения. В это время при моделировании глутаматной токсичности в культуре клеток отмечаются морфологические повреждения клеточных органелл: аппарата Гольджи, структур эндоплазматического ретикулума, митохондрий, ДНК (Behl С. et al., 1994; Kerr J. et al., 1995). Поэтому представлялось интересным установить влияние афобазола на процесс апоптоза через активную каспазу-3 . Для этого афобазол добавляли в конечной концентрации 10"8 М сразу после развития повреждения глутаминовой кислотой (5 мМ) в течение 24 часов. Окраску на активную каспазу-3 исследовали через 8 часов после добавления препарата с помощью специфических антител к этому белку. Исследования показали значительную активацию каспазы-3 в клетках поврежденных глутаматом. Эти данные согласуются с исследованием о присутствии каспазы-3 в зоне ишемического повреждения (Zhu Н.С. et al, 2004). К тому же было установлено, что внесение афобазола в исследуемой Q конечной концентрации 10" М препятствует гиперактивации каспазы-3 (рис. 3.9). При этом добавление афобазола к интактным клеткам так же не приводило к полному ингибированию активности каспазы-3 (не отличалось от контроля), для которой выявлены важные неапоптотические функции. Активность каспазы-3 является основой протеолитического механизма, необходимого для реализации долговременной нейропластичности. Ингибирование каспазы-3 нарушает обучение реакции активного избегания у крыс, приводит к гибели клеток по некротическому пути (Gulyaeva N., 2003). Поэтому важно не ингибировать каспазу-3, а ограничить ее гиперактивацию при патологических состояниях. Таким образом, нейропротективные свойства афобазола при моделировании глутаматнои токсичности и окислительного стресса могут быть связаны с ограничением гиперактивации эффекторной апоптотической каспазы-3. Располагая данными относительно способности афобазола повышать выживаемость нейронов в условиях окислительного стресса и глутаматной токсичности (как основных моделей ишемии), мы провели изучение эффектов препарата на уровень трофических факторов. Создание высоких концентраций нейротрофинов в областях мозга с развивающейся апоптотической гибелью нейронов, считается одним из перспективных подходов к терапии нейродегенеративынх заболеваний, в частности ишемии (Lindsay, 1994). В связи с этим, нами было исследовано влияние афобазола в различных концентрациях на уровень нейротрофического фактора мозга -BDNF в культуре клеток НТ-22. Данные иммуноферментного анализа по изучению содержания BDNF показали, что афобазол достоверно увеличивает уровень нейротрофина в конечных концентрациях причем наибольшее увеличение (на 25%) отмечено при внесении препарата в конечной концентрации 10 8 М (рис. 3.10). Эти данные согласуются с полученными при изучении защитных свойств афобазола на моделях гибели нейронов.
Полученные данные о влиянии афобазола на уровень нейротрофина BDNF в культуре гиппокампальных клеток НТ-22 послужили основой дальнейшего изучения влияния афобазола на BDNF в экспериментах in vivo у мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Иммуноферментный анализ выполнен на базе Института молекулярной генетики РАН, лаб. молекулярной генетики соматических клеток (рук. к.б.н. И.А.Гривенников). 4.1. Исследование содержания BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в различное время года В исследованиях использовали мышей двух линий - C57BL/6 и BALB/c. Ранее было установлено, что анксиолитический эффект афобазола отчетливо выражен у животных, характеризующихся пассивным «freezing» типом поведения в условиях стресса - мышей BALB/c и крыс MR. У животных с активным типом ЭСР - мыши C57BL/6 и крысы MNRA, эффект препарата не выявляется (Середенин СБ. и соавт., 1998). Работами многих авторов доказана концепция генетической природы ЭСР: показано, что стресс представляет собой важный эволюционный фактор и характер поведенческих реакций животных в ответ на эмоциональный стресс генетически детерминирован (Broadhurst P.L., 1975; Beliaev D., 1979). Полученные за последние годы данные не оставляют сомнений, что различия в индивидуальных реакциях на эмоциональный стресс определяются комплексом наследственных и средовых факторов (Clement et al., 2002). В качестве экспериментальных моделей разных фенотипов ЭСР были выделены две линии инбредных мышей: мыши C57BL/6, с активным типом поведения и низкой меткой дефекации, и BALB/c - с пассивным freezing ответом и высокой меткой дефекации в тесте «открытое поле» (Hall С, 1934; Бородин П.М. и соавт., 1976). Эти животные отличаются по своему ответу и на бензодиазепиновые транквилизаторы: анксиолитический эффект с активирующим компонентом установлен у мышей BALB/c, в то время как мыши линии C57BL/6 отвечают дозозависимой седацией. Известно, что эти линии животных резко отличаются по основным нейрохимическим и нейрогуморальным механизмам стрессового ответа (Seredenin S., 2003). Установлено, что у BALB/c в условиях стресса в мозговой ткани регистрируется повышение уровня оксида азота, в то время как C57BL/6 содержание NO в мозге особых изменений не претерпевает (Баласанян М.Г., 2003).
Влияние афобазола на содержание BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в условиях эмоционального стресса
Полученные в предыдущей серии экспериментов данные о существовании межлинейных различий в изменениях уровня BDNF в ответ на эмоциональный стресс, в совокупности с данными об анксиоселективном действии афобазола, направленном на «пассивный» фенотип ЭСР, послужили основой для исследования влияния афобазола на изменения содержания мозгового нейротрофического фактора в ответ на стрессирующее воздействие в гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и коре. Афобазол вводили мышам линий BALB/c и C57BL/6 в/б в дозе 5 мг/кг. В экспериментах № 1, № 2 и № 3 животных декапитировали через 1, 3 или 24 часа после последнего воздействия, соответственно. Схемы экспериментов представлены на рис. 4.6, 4.15, 4.23. Выбор дозы афобазола основывался на экспериментальных данных, в которых препарат оказывал выраженное анксиолитическое действие в дозе 5 мг/кг (Seredenin S., 2003). Выбор данных временных точек был обусловлен имеющимися литературными данными об изменениях уровня BDNF в короткие сроки после стресса (Smith М.А. et al., 1995а; Marmigere F. et al., 2003) и в более поздние сроки - мРНК для BDNF и белка (Smith М.А. et al., 19956; Ueyama Т. et al., 1997; Murakami S. et al., 2005). Для оценки влияния афобазола на уровень нейротрофина животных разделили на 5 групп, по 6 мышей каждой линии в группе: Группа 1 — исходный контроль. Мышей декапитировали моментально после взятия из клетки. Группа 2 - контроль на стрессирующее воздействие handling, включающий манипуляции с перемещением животных из клетки и в/б введением физиологического раствора. Забой производили через 1, 3 или 24 часа после инъекции. Группа 3 - handling и в/б введение афобазола в дозе 5мг/кг (20 мкл). Забой производили через 1, 3 или 24 часа после инъекции препарата. Группа 4 - на фоне handling через 1 час после инъекции физиологического раствора мышей помещали в тест ОП в модификации П.М. Бородина (Seredenin, 2003). Забой животных производили через 1, 3 или 24 часа после эксперимента в ОП. Группа 5 - на фоне handling через 1 час после в/б инъекции афобазола в дозе 5 мг/кг мышей помещали в тест ОП. Забой животных производили через 1, 3 или 24 часа после эксперимента в ОП. Из рисунка 4.7, 4.8 и 4.10 видно, что handling приводит к достоверному уменьшению BDNF в гипоталамусе, в гиппокампе и коре на 25%, 15% и 53% (р 0,001), соответственно у мышей BALB/c. В этих структурах афобазол статистически достоверно предотвращал наблюдаемое снижение.
В стриатуме через 1 час после handling уровень нейротрофина повышался в 1,5 раза, аналогичное действие оказывал афобазол (рис. 4.9). Помещение мышей BALB/c в ОП не приводило к дополнительному снижению содержания BDNF в гипоталамусе и в гиппокампе (рис. 4.7, 4.8), а в стриатуме и коре (рис. 4.9, 4.10) его уровень не отличался от исходного Анализ изменений BDNF через 3 ч после handling показал, что у мышей BALB/c уровень нейротрофина достоверно увеличивался в гиппокампе, коре (рис. 4.16, 4.18) и уменьшался в стриатуме (рис. 4.17). Афобазол достоверно увеличивал уровень BDNF во всех структурах, кроме гиппокампа. Помещение мышей BALB/c в ОП приводило к снижению содержания мозгового нейротрофического фактора в гипоталамусе (рис. 4.15), а в остальных структурах его уровень не отличался от исходного контроля (рис. 4.16-4.18). Эффекты афобазола через 3 ч после стрессирующих воздействий не были выражены. Полученные данные соответствуют результатам предыдущих работ, демонстрирующих падение содержания BDNF в структурах мозга после эмоционально-стрессового воздействия, а также исследованиям, в которых были установлены разнонаправленные для отдельных структур сдвиги (Smith М. et al., 1995; Rasmusson A. et al., 2002; Tapia-Arancibia L. et al., 2004). Полученные данные указывают на выраженные различия в реакциях животных исследованных линий, оцененных по изменениям BDNF в тесте ОП. Если у BALB/c наблюдали противоположные эффекты эмоционально-стрессового воздействия и афобазола на уровень мозгового нейротрофического фактора, то у C57BL/6 в большинстве случаев таких закономерностей не выявлено. Эти результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о высокой чувствительности мышей BALB/c к эмоционально-стрессовому воздействию в ОП и резистентности к таковому у C57BL/6 (Hall С, 1934; Seredenin S., 2003). Отмеченное соответствие дополняется данными, показывающими, что в экспериментах, включающих воздействие новой обстановки, афобазол вызывал анксиолитическое действие у мышей BALB/c, не влияя на C57BL/6 (Seredenin S., 2003). Изменения в уровне BDNF, зарегистрированные в 24-часовом эксперименте, также подтверждают имеющиеся межлинейные различия в характере эмоционально-стрессовой реакции исследованных животных. Отсутствие через 24 часа выраженных эффектов афобазола может быть объяснено недостаточностью однократного введения препарата. Изменения уровня BDNF при 4-х кратном введении афобазола в течение 24 часов Для проверки выдвинутой гипотезы выполнена дополнительная серия опытов, в которой уровень BDNF исследовали у мышей, испытавших в качестве стрессирующего воздействия handling и в/б введение физиологического раствора через каждые 6 часов в течение суток — контрольная группа (группа 2). В опытной группе после взятия животных из клетки через каждые 6 часов в течение суток, в/б вводили афобазол в дозе 5мг/кг (группа 3). Данные о содержании мозгового нейротрофического фактора, установленные через 6 часов после последней инъекции, приведены в таблице 4.3. Контрольные показатели исходного уровня BDNF, также определенные в данной серии, соответствовали ранее зарегистрированным (группа 1). Как видно из таблицы 4.3, стрессирующее воздействие handling приводило к достоверному снижению BDNF в гипоталамусе, стриатуме и коре мышей BALB/c на 18% (р 0,001), 21% (р 0,01) и 28% (р 0,001) соответственно. Афобазол при 4-кратном введении предотвращал наблюдаемое снижение, достоверно повышал уровень нейротрофина по сравнению с группой, которой вводили физраствор. Противоположный эффект отмечен в гиппокампе. У мышей C57BL/6 на фоне handling достоверное снижение BDNF выявлено в гипоталамусе и в коре, а в гиппокампе и стриатуме его содержание увеличивалось.
На фоне афобазола более высокий уровень BDNF по сравнению с воздействием handling отмечен лишь в гипоталамусе, в остальных структурах содержание нейротрофина было меньшим (табл. 4.3). Таким образом, в дополнительной серии опытов показано, что стрессирующее воздействие вызывает выраженное падение уровня BDNF в исследованных структурах мозга мышей BALB/c, за исключением гиппокампа. Зарегистрированное повышение уровня BDNF в гиппокампе при повторном стрессирующем воздействии может отражать процесс запоминания. Существует точка зрения, что увеличение содержания BDNF в гиппокампе способствует запоминанию события, вызвавшего установленный сдвиг (Tapia-Arancibia L. et al., 2004). С этой точки зрения объяснение повышения уровня BDNF в гиппокампе при повторном handling и инъекциях физиологического раствора можно связывать с феноменом habituation, который менее выражен при введении афобазола, снижающего уровень тревоги. Афобазол, при повторных введениях, препятствовал уменьшению содержания нейротрофина у мышей BALB/c. Другая направленность влияния стрессирующих воздействий на уровень BDNF у мышей C57BL/6 подтверждает различия в механизмах формирования эмоционально-стрессовой реакции мышей BALB/c и C57BL/6 (Seredenin S., 2003). Объяснение этих фактов требует дополнительных исследований, однако очевидно, что линия мышей BALB/c, не устойчивых к примененному виду стресса, является более адекватной моделью для выполненного эксперимента. Установленные на мышах BALB/c противоположные влияния стрессирующего воздействия и афобазола на уровень BDNF, дают основание для заключения о связи выявленных изменений с механизмами как формирования фенотипа эмоционально-стрессового ответа с выраженной реакцией страха, так и анксиоселективного эффекта афобазола. Поскольку нейротрофические факторы, включая BDNF, играют важную роль в механизмах нейропротекции (Sendtner М., 1999; Wellmer A. et al., 2001), полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о сочетании анксиолитических и нейропротекторных свойств афобазола и возможной реализации этих факторов, через регуляцию мозгового нейротрофического фактора BDNF. Ишемические поражения головного мозга и нейродегенеративные заболевания занимают все больший процент в структуре заболеваемости людей в развитых странах.
Похожие диссертации на Экспериментальное исследование нейропротекторных свойств афобазола
![Экспериментальное исследование нефропротекторных свойств глицина [Электронный ресурс]](/i/i/4506/184806.png "Экспериментальное исследование нефропротекторных свойств глицина [Электронный ресурс] Селиванова Ольга Сергеевна")
