Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из основных проблем современной экспериментальной и клинической фармакологии является изучение процессов биотрансформации лекарственных веществ и ксенобиотиков (Шашков В. С. и соавт., 1998; Nakano S. et al., 1996; Navarro F. A et. al., 1993; Rarnage A. et. al., 2005; Sousa De. B. et. al., 1996). В последнее время вопросам метаболизма лекарств в живых организмах уделяется все большее внимание. Это обусловлено не только возрастающим количеством оригинальных лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке, но и бурным развитием современных технологий, позволяющих проводить биохимические и фармакокинетические исследования, фенотипирование и генотипирование пациентов, а также необходимостью разработки принципов рациональной фармакотерапии (Atkinson A. J. Jr. et. al., 1977; Bloom J. С. et. al., 2003; Brockmoller J. et. al., 1994; Cohen N. et. al., 2008; Watkins P. B. et. al., 1994).
Открытия фундаментальных наук последних десятилетий коренным образом изменили представления о патогенезе заболеваний и подходы к их лечению. Индивидуализация фармакотерапии является неотъемлемой частью и качественной основой современных высокоэффективных принципов экспериментальной и клинической фармакологии (Сергиенко В. И. и соавт., 2003; Cohen N. et. al, 2008). Рациональный выбор адекватной дозы лекарственного препарата, а также режима дозирования, па основе оценки индивидуальных фенотипиче-ских и генотипических особенностей биотрансформации, может значительно .снизить число нежелательных побочных эффектов и повысить эффективность лечения (Sousa De. В. et. al, 1996).
Одним из подходов к изучению процессов биотрансформации является использование «маркерных субстратов», которое позволяет проводить комплексное и направленное изучение особенностей биотрансформации ксенобиотиков, оценивать индивидуальные фенотипи-ческие особенности метаболизма у различных биологических видов (Bloom J. С. et. al., 2003; Cohen N.et. al, 2008).
Клинической основой применения «маркерных субстратов» является оценка активности определенных ферментативных систем у пациентов, а также выявление генетических вариантов процессов биотрансформации ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ (Bloom J. С. et. al., 2003; Mendelsohn M. L. et. al, 1998).
Методологической основой изучения «маркерных субстратов» является комплексная оценка процессов биотрансформации потенциального субстрата с учетом влияния ферментативных систем I и II фаз, а также биохимические и клинические исследования энзиматиче-ской активности исследуемого субстрата на основании результатов прямого и косвеїшого фепотипирования как в условиях in vitro, так и in vivo (Ernstgard L. et. al., 2007; Fuhr U. et. al., 1996; Streetman D. S. et. al, 2000; Vincent G. et. al., 2003; Zien A. et. al, 2007).
Объектом исследования в данной работе является препарат мексидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат). В ранних исследованиях биотрансформации и экскреции мекси-дола показано, что основной метаболизм данного лекарственного препарата у человека проходит с участием ферментативных систем II фазы (Сариев А.К. и соавт., 2001: Сариев АХ, 1999). Кроме того, были выявлены геногипические различия в скорости экскреции неизме-
ненного соединения и глюкуроноконъюгированного метаболита у представителей различных этнических групп (Кравцова О.Ю., 2005). На основании полученных результатов экспериментальных и клинических исследований было предложено проведение биохимических исследований с целью обоснования применения мсксидола в качестве типирующего агента реакции глюкуроноконъюгации у человека (Кравцова О.Ю., 2005).
Цель исследования
Изучение процессов глюкуроноконъюгации методами фармакокинетического и биохимического анализа в условиях in vitro и in vivo на примере препарата мексидол.
Задачи исследования
Разработать высокочувствительный, селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированпых продуктов биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в моче человека.
Изучить влияние янтарной кислоты на процессы глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у животных в условиях in vivo.
Провести in vitro фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации на примере 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и 2-этил-б-метил-З-оксипиридипа сукцината. Определить изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюку-роноконъюгировшшых продуктов биотрансформации II фазы метаболизма.
Исследовать процессы конъюгации мексидола у людей с использованием различных типов гидролиза (селективные ферменты р-глюкуронидазы, кислотный гидролиз).
Изучить влияние основных ферментативных систем I фазы биогрансформации человека на процессы метаболизма 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в условиях in vivo. На основе хромато-масс-спектрометрического анализа биологических образцов провести поиск возможных метаболитов I фазы биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека.
Научная новизна работы
Впервые установлено влияние янтарной кислоты на процессы глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у животных в условиях in vivo. Показано, что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) способствует увеличению количества экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного продукта биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в среднем в три и девять раз соответственно после перорального и внутри-брюшинного введения.
На основании разработанного хромато-масс-спектрометрического метода установлено, что процесс биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека происходит при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Показано, что процесс конъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина является комплексным, включающим в себя образование не только глюкуроноконъюгированных производных, но и сульфо-, фосфоконъюгиро-ванных метаболитов и иных видов продуктов конъюгации.
Показано, что фенотипирование процесса глюкуроноконъюгации с использованием 2-этил-6-метил-З-оксипиридина невозможно, поскольку в опытах in vitro не обнаружены ка-
кие-либо взаимодействия с микросомальным пулом человека, а также ни с одной из девяти изоформ УДФ-глюкуронозилтрансферазы (UGTs: 1А1; 1АЗ; 1А5; 1А7; 1А8; 1А10; 2В4; 2В7; SF9WT).
В ходе фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации впервые установлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGTs: 1А1; 1А10).
На основе неинвазивного метода количественного определения изменения уровня эндогенного бр-гидроксикортизола к свободному кортизолу выявлена тенденция к индукции системы CYP3A4 после пероралыюго приема препарата мексидол.'
Практическая значимость работы
Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в моче человека. Данный метод соответствует международным требованиям ГОРАС (ИЮПАК)', предъявляемым к инструментальным методам анализа биологических образцов, и может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях продуктов биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина.
Показана перспектива проведения дополнительных исследований с целью изучения субстратной специфичности дигидроквертицина и определения кинетических профилей субстрата по отношению к отдельным изоформам УДФ-глюкуронозилтрансферазы.
В ходе комплексного исследования биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина расширено представление о путях его биотрансформации у человека при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Показано активирующее влияние мекси-дола на CYP3A4.
Личное участие автора
Автором были самостоятельно выполнены все эксперименты и исследования по нижеизложенным методикам, а также обработаны результаты и сформулированы выводы.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на XTV Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007 г.); Российском национальном съезде фармакологов (Санкт-Петербург, 2007 г.); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва-Клязьма, 2008 г.); на VII Международном симпозиуме «7th Joint of the Association Francophone pour I'Enseignement et la Recherche en Pharmacognosie» (Греция, 2008 г.); научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и практической медицины» (Москва, 2008 г.); на XXV Международном симпозиуме «LC/MS» (Швейцария, 2008 г.); П Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009) и па Первом Съезде нейрохирургов Республики Казахстан с международным участием (Астана, 2009 г.).
1 Международный союз теоретической и прикладной химии.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 2 статьи и 8 тезисов.
Объем и структура диссертации
