Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1 Продукты пчеловодства - их состав, биологическая активность и лечебное применение 9
1.2 Применение пыльцы-обножки в медицине 17
1.3 Характеристика атеросклероза и его коррекция 27
Заключение 34
Глава 2 Материалы и методы исследований 36
2.1 Общая характеристика пыльцы-обножки 36
2.2 Лабораторные животные и постановка опытов 37
2.3 Биохимические и клинико-лабораторные методы исследования 41
2.4 Статистическая обработка результатов исследования 48
Глава 3 Изучение физико-химических показателей и некоторых биологически активных веществ пыльцы-обножки 49
3.1 Изучение физико-химических показателей пыльцы-обножки двух видов 49
3.1.1 Определение внешнего вида и органолептических показателей пыльцы-обножки 49
3.1.2 Определение влажности пыльцы-обножки 50
3.1.3 Определение значения рН среды 50
3.2 Качественный анализ пыльцы-обножки 50
3.2.1 Идентификация аминокислот 50
3.2.2 Идентификация липидов 50
3.2.3 Идентификация кислоты аскорбиновой 51
3.2.4 Идентификация фенольных соединений 51
3.3 Изучение минерального состава пыльцы-обножки 51
3.4 Количественное определение основных биологически активных веществ в пыльце-обножке 53
3.4.1 Определение массовой доли флавоноидных соединений 53
3.4.2 Определение массовой доли сырого протеина 53
3.4.3 Количественное определение суммы свободных аминокислот 54
3.4.4 Определение общей суммы каротиноидов 59
Заключение 61
Глава 4 Исследование фармакологичекой активности пыльцы-обножки 62
4.1 Фармакологическая активность пыльцы-обножки у интактных животных 62
4.1.1 Определение острой токсичности пыльцы-обножки 62
4.1.2 Влияние пыльцы-обножки на детоксицирующую функцию печени 63
4.1.3 Влияние пыльцы- обножки на показатели аллергизации организма животных 64
4.1.4 Влияние пыльцы-обножки на липидный обмен у интактных животных 65
Заключение 67
4.2 Сравнительное влияние двух видов пыльцы-обножки на показатели липидного обмена на модели «острой» гиперлипидемии 67
4.2.1 Изменение холестерина сыворотки крови и печени
4.2.2 Изменение триглицеридов сыворотки крови
4.2.3 Изменение Р- и пре-Р-липопротеидов сыворотки крови
4.2.4 Изменение холестерина а-липопротеидов сыворотки крови
Заключение 70
4.3 Влияние пыльцы-обножки на липидный обмен на модели «хронической» гиперлипидемии 71
4.3.1 Изменение холестерина крови и печени
4.3.2 Изменение триглицеридов сыворотки крови
4.3.3 Изменение р- и пре-р-липопротеидов сыворотки крови
4.3.4 Изменение холестерина а-липопротеидов сыворотки крови
Заключение 81
Глава 5 Изучение механизма действия пыльцы-обножки 82
5.1 Влияние пыльцы-обножки на показатели перекисного окисления липидов 82
5.2 Мембраностабилизирующая активность пыльцы-обножки 88
5.3 Антистрессорная активность пыльцы-обножки 91
5.4 Влияние пыльцы-обножки на адаптивно-анаболические реакции в тканях 93
5.5 Влияние пыльцы-обножки на всасывание холестерина 96
5.6 Влияние пыльцы-обножки на метаболизм холестерина в желчные кислоты 99
Заключение 101
Общее заключение и выводы 102
Список литературы 113
- Применение пыльцы-обножки в медицине
- Биохимические и клинико-лабораторные методы исследования
- Влияние пыльцы-обножки на липидный обмен на модели «хронической» гиперлипидемии
- Влияние пыльцы-обножки на показатели перекисного окисления липидов
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в условиях возрастающих неблагоприятных внешних воздействий на организм, сочетающихся с нарушением принципов сбалансированного питания, отмечается рост числа заболеваний, сопровождающихся развитием гиперлипидемии [В.С. Шухов,2000]. В первую очередь это относится к заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Эти заболевания остаются наиболее распространенной причиной снижения трудоспособности, инвалидизации и смертности населения в экономически развитых странах. По данным ВОЗ [Н.Г. Киселева,1998] на долю этих заболеваний приходится 21% от общей смертности.
В последние годы много внимания уделяется исследованиям природных биомодуляторов, в том числе продуктам пчеловодства, которые характеризуются широким спектром биологической активности [Д.С. Стаситите-Бунявичене,2000]. В отличие от синтетических препаратов они лучше усваиваются и не вызывают прооксидативных реакций [Л.А. Александрова, 2000]. При этом они сочетают достаточную эффективность, широту терапевтического действия и относительную безвредность, а также часто оказывают положительное влияние на течение сопутствующей патологии. Особый интерес вызывает пыльца-обножка, состав и известная биологическая активность которой предполагает возможность создания на ее основе высокоэффективных профилактических гиполипидемических средств [А.К. Рачков, 1995].
Цель работы. Установить состав пыльцы-обножки, собранной на территории Ставропольского края и экспериментально обосновать ее гиполипидемическое действие.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительное изучение химического состава и физико-химических показателей пыльцы-обножки различного ботанического происхождения (белой акации и разнотравья), собранной на территории Ставропольского края.
-
Изучить токсичность и гиполипидемическую активность пыльцы-обножки у интактных животных.
-
Изучить степень аллергенности пыльцы-обножки при ее приеме путем определения гематологических показателей и уровня гистамина.
-
Изучить сравнительное влияние пыльцы-обножки различного ботанического происхождения (белой акации и разнотравья) на показатели липидного обмена в крови и печени белых крыс на модели "острой" гиперлипидемии.
-
Изучить влияние пыльцы-обножки на показатели липидного обмена в крови и печени белых крыс на модели "хронической" гиперлипидемии в сравнении с официнальным лекарственным препаратом Липанор.
-
Выяснить некоторые стороны механизма действия пыльцы-обножки на липидный обмен и адаптационные процессы.
Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное изучение химического состава и физико-химических показателей пыльцы-обножки белой акации и разнотравья, собранной на территории Ставропольского края и дополнительно к показателям ГОСТа 28887-90 определены сумма свободных аминокислот и каротиноидов.
В опытах на белых крысах впервые установлено гиполипидемическое действие пыльцы-обножки при «острой» и «хронической» гиперлипидемии, по эффективности приближающееся к действию официнального лекарственного препарата Липанор. Впервые установлено, что пыльца-обножка снижает интенсивность перекисного окисления липидов – уровень диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов и повышает активность антиоксидантного фермента каталазы при «острой» и «хронической» гиперлипидемии.
В механизме гиполипидемического действия пыльцы-обножки основную роль играет задержка всасывания холестерина и ускорение его метаболизации в желчные кислоты, сочетающееся со снижением пероксидации и с усилением адаптивно-анаболических и мембраностабилизирующих реакций.
Практическая значимость работы. Установлены дополнительные показатели для стандартизации пыльцы-обножки – сумма свободных аминокислот и каротиноидов. Выявлено наличие выраженной гиполипидемической активности пыльцы-обножки при «острой» и «хронической» гиперлипидемии, приближающейся по действию к лекарственному препарату Липанор, что служит экспериментальным обоснованием возможного использования пыльцы-обножки для создания средств лечебно-профилактического применения при различных заболеваниях, связанных с развитием гиперлипидемии.
Внедрение результатов исследования.
Разработано информационное письмо «Изучение гиполипидемического действия пыльцы-обножки», на основании которого получены акты внедрения материалов диссертации в план работы кафедры технологии лекарств ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (акт внедрения от 17 мая 2006г.) и в лечебно-профилактическую деятельность пятигорского санатория им. М.Ю. Лермонтова (акт внедрения от 20 мая 2006г.), а также зарегистрирована приоритетная справка за № 2006112936 от 19 апреля 2006г. на патент на изобретение «Композиция на основе перги и пыльцы-обножки, обладающая гипогликемической и гиполипидемической активностью».
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена согласно плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01200204765).
Положения, выдвигаемые на защиту.
-
Дополнительно для стандартизации пыльцы-обножки предлагаются – общая сумма аминокислот и каротиноидов.
-
Пыльца-обножка нетоксична и не вызывает аллергических реакций.
-
Пыльца-обножка обладает гиполипидемической активностью, связанной с задержкой всасывания холестерина, усилением метаболизации холестерина в желчные кислоты и по своей выраженности приближается к действию лекарственного препарата Липанор.
-
Пыльца-обножка снижает уровень перекисного окисления липидов и оказывает адаптивно-анаболическое, мембраностабилизирующее и антистрессорное действие.
Апробации и публикации. Основные положения диссертационной работы изложены на 59-й и 61-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2004, 2006 гг.). По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 в центральной печати, одна из которых в журнале, рекомендованном ВАК.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), материалов и методов исследования (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 157 источника, из которых 23 публикации иностранных авторов.
Применение пыльцы-обножки в медицине
Цветочная пыльца — это мужские половые клетки цветковых растений. Пыльца растений является незаменимым источником белков, жиров и витаминов в корме для пчёл. Посещая цветы, пчёлы собирают пыльцу и складывают её в виде обножек в специальное устройство из волосков на третьей паре ножек - корзиночки. Обножка формируется пчелой из множества пыльцевых зерен. В одной обножке содержится до 4 млн. зернышек цветочной пыльцы. Скрепляя собранную пыльцу выделениями глоточных желез и нектаром, пчелы формируют обножки в виде цветных комочков, фиксируемых в корзиночках из упругих волосков на внешней стороне голеней задних ножек [51].
Пыльца, собранная пчёлами в корзиночки, сразу же теряет способность к прорастанию. Это происходит под действием жирной кислоты (Ю-окси-2-деценовой), выделяемой челюстными железами медоносной пчелы.
Ульевые пчёлы утрамбовывают сложенные в ячейки обножки, заливают их мёдом и запечатывают сверху воском. Пыльца, сложенная в ячейки сотов и залитая сверху мёдом подвергается брожению и превращается в пергу («пчелиный хлеб»). Цветочную пыльцу и пергу пчелы используют для кормления расплода.
В пыльце содержится более 28 макро- и микроэлементов: калий, натрий, фосфор, кальций, никель, титан, ванадий, хром, церий, бериллий, цинк, свинец, железо, серебро, мышьяк, олово, галлий, стронций, барий, уран, кремний, алюминий, магний, марганец, молибден, медь, кобальт, бор. Пыльца особенно богата соединениями калия (400 мг/ЮОг), который способствует выведению из организма избытка воды и поваренной соли, улучшая, таким образом, состояние больных страдающих заболеваниями сердечно-сосудистой системы и почек. Довольно много пыльца содержит фосфора (190 - 580 мг/ЮОг), кальция (170 - 410мг/100г) и магния (90 - 270 мг/ЮОг).
Эти элементы играют важную роль в процессе кроветворения. Остальные же элементы находятся в микро- или ультрамикроколичествах [48].
Уникальность пыльцы заключается в наличии в ней одновременно практически всех аминокислот, участвующих в регуляции биохимических процессов. Помимо вхождения в состав белка отдельные аминокислоты самостоятельно влияют на процессы, протекающие в организме [3,4]. Например, метионин незаменим для нормальной работы печени желчного пузыря, глутаминовая кислота регулирует работу центральной нервной системы, гистидин нормализует работу желудка при язвенной болезни. По аминокислотному составу белки пыльцы, как отмечает С.Шкендеров (1985), близки к белкам мяса, яйца и других легкоусвояемых продуктов [129].
Конечно, аминокислотный состав пыльцевых зерен различных растений неодинаков, как и количество белка в них. Например, в пыльце одуванчика белка — 14%, подсолнечника и фацелии — по 27%, дуба — до 35%.
Пыльца содержит около 30 ферментов (амилазу, липазу, инвертазу, протеазу и т.д.). Количество и активность ферментов могут существенно отличаться в зависимости от вида растений и региона сбора [21]. Так, пыльца одуванчика и осота богата каротиноидами (до 2,1 и 1 мг/г соответственно), которые в организме человека превращаются в витамин А (ретинол). Ежедневное употребление Юг пыльцы-обножки в течение трех недель создает необходимые запасы этого витамина в организме человека на период, когда поступление каротиноидов с другими источниками питания ограничено.
Количество в обножке витамина С зависит от ее ботанического происхождения. По данным Д.К.Шапиро (1979), этим витамином богата пыльца вербы (более 2 мг/г) [127].
Пыльца - богатый источник токоферолов. Она содержит также значительное количество витаминов группы В (мг/ЮОг сухого вещества), тиамина (0,55-1,50), рибофлавина (0,50-2,22), никотиновой кислоты (0,32-21,00), пантотеновой кислоты (0,32-5,00), пиридоксина (0,30-0,90), биотина (0,06-0,60), фолиевой кислоты (0,30-0,68) и др. [21].
По количеству витаминоподобного вещества — инозита (188-228 мг/ЮОг) пыльца не имеет себе равных (кроме апельсинов и зеленого горошка).
Содержание рутина в пыльце-обножке (гречишной) достигает 17мг%.
Углеводы пыльцы представлены моносахарами (глюкоза, фруктоза), дисахарами (мальтоза, сахароза) и полисахаридами (крахмал, клетчатка, пектиновые вещества). Общее количество углеводов может достигать 40%.
Липиды представлены целым комплексом соединений: незаменимые жирные кислоты (линолевая, линоленовая, арахидоновая), стерины, воскоподобные вещества, фосфолипиды, фитостерины [42,111]. Обнаружены в пыльце и непредельные углеводороды: трикозан, пентакозан, высшие спирты [100].
Фенольные соединения пыльцы представлены флавоноидами (флавонолы, лейкоантоцианы, катехины) и фенолокислотами (производные оксикоричной кислоты). Основные из них — хлорогеновые кислоты — обладают способностью регулировать функцию щитовидной железы [62]. Богата обножка и тритерпеновыми соединениями (чаще урсоловой кислотой), а также сапонинами. В пыльце-обножке обнаружены также вещества типа гетероауксина и гиббереллинов, обладающих свойствами гормонов растений [129,139]. В результате приема пыльцы органы и ткани получают необходимые питательные и биологически активные вещества, что обеспечивает их нормальное функционирование [124].
Причиной аллергии, как правило, является пыльца анемофильных (ветроопыляемых) растений, которую пчелы не собирают. Обножка и перга энтомофильных растений в большинстве своем аллергенными свойствами не обладают. В связи с этим для наших исследованиях представляют интерес результаты исследований испанских ученых О. Агуар Монтэрде и А. Гомес Пахуэло [127], изучавших иммунологические и серологические свойства водных и масляных экстрактов пыльцы-обножки. Безрезультатными оказались попытки авторов вызвать анафилактический шок у морских свинок, предварительно сенсибилизированных указанными экстрактами. Случаи аллергии, которые изредка наблюдались при приеме обножки перорально, могут быть вызваны загрязнением продукта остатками хитиновой оболочки клещей, которых не должно быть при организации правильного сбора и обработки пыльцы. Доказательства безвредности обножки, принимаемой с пищей, были получены также при токсикологических испытаниях. Животные получали дозы обножки, в десятки раз превышающие те количества, которые обычно принимаются с лечебной целью; при этом никаких биохимических и гистологических изменений у них не было обнаружено [125].
Исследователь продуктов пчеловодства А.Кайяс (1985) также установил, что аллергические заболевания вызываются пыльцой, разносимой ветром. Он отмечал, что причиной аллергии никогда не бывает пыльца, собранная пчелами, так как пчелы-сборщицы добавляют к ней немного нектара и выделений своих желез, которые разрушают или нейтрализуют аллергены, содержащиеся в пыльце. Аллергические свойства пыльцы-обножки выявлены в 1-5% случаев при ее использовании в лечебных и диетических целях [21].
Экспериментально установлено, что число эозинофилов в крови подопытных животных, получавших пыльцу, не отличалось от количества таковых в крови контрольной группы, что указывает на отсутствие аллергических реакций организма к пыльце-обножке [132].
Выявлено заметное стимулирующее влияние пыльцы-обножки на эритро- и лейкопоэз при различных моделях патологии крови. Пыльца-обножка способствует нормализации содержания лейкоцитов и лейкоцитарной формулы у животных с интоксикацией, вызванной ацетатом свинца или бензолом. По мнению В.Г.Макаровой с соавт. [25] пыльца обладает антианемическими свойствами благодаря сочетанию анаболического эффекта и влияния комплекса микроэлементов (железа, кобальта, меди), участвующих в процессах кроветворения. [132].
Достоверное уменьшение содержания глюкозы при приеме пыльцы наблюдалось также в крови животных при голодании. Эти данные позволяют предположить наличие у нее гипогликемического эффекта [50]. Применение пыльцы в течение 60 дней в сбалансированном корме оказывает на подопытных животных стимулирующее действие, вызывает достоверное увеличение их физической работоспособности (тест «плавание с грузом») [95].
Биохимические и клинико-лабораторные методы исследования
Для суждения об изменении липидного обмена определяли следующие показатели:
A) Холестерин сыворотки крови
Холестерин сыворотки крови определяли с помощью стандартного набора «ЭКОлаб».
Принцип метода заключается в том, что свободный холестерин и эфиры холестерина, после ферментативного гидролиза холестеролэстеразой окисляются при помощи холестеролоксидазы. Индикаторной является реакция окислительного азосочетания образовавшейся перекиси водорода, 4-аминоантипирина (4-ААП) и фенола в присутствии пероксидазы. Интенсивность окраски, измеряемая на КФК-2 при длине волны 500 нм, пропорциональна концентрации общего холестерина. Расчет проводили по стандарту, единицы измерения выражали в ммоль/л. Б) Триглицериды сыворотки крови
Триглицериды определяли с помощью стандартного набора "Лахема". Принцип метода заключается в том, что триглицериды омыляются гидроксидом калия в глицерин, при окисления которого возникает формальдегид. Формальдегид определяют по реакции с метил ацетоном и аммониевыми ионами, дающей желтый 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин, интенсивность которого, измеряемая на СФ-46 при длине волны 405 - 420 нм, пропорциональна концентрации триглицеридов. Расчет проводили по стандарту, единицы измерения выражали в ммоль/л.
B) Р- и пре-р липопротеидов сыворотки крови
Определение Р- и пре-Р липопротеидов сыворотки крови проводили турбидиметрически по Бурштейну и Самай [114,140]. Метод основан на способности Р" и пре-Р липопротеидов образовывать с гепарином комплекс, который осаждается без денатурации в присутствии хлористого кальция. Степень мутности, измеряемая на КФК-2 при длине волны 720 нм, пропорциональна содержанию 0- и пре-Р липопротеидов. Единицы измерения выражали в г/л.
Г) Холестерин а-липопротеидов сыворотки крови
Принцип метода определения холестерина липопротеидов высокой плотности [121] заключается в том, что хил омикроны, липопротеины низкой и очень низкой плотности осаждаются гепарином в присутствии марганца хлорида. После центрифугирования в супернатанте остается фракция липопротеинов высокой плотности, которая количественно исследуется с использованием набора «ЭКОлаб» для определения холестерина. Результаты выражали в ммоль/л.
Д) Холестерин печени
Холестерин печени определяли в гомогенате. Из гомогената холестерин извлекали хлороформ-метанольной смесью 2:1 [138] с последующим колориметрическим определением по цветной реакции Либермана-Бурхарда на КФК-2 при длине волны 630-690 нм [63]. Расчет проводили по стандарту, результаты выражали в мг/г.
Для суждения о состоянии адаптогенных процессов при введении пыльцы-обножки определяли в печени общий белок и нуклеиновые кислоты, массу надпочечников и содержание в них адреналина. А) Общий белок печени
Определение белка проводили в гомогенате печени спектрофотометрически [83] в физиологическом растворе по разнице оптической плотности при 260 и 280 нм. Расчет белка проводили по формуле, эмпирически полученной Колькаром: Х=1,45 Е280-0,74 Е260 Результаты выражали в мг/г.
Б) Нуклеиновые кислоты печени
Определение нуклеиновых кислот проводили спектрофотометрически в гомогенате печени, полученном путем гомогенизации навески печени с 0,2 М хлорной кислотой, по разнице экстинкций при 270 и 290 нм [83] с использованием формулы расчета
Результаты выражали в мг/г. В) Адреналин в надпочечниках
Определение адреналина проводили по методу Фолина после механического разрушения надпочечников путем растирания со стеклянным песком в присутствии свежеприготовленного 10% раствора натрия карбоната. Метод основан на колориметрическом определении интенсивности синего окрашивания, которое образуется при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина [40,123]. Расчет проводили по стандарту адреналин (1:100), результаты выражали в мг на 1 г массы надпочечников.
Для суждения о мембранотропном действии и антиоксидантной активности пыльцы-обножки определяли нижеследующие показатели: А) Спонтанный гемолиз по Ягеру
Метод основан на определении при 540 нм экстинкций внеэритроцитарного гемоглобина, поступающего в среду вследствие спонтанного лизиса мембран эритроцитов, вызванного пероксидным окислением липидов кислородом воздуха [114]. Результаты выражали в %.
Б) ТБК-активные продукты сыворотки крови
Определение вторичных продуктов перекисного окисления липидов проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой с использованием диагностического набора "Биоконт, Агат". Принцип метода основан на том, что продукты перекисного окисления липидов образуют с тиобарбитуровой кислотой окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом, интенсивность которого, измеряемая на СФ-46 при длинах волн 535 и 575 нм, пропорциональна концентрации малонового диальдегида (МДА).
Для расчета использовали коэффициент молярной экстинкции МДА — l,56xl05M_1 см" . Результаты определения выражали в мкмоль/л. В) Диеновые конъюгаты сыворотки крови
Определялись по методу [112]. В ходе перекисного окисления на стадии образования свободных радикалов в молекулах полиненасыщенных высших жирных кислот возникает система сопряженных двойных связей, что сопровождается появлением нового максимума в спектре поглощения -Хмакс= 233нм. Количество диеновых конъюгатов рассчитывали по молярному коэффициенту экстинкции конъюгированных диенов при 233 нм - 2,2x105М"! см" и результаты выражали в нмоль/мл. Г) Активность каталазы сыворотки крови
Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Интенсивность окраски продукта реакции измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм. Активность каталазы рассчитывали по разности экстинкции опытной и холостой проб, используя коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода, равный 22,2 103мМ"1см"1. Результаты определения выражали в мкат/л [81]. Д) Оценка общей антиоксидантной активности плазмы крови
Общую АОА сыворотки крови определяли в модельной системе окисления суспензии желточных липопротеидов. Метод основан на способности антиокислителей, входящих в состав сыворотки крови, тормозить накопление продуктов ПОЛ, уровень которых определяется по их способности образовывать с тиобарбитуровой кислотой окрашенные продукты [93]. Суспензию желточных липопротеидов получали путем гомогенизирования желтка куриного яйца в равном объеме фосфатного буфера (40мМ КН2РО4, 105мМ КС1, рН 7,45). Перед использованием суспензию разводили в 25 раз тем же буфером. Пробы инкубировали в фосфатном буфере с добавлением 25мМ FeS04 7H20 и сыворотки крови. Контрольная проба не содержала сыворотки крови. В нулевую пробу добавляли только фосфатный буфер и раствор Fe . Скорость ПОЛ определяли по количеству накопленных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Оптическую плотность контрольной и опытной проб измеряли против нулевой пробы при 532 нм. Антиокислительную активность сыворотки крови выражали в % ингибирования ПОЛ по формуле: АОА = АДК - АД / АД/100%;
АД Дк -Дк0; АДоп Доп -Доп0 Дк и До,,0 - оптическая плотность до инкубации; Д/ и ДоП - оптическая плотность после 15 мин инкубации.
Е) Определение сорбционной способности ткани аорты
Сорбционная способность ткани аорты определялась по Е.М.Граменицкому [33]. Метод основан на способности тканей адсорбировать краситель и последующем колориметрическом определении экстрагируемого подкисленным 70% спиртом красителя. Расчет проводили по стандарту, результаты выражали в мг краски на 1 г веса ткани.
Для суждения о степени влияния исследуемых веществ на всасывание холестерина использовали метод В.Н. Колмаковой с соавт. [64]. Для этого у животных проводили забор крови из подъязычной вены через 1 и 2 часа после перорального введения холестерина в дозе 200 мг/кг в растительном масле и проводили определение холестерина в сыворотке крови при помощи набора «ЭКОлаб». О влиянии пыльцы-обножки на всасывание холестерина после холестериновой нагрузки судили по изменению уровня холестерина в крови у опытных животных после 7-дневного введения пыльцы-обножки, по сравнению с контрольными животными, получавшими физиологический раствор в объеме 2 мл.
Влияние пыльцы-обножки на липидный обмен на модели «хронической» гиперлипидемии
Полученные ранее результаты проведенных исследований побудили нас к дальнейшему изучению гиполипидемических свойств пыльцы-обножки (разнотравья) на модели "хронической" гиперлипидемии, которую вызывали у белых крыс сочетанным применением холестерина, метилтиоурацила и болевого стресса, как это описано в главе 2 "Материалы и методы...". Пыльцу-обножку вводили интрагастрально зондом в дозе 100 мг/кг на фоне развития гиперлипидемии в течение двух месяцев; в контрольных опытах вводился физиологический раствор в объеме 2 мл. Уровень липидных показателей определялся у интактных животных через 1 и 2 месяца опытов. Результаты опытов представлены в таблице 15,16 и на рис.5,6.
Как следует из приведенных данных, исходный уровень холестерина в сыворотке крови у интактных животных составил 1,17±0,05 ммоль/л. В контрольной группе животных, получавших физиологический раствор в совокупности с патогенными факторами, через 1 месяц наблюдалось значительное увеличение содержания холестерина до 2,43±0,13 ммоль/л, что на 107,7% (ри 0,05) превышало исходный.
Изменилось и содержание триглицеридов в сыворотке крови. В контрольной группе через 1 месяц наблюдалось увеличение этого показателя: 1,06±0,05ммоль/л - исходный уровень - против 2,41 ±0,16 ммоль/л в контрольных опытах, что составило увеличение на 127,3% (ри 0,05) по отношению к интактной группе. Одновременно увеличилось содержание Р и пре-Р липопротеидов (на 229,5% (ри 0,001) по сравнению с показателями интактных животных), составив 2,34±0,23 г/л против 0,71+0,05 г/л.
Уровень холестерина а-липопротеидов также повысился: в контрольной группе в конце первого месяца произошло его увеличение по сравнению с интактными животными на 5,3%, однако это увеличение было статистически недостоверным (ри 0,1).
Характер изменений показателей говорит о существенном нарушении липидного обмена у животных с хронической моделью патологии.
В отличие от контрольных опытов введение пыльцы-обножки привело к менее выраженному увеличению уровня исследуемых показателей, и их величина существенно отличалась от контрольных опытов.
К концу первого месяца уровень общего холестерина сыворотки крови в опытной группе составил 1,81±0,08 ммоль/л, что на 25,5% (рк 0,05) оказалось ниже значений первого месяца у контрольных животных. Содержание триглицеридов и (3- и пре-3 липопротеидов сыворотки крови в опытной группе в этот срок наблюдения составило 1,56+0,06ммоль/л и 1,92+0,06 г/л и оказалось ниже на 35,2% (рк 0,05) и 17,9% (рк 0,05) соответственно по сравнению с показателями первого месяца у контрольных животных.
Уровень же холестерина а-липопротеидов наоборот по сравнению с контрольными опытами повысился на 18,1% (рк 0,1) таблица 15, рис.5,6,7.
Еще более выраженные различия в характере изменения липидного обмена отмечались на втором месяце опытов. В контрольной группе животных уровень холестерина увеличился в 5,3 раза, по сравнению с показателями интактных животных, и в 2,5 раза по сравнению с величиной первого месяца, и составил 6,27+0,19 ммоль/л.
Уровень триглицеридов к концу второго месяца повысился до 3,9±0,13 ммоль/л, что оказалось на 61,8% (ри 0,05) выше показателя первого месяца и в 3,7 раза выше по сравнению с показателями интактных животных.
В контрольной группе животных к концу второго месяца также наблюдалось значительное увеличение содержания р- и пре-Р липопротеидов в 6,9 раз по сравнению с исходными показателями, составив 4,9±0,08 г/л. Это значение превысило величину первого месяца опыта на 109,4%(рк 0,05).
По сравнению с контрольными опытами введение пыльцы-обножки существенно задерживало развитие гиперлипидемии, однако не восстанавливало липидные показатели до исходного уровня. К концу второго месяца уровень общего холестерина в опытной группе в сыворотке крови составил 3,77±0,1 ммоль/л, что оказалось на 39,8%(рк 0,05) ниже значений второго месяца у контрольных животных. Содержание триглицеридов в сыворотке крови в этот срок наблюдения по сравнению с контрольными опытами понизилось на 28,2% (рк 0,05), составив 2,8+0,18 ммоль/л.
Величина Р- и пре-Р липопротеидов составила 2,7±0,29 г/л, но по сравнению с контролем их уровень оказался ниже (на 44,8%, рк 0,05).
Содержание холестерина а-липопротеидов в опытной группе наоборот повысилось по сравнению с показателями опытной группы первого месяца на 18,8% (рк 0,05), а по сравнению с контролем на 25,2% (рк 0,05).
Благоприятную динамику изменения липидных показателей при введении животным пыльцы-обножки подтвердили и изменения коэффициента атерогенности (рис.8).
Таким образом, проведенные исследования показали, что применение пыльцы-обножки в условиях хронической гиперлипидемии оказывает отчетливый гипохолестеринемический, гипотриглицеридемический, гипобета- и пре-бета-липопротеидемический эффект, сохраняющийся в равной мере на протяжении первого и второго месяца опытов, о чем свидетельствует величина коэффициента атерогенности.
После двух месяцев опыта животные были декапитированы под легким эфирным наркозом, и в печени было определено содержание холестерина.
Влияние пыльцы-обножки на показатели перекисного окисления липидов
Для суждения об уровне пероксидации в опытах на интактных животных, при острой и хронической гиперлипидемии определяли общую антиокислительную активность (АОА) и активность каталазы, содержание диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов.
Уже в опытах на интактных животных (таблица 18 и рис.10) удалось установить, что уровень общей антиокислительной активности крови (АОА) при введении пыльцы-обножки оказался выше контрольных значений на 31,2%(ри 0,05).
Способность пыльцы-обножки повышать общую антиокислительную активность крови получило подтверждение в опытах на животных с хронической гиперлипидемией. Причем примерно в той же степени (на 28,6%, рк 0,05) (таблица 19, рис.10).
У животных с острой гиперлипидемией активность каталазы в контрольной группе увеличилась на 61,4% (ри 0,05). Уровень диеновых конъюгатов также увеличился на 65,5% (ри 0,001), тогда как рост ТБК-активных продуктов оказался статистически недостоверным - 15,3% (ри 0,05) (табл. 20 и рис.11 и 12).
Опыты показали, что оба вида пыльцы-обножки в условиях «острой» гиперлипидемии обладали по существу равным действием на уровень показателей перекисного окисления липидов (р 0,1). Так, если пыльца №1 снижала уровень диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов в сыворотке крови на 70,8%(рк 0,05) и 18,2%(рк 0,05), то пыльца №2 - на 68,2%(рк 0,05) и 16,7%(рк 0,05) соответственно. Активность антиоксидантного фермента каталазы, наоборот, увеличилась. Так, пыльца №1 повышала уровень каталазы на 54,1%(р 0,05), а пыльца №2 на 53,8%(р 0,05).
Динамика изменений показателей перекисного окисления при «хронической» гиперлипидемии совпадала с таковой при «острой» гиперлипидемии.
Как следует из таблицы 21, у контрольных животных через 2 месяца развития гиперлипидемии наблюдалось значительное увеличение уровня диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов в сыворотке крови на 108,5% (ри 0,001) и 94,2%(ри 0,001) соответственно по сравнению с интактными животными.
Активность фермента каталазы также увеличилась в контрольных опытах по сравнению с интактными животными на 41,0% (ри 0,05).
В то же время у опытных животных, получавших пыльцу-обножку, имело место, по сравнению с контролем, снижение уровня диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов на 43,9% (рк 0,05) и 40,3% (рк 0,05) соответственно, а активность каталазы по сравнению с контролем увеличилась на 43,8% (рк 0,05).
Особый интерес для нас представляло сравнительное изучение влияния пыльцы и официнального препарата Липанор на перекисное окисление липидов при «острой» и «хронической» гиперлипидемии. Из приведенных в таблице 20 и 21 данных видно, что пыльца-обножка значительно превосходила действие Липанора по данному влиянию. Уровень каталазы, диеновых конъюгатов, ТБК-активных продуктов и у этих животных менялся в меньшей степени, чем при введении пыльцы-обножки при «острой» гиперлипидемии на - 33,0%(рк 0,05), 22,0%(рк 0,05), 1,8%(рк 0,1), и при «хронической» - на 11,5% (рк 0,1), 23,3% (рк 0,05) и на 14,5% (рк 0,05) соответственно.
Все вышеперечисленное свидетельствует о значительной способности пыльцы-обножки снижать уровень показателей перекисного окисления липидов, чем можно в значительной мере объяснить ее вышеописанное гиполипидемическое действие.
