Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Актуальные проблемы поиска новых средств, обладающих психотропной активностью 14
1.1. Принципы строения и функционирования ЦНС, обеспечивающие устойчивость к действию ксенобиотиков 15
1.1.1. Нейронная организация мозга 17
1.1.2. Медиаторная полибиохимичность ЦНС как объект действия лекарственных средств 19
1.1.3. Принципы организации работы головного мозга на клеточном и системном уровнях 23
1.2. Действие лекарственных средств на ЦНС 24
1.2.1. Точки приложения средств, действующих на ЦНС 25
1.2.2. Проблемы клинического применения основных классов препаратов, влияющих на ЦНС 26
1.3. Проблемы использования электроактивированных водных растворов в медицине 39
Глава II. Материалы и методы исследования 46
2.1. Исследование общебиологического действия католита и анолита в экспериментах на инфузориях-туфельках (Paramecium caudatum) 52
2.1.1. Экспресс-оценка биологической активности электроактивированных водных растворов 53
2.1.2. Оценка биологической активности католита и анолита методом функциональной нагрузки 54
2.1.3. Изучение скорости роста инфузорий-туфелек при культивировании в среде с добавлением католита и анолита 55
2.2. Методы изучения влияния католита и анолита на состояние мышечного тонуса и координацию движений экспериментальных животных 55
2.2.1. Методика «вращающегося стержня» 55
2.2.2. Бегущая дорожка (тредмил) 56
2.3. Методы изучения возможной ноотропной активности ЭАВР 56
2.3.1. Тест «Условная реакция пассивного избегания» 56
2.3.2. Тест «Экстраполяционное избавление»..: 58
2.3.3. Тест «Открытое поле» 59
2.3.4. Изучение влияния католита и анолита на физическую работоспособность 60
2.4. Методы исследования возможного анксиолитического действия электроактивированных водных растворов 61
2.4.1. Тест «Открытое поле» 61
2.4.2. Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» 61
2.5. Методы выявления потенциального анальгетического действия 63
2.5.1. Методика раздражения конечностей животных электрическим током 63
2.5.2. Тест «отдергивания хвоста» из горячей воды 64
2.6. Методы изучения антидепрессантной активности электроактивированных водных растворов 65
2.6.1. Тест «Подвешивание мышей за хвост» 65
2.6.2. Тест принудительного плавания в модификации для мышей 65
2.6.3. Методика моделирования клофелиновой депрессии с последующим введением ЭАВР 66
2.6.4. Тест «Экстраполяционное избавление» 67
2.7. Методики изучения нейропротекторной активности электроактивированных водных растворов 67
2.7.1. Методы изучения противогипоксической активности католита и анолита 67
2.7.2. Изучение противосудорожной активности католита и анолита на модели хемоиндуцированного эпилептогенеза 68
2.7.3. Модель острого стресса с использованием методики «Свободное плавание в клетке» 69
2.8. Методы исследования возможности влияния католита на формирование алкогольной мотивации у лабораторных животных 70
2.9. Математическая обработка материалов исследований 71
Глава III. Общебиологическое действие электроактивированных водных растворов в экспериментах на Paramecium caudatum 73
3.1. Экспресс-оценка биологической активности электроактивированных водных растворов натрия хлорида 73
3.2. Оценка биологического действия католита и анолита методом функциональной нагрузки 75
3.3. Изучение скорости роста инфузорий-туфелек при культивировании в среде с добавлением католита и анолита 75
Глава IV. Исследование ноотропных свойств электроактивированных водных растворов, а также их влияния на состояние мышечного тонуса и координации движений лабораторных животных 79
4.1. Влияние электроактивированных водных растворов на мышечный тонус и координацию движений лабораторных животных 79
4.1.1. Состояние мышечного тонуса и координации движений лабораторных животных в тесте «вращающийся стержень» под влиянием электроактивированных водных растворов 80
4.1.2. Исследование влияния католита и анолита на мышечный тонус и координацию движений лабораторных животных на бегущей дорожке (тредмил) 82
4.2. Ноотропная активность электроактивированных водных растворов 84
4.2.1. Результаты теста «Условная реакция пассивного избегания»...85
4.2.2. Результаты тесте «Экстраполяционное избавление» 88
4.2.3. Исследование ноотропнои активности католита и анолита в тесте «Открытое поле» 90
4.2.4. Действие католита и анолита на мышечную работоспособность лабораторных животных на бегущей дорожке (тредмил) 93
Глава V. Исследование анксиолитических свойств электроактивированных водных растворов 95
5.1. Результаты теста «Открытое поле» 95
5.2. Результаты теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» 102
Глава VI. Исследование анальгетического и антидепрессивного действия электроактивированных водных растворов 115
6.1. Анальгетическое действие электроактивированных водных растворов 115
6.1.1.Мето дика раздражения конечностей животных электрическим током 115
6.1.2. Тест «отдергивания хвоста» из горячей воды 117
6.2. Изучение антидепрессивной активности католита и анолита 119
6.2.1. Результаты теста «Подвешивание мышей за хвост» 119
6.2.2. Результаты тесте принудительного плавания в модификации для мышей 121
6.2.3. Моделирование клофелиновой депрессии с последующим введением электроактивированных водных растворов 122
6.2.4. Результаты теста «Экстраполяционное избавление» 131
Глава VII. Исследование нейропротекторной активности электроактивированных водных растворов 135
7.1. Изучение противогипоксической активности католита и анолита 135
7.2. Изучение противосудорожной активности католита и анолита на модели хемоиндуцированного эпилептогенеза 141
7.3. Модель острого стресса с использованием методики «свободное плавание в клетке» 144
Глава VIII. Исследование возможности влияния католита на формирование алкогольной зависимости у лабораторных животных 160
8.1. Формирование алкогольной мотивации у лабораторных животных 160
8.2. Оценка влияния католита на симптомы алкогольной абстиненции в условиях экспериментального алкоголизма 162
8.2.1. Исследование действия католита и анолита на поведенческие реакции экспериментальных животных в тестах «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт» 163
Глава IX. Возможные механизмы влияния электроактивированных водных растворов на ЦНС (обсуждение результатов исследования) 167
Заключение 178
Выводы 181
Практические рекомендации 182
Список литературы 183
Приложение
- Методы изучения влияния католита и анолита на состояние мышечного тонуса и координацию движений экспериментальных животных
- Методы изучения антидепрессантной активности электроактивированных водных растворов
- Оценка биологического действия католита и анолита методом функциональной нагрузки
- Ноотропная активность электроактивированных водных растворов
Введение к работе
Актуальность.
Психические заболевания являются острейшей медико-социальной
проблемой. 30% всего населения России имеет расстройства психического
здоровья и нуждается в лечебной либо консультативной помощи врача-
психиатра, психотерапевта или нарколога [7,8]. Ни при каких других классе
болезней не отмечается столь длительных сроков инвалидизации. Из общего
числа инвалидов вследствие психических болезней более 80%
инвалидизируются в трудоспособном возрасте, при этом 95% признанных нетрудоспособными остаются на пенсионном обеспечении пожизненно [134]. Психические нарушения часто сопровождают и усугубляют соматические болезни, всегда осложняют их течение и прогноз, влияют на эффективность терапии, нередко служат пусковым фактором для их развития [56, 164, 172, 188]. Анализ эпидемиологических данных показывает, что в последние годы отмечается значительный рост психических расстройств, обусловленных экологическим неблагополучием в отдельных регионах, интоксикационными факторами, а также хронической социально-стрессовой ситуацией [7,8].
Психофармакотерапия является в настоящее время самым эффективным методом коррекции психических расстройств [118, 134]. Психофармакологические препараты являются необходимой составляющей, стандартов комплексного лечения многих соматических патологий, ими широко пользуются кардиологи, гастроэнтерологи, гинекологи, анестезиологи и специалисты других областей медицины [118, 216]. В целом современные психотропные препараты представляют собой большой спектр лекарств, ставших неотъемлемой частью медицины. Но даже на современном уровне развития психофармакологии многие психотропные средства обладают недостаточной эффективностью, лишены избирательности действия и имеют большое количество побочных эффектов, нередко
9 заставляющих клиницистов решать вопрос о соотношении вреда и пользы [15, 172, 227]. В связи с этим актуальна проблема поиска новых психофармакологических средств, свободных от нежелательных эффектов, безопасных, эффективных, надёжных, экономичных [92].
Поскольку наш организм почти на три четверти состоит из воды, а головной мозг - от 68-77% (белое вещество) до 84-86% (серое вещество), то можно предполагать её важную роль для деятельности как всего организма человека, так и особенно для функции мозга. Наше внимание привлекли электроактивированные водные растворы - католит и анолит, которые потенциально могут влиять на водный сектор головного мозга, вызывая в нем изменения на физико-химическом уровне. В 1975 г. было открыто явление электрохимической активации водных растворов (ЭХАВ). ЭХАВ -совокупность электрохимического и электрофизического воздействия на воду в двойном электрическом слое электрода (либо анода, либо катода) электрохимической системы. В результате образуются элетрохимически активированные растворы - католит и анолит [28, 58]. В медицине электроактивированные растворы находят достаточно широкое применение. Имеются также данные о высокой лечебной эффективности электроактивированных растворов при различных гнойно-воспалительных процессах, гастритах, язвенной болезни желудка, геморрое, дерматомикозе, экземе, аденоме предстательной железы и хроническом простатите, тонзиллите, бронхите, хроническом пиелонефрите, хроническом гепатите, вирусном гепатите, деформирующих артрозах и т. д. [28, 55, 58, 100]. Тем не менее, фармакологических исследований этих растворов, как лекарственных средств, очень мало. В современной научной литературе практически отсутствуют данные о влиянии католитов и анолитов на центральную нервную систему. В связи с этим исследование психотропных эффектов электроактивированных водных растворов актуально и своевременно.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко, № государственной регистрации 01.200.700011.
Цель исследования: установить возможные психотропные эффекты элетроактивированных водных растворов натрия хлорида.
Задачи исследования:
Исследовать общебиологическое действие электроактивированных водных растворов в экспериментах на Paramecium caudatum.
Изучить возможность изменения мышечного тонуса и координации движений лабораторных животных при введении католита и анолита.
Выявить возможные антидепрессивный, анксиолитический, ноотропный эффекты католита и анолита.
Исследовать болевую чувствительность при введении электроактивированных водных растворов.
Изучить антигипоксические свойства католита и анолита.
Установить возможные противосудорожные и стресспротекторные эффекты электроактивированных водных растворов.
Исследовать влияние католита на ориентировочно-исследовательскую деятельность и состояние алкогольной абстиненции в условиях экспериментального алкоголизма.
Научная новизна исследования. В работе впервые получены данные о влиянии электроактивированных водных растворов на жизнедеятельность Paramecium caudatunm, отличающиеся тем, что католит и анолит в низких концентрациях вызывают изменения характера движений инфузорий-туфелек, увеличение продолжительности жизни парамеций при действии гипертонического раствора натрия хлорида и существенно снижают скорость роста этих клеток.
В работе получены ранее неизвестные данные об улучшении координации движений и мышечной выносливости при введении
электроактивированных водных растворов лабораторным животным. Впервые установлено, что католит обладает оригинальным спектром психотропной активности: проявляет при однократном введении анксиоактивируюшие, антидепрессивные, ноотропные свойства, а при длительном введении обладает анксиоседативной активностью. Показано, что анолит при однократном введении оказывает активирующее и ноотропное действие на ПНС лабораторных животных, а при длительном введении - седативное. Впервые получены данные о нейропротекторных свойствах электроактивированных водных растворов в условиях острого стресса, острой генерализованной гемической, гиперкапнической и гипобарической гипоксии, генерализованных судорог. Впервые выявлен анальгетический эффект католита при однократном парентеральном введении, сопоставимый с эффектом анальгина. При сформированной алкогольной мотивации в условиях эксперимента установлено позитивное влияние католита на объем принимаемого алкоголя и на ориентировочно-исследовательскую активность алкоголь-зависимых животных и на их состояние в период абстиненции.
Практическая значимость. Приведенные результаты исследования психотропной активности электроактивированных водных растворов указывают на перспективность дальнейшего клинического изучения анксиолитических, ноотропных и нейропротекторных свойств католита и анолита. Применение электроактивированных водных растворов в клинической практике позволит оптимизировать лечение, снизить дозировки применяемых психотропных препаратов, улучшить качество жизни больных психическими заболеваниями, уменьшить затраты на лечение — медицинская эффективность. Новые знания, полученные в диссертационной работе могут быть дополнением учебных курсов фармакологии, физиологии и психиатрии — теоретическая эффективность.
Материалы исследования используются в образовательном процессе кафедр фармакологии и психиатрии ВГМА им. Н.Н. Бурденко. Результат:
12 повышение качества знаний студентов по соответствующим разделам курса фармакологии — научно-теоретическая эффективность. Основные положения, выносимые на защиту:
1. При культивировании Paramecium caudatum в течение суток в среде с
добавлением католита и анолита в разведениях 1/100-1/1000 увеличивается
их продолжительность жизни при действии гипертонического раствора
натрия хлорида, а также при добавлении анолита и особенно католита
существенно снижается скорость их роста. После введения лабораторным
животным электроактивированных водных растворов миорелаксирующий
эффект отсутствует, наблюдается улучшение координации движений.
2. Электроактивированные водные растворы обладают ноотропным
действием, превосходящим пирацетам; при однократном парентеральном и
пероральном введении в объеме 1 мл/100 г массы тела оказывают
анксиоактивирующее действие. При употреблении электроактивированных
водных растворов внутрь вместо питьевой воды в течение 28 суток
наблюдается анксиоседативное действие. Католит при однократном
внутрибрюшинном введении в объеме 1 мл/100 г массы тела оказывает
анальгетическое действие, сопоставимое с анальгином. Католит при
однократном внутрибрюшинном введении в объеме 1 мл/100 г массы тела
обладает антидепрессивным эффектом, сопоставимым с мелипрамином.
3. Электроактивированные водные растворы при введении
лабораторным животным однократно внутрибрюшинно или перорально в
объеме 1 мл/100 г массы тела или внутрь вместо питьевой воды течение 3
суток оказывают антигипоксическое, противосудорожное и
стресспротекторное действие.
4. Введение внутрь католита снижает объем алкоголя, употребляемого
алкоголь-зависимыми крысами. В условиях экспериментального алкоголизма
выявлено позитивное влияние католита на состояние животных при
алкогольной абстиненции.
Апробация работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Я.В. Костина (г. Саранск, 2005 г.); на II, III Всероссийской Бурденковской студенческой научной конференции (г. Воронеж, 2006 г, 2007 г); на VIII, IX, X Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (г. Москва, 2006 г, 2007г, 2008 г); на III съезде фармакологов России (г. Санкт-Петербург, 2007 г); на II Международной научной конференции молодых ученых-медиков (г. Курск, 2008 г); на XVI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2008 г), на научной межкафедральной конференции кафедр фармакологии и нормальной физиологии (Воронеж, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендуемом ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 208 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 6 глав собственных результатов исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, научно-практических рекомендации и списка использованной литературы, включающего 155 отечественных и 96 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 25 рисунками.
Методы изучения влияния католита и анолита на состояние мышечного тонуса и координацию движений экспериментальных животных
Методика «вращающегося стержня» [47]. Тест используется для выявления миорелаксации, нарушений координации движений и равновесия, атаксии у лабораторных животных, вызванных введением фармакологически активных веществ. Подопытных животных (белых мышей) помещают на горизонтально расположенный стержень диаметром 5 см. Стержень приподнят на высоту 30 см, снабжен электромотором и вращается со скоростью 12 оборотов в мин. Мышь тестируется в течение 3 мин, регистрируется латентное время первого падения и общее количество соскальзываний животного со стержня (при падении животное помещалось назад на стержень, все посадки осуществлялись в пределах трех минут опыта). Уменьшение латентного периода первого падения и увеличение количества соскальзываний животных со стержня свидетельствует о наличии миорелаксирующего эффекта исследуемого вещества. Бегущая дорожка (тредмил) [40]. Бегущая дорожка (тредмил) используется для оценки влияния фармакологически активных веществ на мышечный тонус и работоспособность у лабораторных животных (белые мыши). Мышь помещается на бегущую дорожку шириной 6 см, длиной 25 см, дорожка ограничена с боков прозрачными бортиками высотой 10 см, сверху накрывается прозрачной крышкой; бортики имеют вентиляционные отверстия. Дорожка перемещается со скоростью 10 см/сек. В течение эксперимента ведется визуальное наблюдение за животным, при этом регистрируется общее время пробега вплоть до отказа мыши от бега, начало движения толчками, время появления шаткости походки и вокализации. Уменьшение общего времени пробега, уменьшение времени до появления движения толчками, шаткости и вокализации свидетельствует о наличии миорелаксирующего эффекта исследуемого вещества. «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) -является базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения [40]. Одним из самых обычных изменений поведения вследствие приобретенного опыта является торможение врожденной деятельности или приобретенных навыков, которые приводили к отрицательным последствиям для организма. Термин «пассивное избегание» используют для описания опытов, в которых животное обучается избегать вредных факторов путем подавления определенного поведения [35]. Тест УРПИ основан на защитно-оборонительной реакции пассивного типа, направленной на прекращение контакта с вредящим агентом.
В данном опыте животное обучается избегать болевое электрическое воздействие, при этом крыса должна выбрать несвойственный для нее тип реагирования - предпочесть освещенный отсек установки, тогда как стремление к темному закрытому пространству (норный рефлекс) является для грызунов экологичным типом поведения [35, 40]. Тест позволяет оценить влияние веществ на обучаемость, формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях амнезии. Установка для эксперимента УРПИ представляет собой два смежных отсека кубической формы, размерами 40x40x40 см. Один из отсеков затемнен со всех сторон и имеет электрифицированный пол, второй отсек открыт сверху и ярко освещен (90 Лк). Оба отсека сообщаются между собой через отверстие размерами 10x10 см. Тест выполняется в два этапа: на первом этапе производится обучение навыку пассивного избавления, на втором - воспроизведение его сохранности. Тестируемое животное помещается в центр освещенного отсека хвостом к отверстию в затемненный отсек. После того, как крыса заходит в темный отсек, ей наносится электроболевое раздражение (40 В, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с). Визуальное наблюдение ведется в течение 3 минут. При этом фиксируются следующие показатели: латентный период первого захода в темный отсек (время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек) и количество заходов в него. Поведение животного во время данного этапа эксперимента характеризует его обучаемость: чем меньше количество заходов в темную камеру, тем лучше обучаемость, а латентный период первого захода расценивается как показатель скорости принятия решения. Если животное за время наблюдения ни разу не заходит в темный отсек, его исключают из эксперимента. На втором этапе эксперимента электроболевая стимуляция не . проводится, при этом дополнительно фиксируется также суммарное время нахождения крысы в темном отсеке установки. Чем меньше крыса проводит в темной камере, тем лучше она помнит о нанесенном электроболевом раздражении, а увеличение латентного периода и уменьшение числа заходов указывают на обученность животного, сохранность в памяти информации об аверсивности темного отсека [35]. Для устранения посторонних обонятельных стимулов пол установки после каждого животного протирался спиртом. Тест «Экстраполяционное избавление» [32] является комплексной экспериментальной моделью для оценки когнитивных функций: обучаемости и памяти, а также поведенческого типа эмоционально-стрессовой реакции. В основе данного теста лежит постановка перед животным экстраполяционнои задачи, решение которой зависит от способности строить план поведения, предвидеть результат поведенческих реакций в новых условиях [5]. Эксперимент проводится на белых крысах с использованием установки «Экстраполяционное избавление». Принцип метода: тестируемое животное помещается в пластиковый сосуд ведро цилиндрической формы высотой 32 см, диаметром 30 см, заполненное на 16 см. водой, имеющей температуру 20-22С, под стеклянный цилиндрический колпак, диаметром 9 см. и высотой 18,5 см., края которого погружаются в воду на 2,5 см. В течение 3 мин. ведется визуальное наблюдение за животным. Для того чтобы избавиться от аверсивной водной среды, животное должно поднырнуть под края цилиндрического колпака. Регистрируется латентный период двигательной активности (время иммобилизации животного до начала активного движения конечностями) и латентный период подныривания. Животные, которые не смогли решить задачу в течение 3 минут, исключались из эксперимента. Через 24 часа эксперимент повторялся для проверки сохранности выработанного рефлекса.
В данном тесте животное подвергается аверсивному воздействию водной среды в условиях выраженного дефицита информации о способе избавления, что еще больше усугубляет страх животного. Животные с активным типом эмоционально-стрессовой реакции проявляют активные попытки выбраться из угрожающей ситуации — совершают относительно большое количество прыжков. Животные с пассивным типом эмоционально стрессовой реакции, напротив, относительно большой промежуток времени проводят в неподвижности, которую принимают за отказ от деятельности в экстремальной ситуации, «поведенческое отчаяние» традиционно расцениваемое как коррелят депрессивного состояния [17, 43]. Поэтому тест дает возможность оценить выраженность у животных поведенческой депрессии и антидепрессантные эффекты фармакологических веществ путем учета времени иммобильности (признака депрессивности) [17]. 2.3.3. Тест «Открытое поле» (ОП) [43] - классическая модель, основанная на конфликте двух мотиваций - инстинктивной тенденции к исследованию нового окружения и тенденцией минимизировать возможную опасность со стороны такового [202]. Как правило, данный тест используют для оценки анксиолитической и антидепрессантной активности нейротропных средств. Тем не менее некоторые показатели могут быть использованы при оценке ноотропного эффекта исследуемых веществ. Установка представляла собой площадку 60 60 см с 16 отверстиями диаметром и глубиной 3 см., ограниченную по периферии бортами высотой 40 см. Площадка разделена разметкой на 100 равных черных и белых квадратов. Тестируемое животное помещалось в центр площадки хвостом к экспериментатору. В течение 5 минут регистрировалось количество пересеченных крысой квадратов (квадрат считался пересеченным, если крыса пересекла его границу правой передней лапой), количество заглядываний в «норки» (опускание мордочки в отверстие в полу установки), вставаний на задние лапы и на бортик, количество актов груминга и количество болюсов дефекаций. Освещенность площадки - 90 Лк. Побочные обонятельные сигналы, влияющие на характер поведения животного, устраняются путем удаления фекальных болюсов и тщательного протирания пола установки после каждого тестирования [35]. Количество пересеченных квадратов трактуется как спонтанная двигательная активность, сумма стоек и заглядываний в отверстия — как суммарная ориентировочно-исследовательская активность [72]. Принято считать, что пристеночные стойки характеризуют тревожный компонент поведения, тогда как свободные в большей степени характеризуют
Методы изучения антидепрессантной активности электроактивированных водных растворов
Тест «Подвешивание мышей за хвост» является блиц-тестом, применение которого возможно для выяснения анксиопрофиля препаратов [71]. Тест основан на наблюдении, что грызуны, при их подвешивании за хвост, будут демонстрировать определенный период иммобильности, по латентности которого можно судить об уровне их тревожности и отчаяния. Различные проанксиолитические препараты приводят к изменению длительности иммобильности животных, причем данный тест не только прост и удобен технически, но и более чувствителен к ряду психотропных препаратов, чем близкий ему по смыслу и степени жесткости тест Порсолта. Наблюдение за поведением животных осуществляется в камере (60x20x20), поделенной на два отсека. Мышь подвешивают за хвост на лейкопластыре, на расстоянии 1,5 см от кончика. Расстояние от пола до носа животного составляет 10 см. Суммарная длительность иммобилизации (неподвижное зависание) регистрируется в течение 6 мин одновременно у двух животных. Иммобильность трактуется как показатель поведенческого отчаяния — клинического признака депрессии.
Снижение длительности иммобилизации у животных опытных групп по сравнению с контролем расценивается как антидепрессивный эффект. Тест принудительного плавания [219] в модификации для мышей. Белых мышей на 15 минут помещают в стеклянный бассейн диаметром 10 см и высотой 25 см, заполненный водой (температурой 21-23 С) до уровня, при котором животное не может касаться дна задними лапами. Затем животных отсаживают в обогреваемую клетку на 30 минут и возвращают в виварий. Через 24 часа процедуру повторяют, регистрируя в течение 600 с. общее время нахождения мыши в состоянии иммобилизации (животное пассивно плавает в воде со слегка поднятой головой, все четыре конечности неподвижны) и количество прыжков из воды (животное совершает рывок всем телом, пытаясь выбраться из воды). Испытуемые вещества вводят до начала повторного тестирования. Активное плавание и попытки выбраться из воды являются проявлением поисковой, исследовательской активности, направленной на освобождение животного от аверсивной водной среды. Исследовательская активность в физиологии поведения и этологии являются основными прагматическими формами взаимодействия организма с внешней средой и обеспечивают его "быструю (поведенческую) адаптацию к динамично изменяющимся условиям существования. Отказ от поисковой активности, когда он необходим, капитуляция перед трудностями без их преодоления вызывает состояние «выученной беспомощности» (learned helplessness), или поведенческой депрессии [135]. Поэтому уменьшение общей продолжительности периода иммобилизации (поведенческого коррелята депрессивности) и увеличение количества прыжков (активных попыток избежать аверсивного воздействия) расценивается как проявление специфической антидепрессивной активности исследуемых веществ. 2.6.3. Методика моделирования клофелиновой депрессии с последующим введением электроактивированных водных растворов
В условиях эксперимента на разных видах животных (мыши, крысы, кошки, кролики) введение клофелина в малых дозах (0,1-0,5 мг/кг внутривенно или внутрибрюшинно), стимулирующего пресинаптические альфа-адренорецепторы, сопровождается депрессивными эффектами: общим угнетением, снижением двигательной и исследовательской активности, синхронизацией ЭЭГ и др. [10]. Антидепрессанты ослабляют указанные эффекты клофелина, особенно при их хроническом введении. Белым крысам вводился клофелин (ОАО «Органика») внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг, через сутки поведенческие реакции грызунов оценивались в тестах «открытое поле» и «приподнятый кресстобразный лабиринт» по методикам, описанным выше. Электроактивированные водные растворы вводились однократно во второй день эксперимента. Увеличение двигательной и исследовательской активности, а также увеличение времени пребывания животных в открытом рукаве приподнятого крестообразного лабиринта по сравнению с животными контрольной группы расценивалось как антидепрессантная активность. Тест «Экстраполяционное избавление» [32] проводится по методике, описанной выше. Для оценки антидепрессивного эффекта исследуемых веществ регистрируется латентный период двигательной активности (время иммобилизации животного до начала активного движения конечностями. 1) Нормобарическая гипоксия с гиперкапнией («баночная» гипоксия) [40] используется для оценки антигипоксического эффекта фармакологически активных веществ. Эксперимент выполняется на мышах. Методика заключается в помещении животных одинакового веса (разброс не более 2-х грамм на группу) по одному в герметически закрываемые контейнеры объемом 200 см . Регистрируется время до наступления апноэ (резервное время, время жизни в условиях гипоксии) у животного, которое фиксируется визуально. Увеличение продолжительности жизни животных в условиях гипоксии (по сравнению с контролем) под влиянием изучаемых соединений будет свидетельствовать о наличии у них противогипоксического эффекта. 2) Гемическая гипоксия, вызванная нитритной интоксикацией [40, 99] также используется для оценки противогипоксического действия соединений. Тест проводится на мышах. Эксперимент заключается в однократном подкожном введении животным в шейную область спины нитрита натрия в токсической дозе 300 мг/кг с последующей регистрацией времени выживания животных. Увеличение продолжительности жизни животных в условиях гипоксии на фоне метгемоглобинемии (по сравнению с
Оценка биологического действия католита и анолита методом функциональной нагрузки
В работе использовалась культура инфузорий из первого этапа, контактировавшая с католитом и анолитом в различных концентрациях в течение 24 часов. Из контрольной пробирки брали в три-четыре пробирки по 1 мл культуры инфузорий и добавляли туда 8% раствор натрия хлорида (от 0,1 до 0,5 мл) с тем расчетом, чтобы 100% клеток погибали в течение 5 минут. Контроль длительности жизни клеток вели в микроаквариумах под микроскопом с помощью секундомера. При этом было установлено, что 100% инфузорий-туфелек погибают в течение 5 минут при добавлении к 1 мл культуры 0,3 мл 8% раствора натрия хлорида. Далее брали по 1мл жидкости из опытных пробирок первого этапа, добавляли туда 0,3 мл 8% раствора натрия хлорида и измеряли продолжительность жизни клеток до 100% гибели. Опыт повторяли 10 раз и для дальнейшей работы использовали среднюю величину. Оценка результатов производилась по формуле: ИБА = ТО/ТК, где ИБА - индекс биологической активности исследуемого вещества ТО - продолжительность жизни (секунд) под действием разрешающего фактора клеток, проживших 24 часа в среде с испытуемым электроактивированным водным растворовм; ТК - продолжительность жизни (секунд) под действием разрешающего фактора клеток, проживших 24 часа в контрольной среде. ИБА = 1,00 ± 0,10 - объект не активен; ИБА 1,10 — объект повышает жизнеспособность клеток; ИБА 0,9 - объект снижает жизнеспособность клеток.
По данным литературы, при культивировании Paramecium caudatum в течение суток в среде с добавление глюкозы в разведении 1/1000, повышается жизнеспособность клеток при действии 8% раствора натрия хлорида, а при культивировании в среде с норфлоксацином в разведении 1/1000 - жизнеспособность снижается (Бузлама СВ. и др., 2006). Поэтому данные вещества выбраны нами в качестве препаратов позитивного контроля. На рис. 1. представлены данные изменения продолжительности жизни инфузорий-туфелек при добавлении 0,3 мл 8% NaCl к 1 мл культуры, которая в течение суток контактировала с испытуемыми растворами. При культивировании парамеций в среде с добавлением глюкозы 1/1000 продолжительность их жизни при действии неблагоприятного фактора (8% раствор натрия хлорида) увеличилась на 20% (р 0,05). По всей видимости, глюкоза обеспечивает дополнительное питание клеток и этим повышает жизнеспособность объекта. Индекс биологической активности (ИБА) для глюкозы 1/1000 равен 1,200. Норфлоксацин в аналогичном разведении уменьшает жизнеспособность инфузорий туфелек, ИБА равен 0,700. ИБА для католита в разведении 1/100 составил 1,142, для католита в разведении 1/1000 - 1,065. То есть католит в разведении 1/100 в большей мере увеличивает жизнеспособность парамеций, чем католит в разведении 1/1000. Несмотря на то, что анолит в разведении 1/100 вызвал гибель 50% клеток в культуре, у выживших клеток повысилась устойчивость к действию гипертонического раствора натрия хлорида, их продолжительность жизни увеличилась на 10% по сравнению с контролем. ИБА для анолита в разведении 1/1000 составил 1,179 (р 0,05). Таким образом, католит в разведении 1/100 и анолит в разведении 1/1000 повышают устойчивость парамеций к действию гипертонического раствора натрия хлорида. 3.3.
Изучение скорости роста инфузорий-туфелек при культивировании в среде с добавлением католита и анолита Изменения размеров Paramecium caudatum при культивировании в среде с добавлением католита 1/100 и анолита 1/1000 представлены на рис.2. При культивировании в стандартных условиях инфузория-туфелька достигает величины взрослой особи (около 250 мкм) за 6-8 дней. При культивировании в среде с добавлением католита в разведении 1/100 парамеции достигали размеров 250 мкм за 28 дней; в среде с добавлением анолита 1/1000-за 12-13 дней. Скорость роста инфузорий-туфелек в контрольной пробирке составляла 35 мкм/сут. При культивировании Paramecium caudatum в среде с добавление католита в разведении 1/100 скорость роста клеток снизилась до 9,3 мкм/сут. При культивировании парамеций в среде с анолитом в разведении 1/1000 скорость роста первые 5 суток составляла 35 мкм/сут, затем снижалась до 11,4 мкм/сут. Таким образом, при культивировании Paramecium caudatum в среде с добавлением католита в разведении 1/100 скорость роста инфузорий существенно снижается. Выводы III главы: 1. В экспериментах на Paramecium caudatum католит и анолит в разведениях 1/10 оказывают ярко выраженное биоцидное действие. Анолит в разведении 1/100 вызывает гибель 50% инфузорий. Католит 1/100 и анолит 1/1000 при экспозиции 1 час вызывают изменения характера движений инфузорий-туфелек. 2. При культивировании инфузорий-туфелек в течение суток в среде с добавлением глюкозы в разведении 1/1000 увеличивается продолжительность жизни клеток при действии 8% раствора натрия хлорида. Норфлоксацин в разведении 1/1000 уменьшает жизнеспособность инфузорий-туфелек при добавлении к культуре 8% раствора натрия хлорида. 3. После культивирования парамеций в течение суток в среде с добавлением католита и анолита увеличивается продолжительность жизни клеток при действии гипертонического раствора натрия хлорида. 4. При культивировании инфузорий-туфелек в среде с добавлением анолита и особенно католита существенно снижается скорость их роста.
Ноотропная активность электроактивированных водных растворов
Для оценки влияния электроактивированных водных растворов на формирование и воспроизведение памятного следа использовалась методика «Условная реакция пассивного избегания». С помощью методики «Экстраполяционное избавление» нами было исследовано влияние католита и анолита на обучаемость и память. Для исследования влияния электроактивированных водных растворов на мышечную выносливость, которая является одним из компонентов ноотропного эффекта, нами была использована методика «тредмил». Методика «Открытое поле» использовалась для оценки возможного психостимулирующего эффекта католита и анолита. Эксперимент проводился на 57 белых крысах обоего пола массой 180-220 г., разделенных на 8 групп по 6-7 особей. Животным 4 опытных групп электроактивированные растворы вводились внутрибрюшинно однократно в объеме 1 мл/100 г массы тела или через желудочный зонд в том же объеме. Крысы 5-ой и 6-ой опытных групп употребляли католит или анолит в течение 3 суток вместо питьевой воды при свободном доступе к поилке. В качестве препарата позитивного контроля крысам внутрибрюшинно вводился пирацетам в дозе 400 мг/кг за 1 час до начала эксперимента. Крысам контрольной группы внутрибрюшинно вводилась вода, из которой приготовлялись ЭАВР, в объеме 1 мл/100 г массы тела. Установка для эксперимента УРПИ представляет собой два смежных отсека кубической формы, размерами 40x40x40 см. Один из отсеков затемнен со всех сторон и имеет электрифицированный пол, второй отсек открыт сверху и ярко освещен (90 Лк). Оба отсека сообщаются между собой через отверстие размерами 10x10 см. Тест выполнялся в два этапа: на первом этапе производилось обучение навыку пассивного избавления, на втором -воспроизведение его сохранности.
Тестируемое животное помещалось в центр освещенного отсека хвостом к отверстию в затемненный отсек. После того, как крыса заходила в темный отсек, ей наносилось электроболевое раздражение (40 В, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с). Визуальное наблюдение велось в течение 3 минут. При этом фиксировались следующие показатели: латентный период первого захода в темный отсек и количество заходов в него. На втором этапе эксперимента электроболевая стимуляция не проводилась. Результаты теста представлены на рис. 3 и 4. Латентный период захода и количество заходов в темный отсек установки УРПИ через 24 часа после обучения в опытных и контрольной группах достоверно не отличались. В контрольной группе латентный период захода в темный отсек через 7 суток после обучения составил 122,6±8,1 с. Данный показатель в группе «пирацетам» при воспроизведении рефлекса через 7 суток увеличился на 19% (р 0,05) по сравнению с контролем. После внутрибрюшинного введения католита латентный период захода в темный отсек был равен 165,7±9,6 с, что на 35% (р 0,01) больше, чем в контрольной группе и на 13% (р 0,01) больше, чем в группе животных, которым был введен пирацетам. При этом количество заходов в темный отсек при воспроизведении навыка через 7 суток в группе животных, получивших внутрибрюшинно католит было на 14% (р 0,05) меньше, чем в контрольной группе. После внутрибрюшинного введения анолита латентный период захода в темный отсек через 7 суток после обучения был на 26% (р 0,01) больше по сравнению с контрольной группой животных и составил 154,7±П,9 с. достоверность различий по сравнению с контрольной группой.
После однократного перорального введения крысам электроактивированных водных растворов достоверного изменения латентного периода захода в темный отсек и количества заходов при воспроизведении навыка через 1 неделю зарегистрировано не было. При употреблении животными католита внутрь вместо питьевой воды в течение 3 суток латентный период был равен 146,8±10,1 с, что на 20% (р 0,01) больше, чем в контрольной группе, количество заходов достоверно не отличалось от контрольной группы. При воспроизведении условного рефлекса через 30 суток достоверных отличий между опытными и контрольной группой выявлено не было. Уменьшение латентного периода захода в темный отсек установки УРПИ и уменьшение количества заходов после внутрибрюшинного введения электроактивированных водных растворов свидетельствует о положительном
![Экспериментальное исследование нефропротекторных свойств глицина [Электронный ресурс]](/i/i/4506/184806.png "Экспериментальное исследование нефропротекторных свойств глицина [Электронный ресурс] Селиванова Ольга Сергеевна")
