Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 13
1.1 Общие принципы лечения ишемического инсульта 13
1.2 Основные нейропротекторные препараты, применяемые при ОНМК 15
1.2.1 Вазоактивные нейропротекторы 15
1.2.1.1 Блокаторы кальциевых каналов 15
1.2.1.2 Блокаторы а-адренорецепторов 17
1.2.1.3 Производные алкалоидов малого барвинка 19
1.2.2 Ноотропные препараты 21
1.2.3 Препараты экстракта гинкго билоба 26
1.3 Комбинирование ЛС как способ совершенствования нейропротек- 30
торной терапии ишемии головного мозга
2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Объекты исследования 40
2.2.Условия экспериментальных исследований 40
2.3. Методы определения противогипоксической активности 42
2.4. Регистрация мозгового кровотока 43
2.5. Определение ауторегуляторных реакций сосудов мозга 44
2.6. Моделирование ишемии головного мозга 45
2.7. Изучение углеводного обмена мозга 45
2.8. Определение продуктов ПОЛ и активности ферментов антиоксидантной защиты 46
2.9. Определение показателей, характеризующих проницаемость мембран клеток и эндогенной интоксикации 46
2.10. Методы статистического анализа результатов исследования 46
2.11. Методы оценки комбинированного действия лекарственных веществ 47
3. Изучение комбинированного применения нейропротекторов с экстрактом гинкго билоба при гипоксических состояних 48
3.1 Изучение церебропротекторной активности исследуемых нейропротекторов и их комбинаций с экстрактом гинкго билоба на модели циркуляторной гипоксии 48
3.2 Изучение противогипоксической активности экстракта листьев гинкго билоба 50
3.3 Изучение эффективности комбинированного применения циннаризина с экстрактом гинкго билоба при гипоксических состояниях 53
3.4 Изучение эффективности комбинированного применения нимодипина с экстрактом гинкго билоба при гипоксических состояниях 55
3.5 Изучение эффективности комбинированного применения пикамилона с экстрактом гинкго билоба при гипоксических состояниях 59
3.6 Изучение эффективности комбинированного применения винпоцетина с экстрактом гинкго билоба при гипоксических состояниях 62
3.7 Изучение эффективности комбинированного применения ницерголина с экстрактом гинкго билоба при гипоксических состояниях 64
4. Изучение влияния нейропротекторов, экстракта гинкго билоба, а также комбинаций «ней-ропротектор-гинкго» на параметры церебральной гемодинамики и ауторегуляцию мозгового кровотока 68
4.1. Оценка показателей церебральной гемодинамики и ауторегуляции в группе контрольных животных 68
4.2. Исследование влияния экстракта гинкго билоба на показатели церебральной гемодинамики и ауторегуляцию сосудов мозга 70
4.3. Исследование влияния циннаризина и его совместного применения с экстрактом гинкго билоба на показатели церебральной гемоди намики и ауторегуляцию сосудов мозга 73
4.4. Исследование влияния нимодипина и его совместного применения с экстрактом гинкго билоба на показатели церебральной гемоди намики и ауторегуляцию сосудов мозга 78
4.5. Исследование влияния пикамилона и его совместного применения с экстрактом гинкго билоба на показатели церебральной гемодинамики и ауторегуляцию сосудов мозга 84
4.6. Исследование влияния винпоцетина и его совместного применения с экстрактом гинкго билоба на показатели церебральной гемодинамики и ауторегуляцию сосудов мозга 90
4.7. Исследование влияния ницерголина и его совместного применения с экстрактом гинкго билоба на показатели церебральной гемодинамики и ауторегуляцию сосудов мозга 96
5. Изучение влияния нейропротектров, экстракта гинкго билоба, а также комбинаций «ней-ропротектор-гинкго» на показатели метаболизма мозга в условиях острьгх ишемических наруше-ниймозгового кровообращения 104
5.1. Изменение некоторых показателей метаболизма мозга контрольной группы животных при церебральной ишемии 104
5.2. Исследование влияния экстракта гинкго билоба на некоторые показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии 110
5.3. Исследование эффективности совместного применения экстракта гинкго билоба и циннаризина на показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии 113
5.4. Исследование эффективности совместного применения экстракта гинкго билоба и нимодипина на показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии 123
5.5. Исследование эффективности совместного применения экстракта гинкго билоба и пикамилона на показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии 128
5.6. Исследование эффективности совместного применения экстракта гинкго билоба и винпоцетина на показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии 136
5.7. Исследование эффективности совместного применения экстракта гинкго билоба и ницерголина на показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии 141
5.8. Исследование влияния объектов исследования и комбинаций "нейропротектор-гинкго" на формирование отека-набухания головного мозга при церебральной ишемии 147
Заключение 152
- Основные нейропротекторные препараты, применяемые при ОНМК
- Моделирование ишемии головного мозга
- Исследование влияния экстракта гинкго билоба на показатели церебральной гемодинамики и ауторегуляцию сосудов мозга
- Исследование влияния экстракта гинкго билоба на некоторые показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии
Введение к работе
Проблема цереброваскулярной патологии и наиболее тяжелого ее проявления - инсульта сохраняет чрезвычайную значимость как в России, так и во всем мире [18,91,93]. Ежегодно в мире переносят инсульт более 20 млн, а общее число проживающих в мире людей, перенесших острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК), в настоящее время составляет свыше 50 млн. человек. Наиболее высока заболеваемость инсультом в возрасте от 60 до 75 лет. Но данные последних лет показывают, что инсульт сильно помолодел: так на 100 000 жителей в возрасте 20-30 лет приходится 10,2 случаев, в возрасте 30-40 лет -39,0; 40-50 лет - 108,8 [49,87,154]. По материалам ВОЗ частота инсульта в течение года колеблется от 1,5 до 7,4 на 1000 населения [18,92,93].
В настоящее время в России инсульт - это национальная проблема не '-только медицинской, но и социальной значимости [91,169]. Во-первых, чрезвычайно велика распространенность инсульта, - более 450 тыс. новых случа- > ев в год. При этом количество инсультов во всех регионах России более чем в 2,5 раза превышает количество случаев инфаркта миокарда. Во-вторых, ин- f. сульт «молодеет». В-третьих, инсульт занимает, второе место в структуре общей смертности населения в России (21,4% всех смертей), уступая лишь заболеваниям сердца - 25,4%. В-четвертых, инсульт остается главенствующим фактором инвалидизации населения страны [91,93,141].
Раскрытие механизмов в формировании ишемического повреждения мозга расширило представления о стратегии патогенетического лечения ишемического инсульта [49,50,51,53]. По данным ряда авторов [18,52,160,163] наиболее часто при терапии ишемических инсультов применяют следующие группы лекарственных средств (ЛС): блокаторы кальциевых каналов, блока-торы а-адренорецепторов, производные алкалоидов малого барвинка, препараты на основе нейромедиаторов, препараты нейропептидов. В то же время, в связи с большим разнообразием причин (артериальная гипертензия, атеросклероз, сахарный диабет и др.), лежащих в основе инсульта, не менее важна и профилактика данной патологии. С этой целью наиболее часто
7 и профилактика данной патологии. С этой целью наиболее часто применяют ноотропные препараты — ЛС, которые не только оказывают специфическое позитивное влияние на высшие интегративные функции мозга за счет прямого воздействия на метаболизм нейронов, но и повышают устойчивость нервной системы к повреждающим воздействиям [15,22,23,42,114,116].
Известно, что терапия постинсультных состояний представляет комплексное воздействие лекарственных препаратов на основные патологические звенья [24,42,52,122]. Вместе с тем сочетанное применение препаратов может изменять основное терапевтическое действие, влияя на те или иные механизмы действия лекарств. Совместное применение нескольких лекарственных препаратов с учетом этиологии, патогенеза и симптоматики заболевания в ряде случаев позволяет уменьшить дозы каждого компонента, что снижает частоту их побочных явлений, а главное - приводит к усилению те- -' рапевтического эффекта. Однако, недостаточно обоснованное назначение и использование нескольких лекарственных средств одновременно без учета-возможного, прежде всего, их фармакодинамического взаимодействия, может нанести существенный ущерб фармакотерапии [21,60].
Среди лекарственных средств, зарекомендовавших себя в качестве эффективных нейропротекторов, особое место занимают препараты на основе экстракта гинкго билоба (танакан, мемоплант, билобил, гинкогинк). Благодаря наличию богатого комплекса биологически активных веществ (БАВ) экстракт гинкго билоба оказывает противоапоптозный, антиоксидантный, ноо-тропный, вазодилатирующий, антиагрегантный, противоишемический, про-тивогипоксический, адаптогенный, стресс-протективный эффекты [88,130,171,178], что обусловливает широкое применение экстракта гинкго билоба в т.ч. и при заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС) [174,177,183,190,191]. Но в то же время исследований, посвященных изменению фармакологической активности нейропротекторных лекарственных средств при совместном применении с препаратами экстракта гинкго билоба, не проводилось. Учитывая широкую распространенность ОНМК в РФ, а так-
8 же то, что в настоящий момент отсутствуют данные о целесообразности комбинированного применения экстракта гинкго билоба с нейропротекторами, были проведены экспериментальные исследования по изучению целесообразности совместного применения циннаризина, нимодипина, пикамилона, винпоцетина, ницерголина с экстрактом гинкго при гипоксических состояниях и ишемии мозга.
Цель исследования: экспериментальное изучение целесообразности совместного применения экстракта гинкго билоба с широко используемыми нейропротекторами (циннаризин, нимодипин, пикамилон, винпоцетин, ни-церголин) при гипоксических состояниях и ишемических повреждениях головного мозга.
Задачи исследования:
Выявить комбинации, содержащие экстракт гинкго билоба и нейропро-тектор, которые повышают устойчивость животных к дефициту кислорода на моделях: циркуляторной, гипобарической, гиперкапнической, гемической, гистотоксической гипоксии.
Определить комбинации, которые при введении в условиях экспериментальной нормы, а также с профилактической и терапевтической целью более эффективно в сравнении с моноприменением нейропротек-торов оказывают влияние на объемную скорость кровотока в мозге (МК), системное артериальное давление (САД), сопротивление сосудов мозга (ССМ) и на ауторегуляторные реакции сосудов мозга.
Выявить комбинации, которые в условиях ишемии мозга эффективнее чем нейропротекторы ограничивают процессы пероксидации в мозге и способствуют сохранению активности ферментов антиоксидантной защиты.
4. Установить комбинации, эффективность которых превосходит резуль
тат действия составляющего их нейропротектора при изучении влия-
9 ния на изменение концентрации общего белка, кальция и средних молекул в крови, формирование отека-набухания головного мозга при церебральной ишемии.
Определить комбинации, которые ограничивают нарушения углеводного обмена при ишемии мозга более эффективно, чем их составляющие.
На основании проведенных экспериментальных исследований выявить наиболее целесообразные комбинации, содержащие экстракт гинкго билоба и нейропротектор, которые способствуют повышению эффективности терапии ишемических нарушений мозгового кровообращения.
Научная новизна:
Выявлена высокая противогипоксическая активность экстракта гинкго билоба на моделях гипобарической, гиперкапнической, гемической и гистотоксической гипоксии. Комбинация «циннаризин-гинкго» повышает устойчивость животных к циркуляторной, гипобарической, гиперкапнической и гистотоксической гипоксии; «нимодипин-гинкго» и «винпоцетин-гинкго» - к циркуляторной, гипобарической, гемической и гистотоксической гипоксии; «пикамилон-гинкго» - к циркуляторной, гипобарической, гиперкапнической и гемической гипоксии; «ницерголин-гинкго» - к циркуляторной, гиперкапнической и гемической гипоксии.
Совместное применение экстракта гинкго билоба с циннаризином, ни-модипином, винпоцетином, ницерголином при терапевтическом введении и с пикамилоном и ницерголином при профилактическом более эффективно, чем их компоненты при моноприменении блокирует развитие реперфузионных феноменов - гиперемии и гипоперфузии и способствует поддержанию ауто-регуляторных реакций сосудов мозга в условиях экспериментальной нормы и в постишемическом периоде.
10 Выявлено, что использование комбинации «циннаризин-гинкго» более эффективно, чем монотерапия циннаризином, ограничивает процессы ПОЛ в мозге, гипопротеинемию, эндогенную интоксикацию; комбинация «нимоди-пин-гинкго» - препятствует развитию гипопротеинемии эффективнее, чем нимодипин; комбинация «пикамилон-гинкго» - более эффективно ограничивает развитие эндогенной интоксикации в сравнении с пикамилоном; комбинация «винпоцетин-гинкго» - увеличивает активность СОД, ограничивает гипопротеинемию, гипокальциемию и уровень эндогенной интоксикации существеннее чем винпоцетин при моноприменении; в сравнении с ницерго-лином комбинация «ницерголин-гинкго» ограничевает процессы пероксида-ции в мозге и снижает уровень эндогенной интоксикации более значительно.
Практическая значимость
Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармакологии Пятигорской государственной фармацевтической академии в рамках комплексно-целевой научной программы «Поиск и изучение новых корректоров нарушений мозгового кровообращения».
Полученные данные о повышении антигипоксической и церебропро-текторной активности изучаемых препаратов при совместном введении их с экстрактом гинкго билоба свидетельствуют об эффективности включения экстракта гинкго в нейропротекторную терапию.
Внедрение результатов исследования
По результатам исследований разработано информационное письмо, которое внедрено в план работы кафедры фармации Кубанского государственного медицинского университета и производственного объединения «Эвалар» г. Бийск.
Основные положения, выносимые на защиту
Показана целесообразность комбинированного применения экстракта гинкго билоба с циннаризином, нимодипином, пикамилоном, винпоцетином, ницерголином при циркуляторной, гипобарической, гиперкапнической, гемической, гистотоксической гипоксии, и снижение противогипоксической активности комбинации "нимодипин-гинкго" в условиях гиперкапнической гипоксии.
Комбинации "пикамилон-гинкго" и "ницерголин-гинкго" при профилактическом введении и комбинации "циннаризин-гинкго", "ни-модипин-гинкго" и "винпоцетин-гинкго" при терапевтическом применении наиболее эффективно, чем моноприменение нейропротек-торов, угнетают развитие постишемических феноменов и способствуют сохранению ауторегуляторным реакциям сосудов мозга. ":
Совместное применение экстракта гинкго билоба с изучаемыми нейропротекторами способствует сограничению метаболических ?. нарушений при ишемии мозга.
Экстракт гинкго способствует повышению эффективности нейро-? протекторной терапии пикамилоном, винпоцетином. При применении комбинаций «пикамилон-гинкго», «винпоцетин-гинкго» и «ницерголин-гинкго» наблюдается аддитивный эффект совместного применения нейропротекторов с гинкго билоба.
Апробация работы
Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на 59-61-й Региональных конференциях «Проблемы фармации, фармакологии и подготовки кадров» (Пятигорск 2003, 2004;2005); на научно - практической конференции «Химико-экологические проблемы Центрального региона России» (Орел, 2003); на медицинской ассамблее-2004 «Врач-Провизор-Пациент» (Санкт Петербург, 2004).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем диссертации: диссертация представлена на 190 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав, содержащих экспериментальные данные, заключения, выводов и списка использованной литературы - включает 186 отечественных и 24 иностранных источников. Работа содержит 37 таблиц и 43 рисунка.
Основные нейропротекторные препараты, применяемые при ОНМК
Кальций-индуцированная токсичность была открыта в конце 70-х годов. Концепция «кальциевой гибели клетки» при церебральной ишемии быстро получила широкое распространение [2,5,50,131] и в течение ряда лет (до 90-х годов) механизм внутриклеточного накопления кальция считался ключевым в патобиохимическом ишемическом каскаде. В основе патогенеза церебральных сосудистых расстройств лежит нарушение транспорта кальция [80,134]. При ишемическом инсульте наблюдается дефицит макроэргических связей, обесточивание K+-Na+ АТФ-азной ферментной системы, которая управляет энергозависимым ионным транспортом. Нарушение последнего приводит к деполяризации нейрональных мембран, что вызывает высвобождение нейротрансмиттеров, дает нейротоксический эффект и вызывает мощ- : ный приток ионов кальция в нейроны [7,157]. Установлено, что увеличение количества свободного кальция в цито- г плазме повышает активность ряда внутриклеточных ферментов, в том числе и АТФ-азную активность миозина [44]. Тем самым увеличивается интенсивность взаимодействия миозина с актином, что приводит к повышению тонуса гладкомышечных клеток с последующим спазмом сосудов. Сократительная способность сосудистой стенки и ее тонус в основном определяют периферическое сопротивление току крови. Спазм сосудистой стенки может стать причиной нарушения системной и региональной гемодинамики [5,98,131]. Кроме влияния кальция на тонус сосудистой стенки и регуляции ее сократительной способности он принимает непосредственное участие в энергоснабжении и реактивности клеток, функциональной активности форменных элементов крови, механизмах повреждения клеточных структур при ишемии [7]. Повышение реактивности тромбоцитов сопровождается увеличением содержания ионизированного кальция в их цитоплазме [8,131].У становлено также, что поступление кальция внутрь клетки приводит к повышению активности фосфолипаз, что влечет за собой гидролиз фосфолипидов клеточной мембраны и освобождение потенциально токсичных для клеток свободных жирных кислот. При накоплении кальция в митохондриях нарушается энергетический баланс клеток в связи с переходом к анаэробному метаболизму глюкозы, приводящему к метаболическому ацидозу, и усиливается хемотаксис. В присутствии ионов кальция усиливается активность протеолитических ферментов, что приводит к деградации структурных протеинов клетки [2,10,86]. В связи с этим первой обоснованной стратегией нейропротекции стала разработка антагонистов потенциал- зависимых кальциевых каналов.
Блокаторы кальциевых каналов (БКК) - большая группа современных лекарственных средств показания к применению которых связаны с их способностью к вазодилатации [2,5]. В настоящее время существу- ; ет анатомо-терапевтически-химическая система классификации БКК: I. Селективные блокаторы кальциевых каналов с преимущественным л влиянием на сосуды Дигидропиридиновые производные: амлодипин, фелодипин, исради- i пин, нифедипин, нимодипин, нитрендипин, лацидипин П. Селективные блокаторы кальциевых каналов с прямым влиянием на сердце 1) Фенилалкиламиновые производные: верапамил 2) Бензотиазепиновые производные: дилтиазем В последние годы в результате многочисленных клинических наблюдений и специальных научных исследований накоплены обширные данные о различных аспектах действия БКК на организм, в том числе не связанного с сосудорасширяющим эффектом [7,28,45,111,129,137]. Механизм действия БКК связан с блокадой медленных потенциалзависимых L-кальциевых каналов. Эти каналы состоят из 5 субъединиц. Непосредственно функцию кальциевых каналов осуществляет cti-субъединица, имеющая на своей поверхности рецепторы, обладающие сродством к ионам кальция. Структура щ- субъединицы в различных клетках различна, что и определяет селективность действия БКК [7,134]. Введение БКК сопровождается снижением систолического давления в левом желудочке, уменьшением среднего артериального давления, уменьшением общего периферического сосудистого сопротивления, увеличением коронарного и регионального кровотока [6,28,70]. Анализ механизмов, протекающих в мозге в условиях гипоксии и ишемии, подразумевает эффективное использование БКК для лечения острых нарушений мозгового кровообращения. Препараты, сочетающие свойства вазодилататора, нейропротектора и антигипоксанта необходимы при лечении сосудистых заболеваний, субарах-ноидального кровоизлияния, травмах мозга [99,157]. НИЦЕРГОЛИН (никотэрголин, сермион, дазоваз, дослан, эрготоп, фи- :; зилакс, нарголин, нимерголин, синсклерон, варсан, ницелин)- 5-бромо-никотинол-оксиматил. По химической структуре ницерголин является анало-., гом алкалоидов маточных рожек, которые содержат, кроме эрголинового ядра, бромзамещенный остаток никотиновой кислоты. Бицерголин проявляет спазмолитическую активность, особенно выраженную относительно сосудов мозга и периферических сосудов, что связано с наличием в его молекуле остатка никотиновой кислоты [50,153]. Препарат снижает сопротивление сосудов головного мозга, увеличивает кровообращение у больных с функциональной артериопатией; эффективен при нарушениях центрального и периферического кровообращения; вызывает позитивный эффект в восстановительный период после ишемии головного мозга [126,160]. Под влиянием ницерголина увеличивается линейная скорость кровотока в экстра- и интраце-ребральных артериях.
Влияние ницерголина на центральную гемодинамику сопряжено с отчетливым снижением САД, уменьшением минутного объема крови и возникновением брадикардии [23]. На этом основании назначение ницерголина наиболее оправдано при гиперкинетическом типе гемодинамики больным с высокими показателями АД. Установлено, что при острой церебральной ишемии применение ни-церголина способствует увеличению потребления глюкозы и кислорода в пораженных зонах, что способствует стабилизации энергетического метаболизма, а также приводит к усилению биосинтеза белков и нормализации баланса нейромедиаторов [23]. Имеются данные, что ницерголин снижает концентрацию продуктов обмена в скелетных мышцах при гипоксии [23,50]. Многочисленными клинико-электрофизиологическими исследованиями доказано, что данный препарат тормозит негативное влияние избыточной активности катехоламинов на адренергические рецепторы, а также ограничивает повреждение митохондрий [23,50,153]. Применение ницерголина у больных с нейрохирургической патологией вызывает позитивный эффект на функциональный тонус систем висцерально-вегетативной регуляции мозгового кровообращения и биоэлектрической активности мозга, влияя в основном на лимбические структуры мозга и гипоталамус [23,160]. Кроме того, препарат ингибирует активацию и агрега-, цию тромбоцитов адреналином и другими агентами [23,50]. Следует отметить, что ницерголин не изменяет коагуляционных свойств крови и, следовательно, при назначении его одновременно с антикоагулянтами не повышается риск геморрагических осложнений. Препарат при длительном применении может устранить головную боль, шум в ушах, головокружение, расстройство познавательных функций, снижение интеллекта, эмоциональную лабильность, бессонницу, нарушение памяти и трудоспособности, депрессию, тревогу [126]. Применяют ницерголин при острых и хронических мозговых сосудистых расстройствах, особенно при ранних нарушениях мозгового кровообращения, при церебральном атеросклерозе, последствиях тромбоза сосудов головного мозга, транзиторных нарушениях мозгового кровообращения по ишемическому типу, при мигрени, расстройствах периферического кровообращения (артериопатии конечностей, болезнь Рейно).
Моделирование ишемии головного мозга
Для создания ишемии головного мозга белых крыс использовали следующие модели: окклюзия обеих сонных артерий у животных на 10-15 мин. с последующей гипотензией до 40 мм рт. ст. [38,123]. перевязка левой сонной артерии в течение 3-х суток [121]; гравитационные перегрузки в кранио-каудальном положении [40] . 2.7. Изучение углеводного обмена мозга Содержание глюкозы и ее метаболитов (молочной (МоК) и пирови-ноградной (ПВК) кислот) определяли в артериальной и венозной крови. Забор артериальной крови осуществляли из сонной артерии, венозной - из стока венозных синусов. Содержание глюкозы в артериальной и венозной крови производили бензокаиновым методом [70]; молочной кислоты (МоК) -по методу Балоховского - Наточина [75]. Содержание ПВК в крови производили модифицированным методом Умбрайта [15,47]. Метаболизм глюкозы, ПВК и МоК в мозге оценивали также по показателю «потребление глюкозы, пировиноградной и молочной кислоты» мозгом. Об интенсивности процессов ПОЛ в мозге судили по содержанию промежуточных продуктов (диеновые конъюгаты) и конечных продуктов окисления липидов (ТБК-активные продукты). Диеновую конъюгацию ненасыщенных жирных кислот определяли спектрофотометрически по интенсивности поглощения в области 230 нм [77]. Концентрацию вторичных продуктов ПОЛ в мозге в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) проводили модифицированным методом по тесту с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [70]. Антиоксидантную защиту мозга определяли по активности ферментов каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) [127,139]. Активность каталазы определяли спектрофотометрически при длине волны 410 нм [92]. 2.9. Определение показателей, характеризующих проницаемость мембран клеток и эндогенной интоксикации Молекулы средней массы (500-5000 дальтон) определяли спектрофото-метрическим методом [150]. Общий белок определяли биуретовым методом с помощью набора фирмы «Агат». Концентрацию ионов кальция в сыворотке крови определяли колориметрически по цветной реакции с металлохромогенным «арсеназо III» с помощью набора фирмы «Диакон Диагностика». Статистическую обработку результатов проводили внутри серий по t-критерию Стьюдента (методом попарных сравнений), между сериями - по критерию инверсий Вилкоксона-Манна-Уитни [123], с применением стан- дартного пакета программ «Statistika» для Windows и «Mikrosoft Excel». В тексте диссертации и в таблицах представлены средние арифметические значения со средней квадратичной ошибкой средней арифметической и значение вероятности, полученные в результате статистической обработки каждой серии опытов.
Исходные данные приведены в соответствующих единицах измерения, а изменения, произошедшие после введения исследуемого объекта, приведены в процентном отношении к исходным показателям. 2.11. Методы оценки комбинированного действия лекарственных веществ Оценку комбинированного взаимодействия нейропротекторов и экстракта гинкго билоба проводили с помощью аналитических методов расчета, в соответствии с модификацией формулы Финни [72,156]: I - сила действия комбинации. Расчет I проводили следующим образом: 1= Р - 1, так как при лечебном (защитном) эффекте, равном 1, препарат не оказывает лечебного действия; Комбинированное взаимодействие нейропротекторов и экстракта гинкго билоба оценивали следующим образом: Е 1 - наблюдается потенцирование, Е=1 - аддитивное действие, Е 1 - антагонизм [125,167]. Известно, что ишемические повреждения головного мозга сопровождаются выраженными признаками кислородного голодания [76,87]. Поэтому одним из механизмов нейропротекторного действия лекарственных средств может служит повышение устойчивости к дефициту кислорода [116,144]. В связи с этим на первом этапе наших исследований была проведена оценка противогипоксической активности объектов исследования на различных моделях гипоксии: циркуляторной, гипобарической, гиперкапнической, гемиче-ской и гистотоксической. Для оценки церебропротекторной активности объектов исследования нами была взята модель тотальной ишемии мозга, моделируемой с помощью гравитационных перегрузок в кранио-каудальном положении. Дозы исследуемых нейропротекторов и экстракта гинкго билоба были выбраны с учетом ранее проведенных исследований и являются наиболее эффективными при ишемических нарушениях мозгового кровообращения в эксперименте (обоснование доз см. в главе "Материалы и методы исследования").
Исследуемые препараты вводили внутрибрюшинно за 40 мин, а экстракт гинкго билоба -перорально за 60 мин до начала эксперимента. Опыты проводились в нескольких сериях, в каждой из которых было по 6 животных. Критерием ней-ропротекторной активности явилось увеличение выживаемости животных (%) в сравнении с контрольной серией опытов. В контрольной группе животных, в условиях циркуляторной гипоксии отмечена смертность всех экспериментальных животных, в то время как при введении циннаризина и ницерголина выживаемость животных составляла 50%, а при введении пикамилона - 16,7% (рис.1). Применение нимодипина, винпоцетина, а также экстракта гинкго билоба не способствуют выживаемости животных (рис.1). Применение комбинаций «пикамилон - гинкго» и «ницерголин - гинкго» способствует повышению выживаемости экспериментальных животных до 16,7% и 50% соответственно, т.е. данные комбинации оказывают эффект, аналогичный эффекту монотерапии пикамилоном и ницерголином. Совместное применение циннаризина с экстрактом гинкго билоба увеличивает выживаемость животных до 33,3%). При исследовании эффективности влияния комбинированного применения нимодипина и винпоцетина с экстрактом гинкго билоба на выживаемость животных, перенесших перегрузки в кранио-каудальном положении, установлено, что выживаемость животных, в обоих случаях составляет 16,7% (рис.1). Таким образом, экспериментально показано, что совместное введение нимодипина и винпоцетина с экстрактом гинкго билоба способствует более выраженному увеличению выживаемости животных при тотальной ишемии мозга, чем монотерапия данными нейропротекторами. 3.2. Изучение противогипоксической активности экстракта листьев гинкго билоба При моделировании гипобарической гипоксии в контрольной группе животных время жизни мышей на высоте 11000м в среднем составило 18,2±0,88 с. Профилактическое введение экстракта гинкго билоба способствовало увеличению времени нахождения лабораторных животных на заданной высоте до 27,0±1,21с (табл.3), т.е на 48,4%о (рис.2) относительно контрольных животных.
Исследование влияния экстракта гинкго билоба на показатели церебральной гемодинамики и ауторегуляцию сосудов мозга
Введение экстракта гинкго билоба в условиях экспериментальной нормы в дозе 120 мг/кг в течение всего периода наблюдения способствует повышению тонуса церебральных сосудов, что приводит к снижению объемной скорости МК (табл.11). САД также снижалось в течение всего периода наблюдения. Наиболее выраженное снижение МК и САД (на 37,3% и 16,4% соответственно), а также повышение ССМ (на 45,2%) было зафиксировано на 60 мин опыта (табл.11). При изучении влияния экстракта гинкго билоба на реактивность мозговых сосудов при ступенчатом снижении САД выявлено, что в условиях экспериментальной нормы объект исследования значительным образом способствует поддержанию МК даже при САД 40 мм.рт.ст., Ка равен 1,09 (табл. 12). При терапевтическом применении экстракта гинкго билоба выявлено, что в отличие от контрольных опытов, наблюдается существенное снижение (на 43,2%) МК уже на 5 мин постишемического периода (табл.11). Но все же следует отметить, что несмотря на снижение объемной скорости кровотока в мозге в течение всего периода реперфузии, экстракт гинкго ограничивает выраженность постишемической гипоперфузии (табл.11). Анализируя изменение САД установлено, что терапевтическое применение экстракта приводит к менее выраженной постишемической гипотензии, чем в контрольных опытах на 45-60 мин эксперимента. Важно отметить, что ССМ в течение 60 мин реперфузии было существенно выше, чем у животных без лечения (табл.11). Терапевтическое введение экстракта гинкго билоба способствует сохранению (Ка- 0,81) ауторегуляторных реакций сосудов мозга (табл.12), но все же следует отметить, что его лечебное применение менее эффективно, чем профилактическое способствует сохранению стабильного мозгового кровотока при дозированной гипотензии. 4.3. Исследование влияния циннаризина и его совместного применения с экстрактом гинкго билоба на показатели церебральной гемодинамики и ауторегуляцию сосудов мозга Введение циннаризина в исследуемой дозе без экспериментальной патологии способствует выраженной вазоконстрикции и снижению МК на протяжении всего периода наблюдения. Максимальное повышение (на 51,6%) тонуса церебральных сосудов наблюдается на 45 мин, что и обусловливает снижение МК более чем на 45% относительно исходных величин. Введение циннаризина животным без патологии приводит к снижению САД на 20,4% (табл.13).
При оценке ауторегуляторных реакций отмечено, что введение циннари- зина животным в условиях экспериментальной нормы существенным образом способствует сохранению (Ка равен 1,17) реакций адаптации сосудов мозга к дозированной гипотензии даже при снижении САД до 40 мм. рт. ст. (табл.14). При профилактическом введении циннаризин не влияет на фазу пости-шемической гиперемии, однако блокирует развитие фазы гипоперфузии, т.е.1 препятствует отсроченному падению МК (табл.13). Данное воздействие на мозговой кровоток обусловлен способностью исследуемого ББК блокировать вазо-констрикцию церебральных сосудов и падение САД в постишемическом периоде (табл.13). Профилактическое введение препарата также активирует реакции ауторе-гуляции церебральных сосудов (Ка -1,10) при снижении САД до 40 мм.рт.ст. (табл.14). При использовании циннаризина в лечебных целях наблюдается более выраженное повышение ССМ, чем в контрольных опытах, что приводит к снижению объемной скорости МК (на 55,2%) уже на 5 мин реперфузии, которое сохраняется до конца эксперимента (табл.13). Терапевтическое введение данного БКК приводит к снижению САД (на 19,0%) на 5 мин реперфузии и ограни- чивает гипотензию на 45-60 мин опыта в сравнении с контрольными данными (табл.13). Установлено также, что при ступенчатом снижении САД терапевтическое введение циннаризина способствует выраженному понижению тонуса церебральных сосудов, сохраняя ауторегуляторные реакции сосудов мозга в пределах физиологической нормы (табл.14). При анализе влияния комбинации «циннаризин-гинкго» на параметры церебральной гемодинамики в условиях экспериментальной нормы отмечено, что исследуемая комбинация способствует более выраженному увеличению ССМ и снижению МК, чем циннаризин и гинкго билоба в отдельности (табл.15). Повышение ССМ при комбинированном применении циннаризина и экстракта гинкго билоба обуславливает снижение объемной скорости МК на 5- 60 минутах наблюдения более чем на 30% относительно исходного уровня, а выраженного влияния на САД данная комбинация в условиях экспериментальной нормы не оказывает (табл.15). Совместное применение циннаризина и экстракта гинкго билоба повышает функциональную устойчивость церебральной гемодинамики в условиях острой артериальной гипотензии (табл. 16). После ишемии мозга профилактическое применение комбинации "цинна-ризин-гинкго" в сравнении с контролем приводит к снижению выраженности гипоперфузии, а также препятствует постишемической вазоконстрикции (табл.15). Так, на 45 и 60 мин опыта наблюдается снижение объемной скорости МК лишь на 8,2% и 12,3% соответственно и тонуса церебральных сосудов на 19,0% и 20,5% соответственно. В сравнении с животными без лечения, на фоне профилактического введения комбинации "циннаризин-гинкго" изменений со стороны САД не отмечено (табл. 15). Таким, образом, совместное применение циннаризина с экстрактом гинкго билоба более эффективно, чем экстракт гинкго билоба и менее эффективно, чем циннаризин при моноприменении препятствует развитию характерных феноменов реперфузионного периода.
Кроме того, профилактическое совместное введение данных препаратов в постишемическом периоде способствует не только сохранению реакций ауторегуляции сосудов мозга в физиологических пределах, но и сдвигу нижней границы ауторегуляции МК в сторону более низких значений САД (до 40 мм.рт.ст.) (табл. 16). Способность данной комбинации к сохранению реакций ауторегуляции сопоставима с эффектом циннаризина (табл.16). Анализ влияния терапевтического применения комбинации «циннаризин-гинкго» на показатели церебральной гемодинамики в период реперфузии свидетельствует, что данная комбинация нивелирует фазу гиперемии, кроме того, исследуемая комбинация более эффективно, чем циннаризин при моноприменении ограничивает развитие фазы гипоперфузии. Данное влияние совместного" введения препаратов связано с препятствованием вазоконстрикторньгх реакций церебральных сосудов и ограничением снижения САД (табл.15). Так, к 60 мин; опыта введение комбинации "циннаризин-гинкго" не изменяет ССМ относительно исходных значений, применение циннаризина - способствует увеличе-? нию данного показателя на 134,5%, а экстракта гинкго - на 45,1% (табл. 15). Совместное применение экстракта гинкго билоба и циннаризина с терапевтической целью также как и с профилактической, сохраняет ауторегулятор-ные реакции мозговых сосудов в постишемическом периоде даже при снижении САД до 40 мм.рт.ст. (табл.16). Важно отметить, что исследуемая комбинация при терапевтическом применении более эффективно способствует сохранению реакций ауторегуляции церебральных сосудов при снижении САД до 40 мм.рт.ст. (Ка равен 1,06), увеличивая кровоток в мозге более чем на 14% относительно исхода (табл.16), в то время как при введении циннаризина кровоток снижался до 21,0% (табл.14), а при введении экстракта гинкго билоба - до 21,6% (табл.12). В условиях экспериментальной нормы при введении нимодипина отмечено повышение тонуса церебральных сосудов, а также снижение САД и МК. Максимальное увеличение ССМ (на 29,3%) наблюдали на 60 мин опыта (табл.17), а максимально низкое значение САД (на 27,6%) и МК (на 32,2%) констатировано на 15 мин эксперимента (табл. 17). В условиях экспериментальной нормы введение исследуемого препарата способствует поддержанию ауторегуляторных реакций церебральных сосудов в физиологических пределах, Ка равен 0,98 (табл. 18).
Исследование влияния экстракта гинкго билоба на некоторые показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии
Экспериментально установлено, что терапевтическое применение экстракта гинкго билоба препятствует накоплению концентрации ДК как в левом, так и в правом полушариях мозга, снижая данный показатель на 35,6% и 55,7% соответственно относительно контрольных опытов (рис.12). При анализе накопления вторичных продуктов ПОЛ в мозге и в эритроцитах выявлено, что экстракт гинкго билоба не влияет на образование ТБК-активных продуктов относительно контрольной группы животных (рис.12). Установлено также, что в опытах с экстрактом гинкго билоба увеличение активности фермента, обезвреживающего перекись водорода, была существенно ниже увеличения активности фермента, инактивирующего супероксидный анион (рис.13). Так, терапевтическое введение животным экстракта гинкго билоба повышает активность каталазы на 42,6%, а супероксиддис-мутазы - на 320,5% относительно контрольной серии опытов (рис.13). Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о способности экстракта гинкго билоба мобилизировать защитные системы организма при ишеми-ческих повреждениях мозга. Следует отметить, что полученные нами результаты о влиянии экстракта гинкго билоба на процессы ПОЛ согласуются исследованиями других авторов [175,178,194]. Анализируя полученные данные о влиянии экстракта гинкго билоба на изменение концентрации общего белка в плазме крови установлено, что применение экстракта гинкго препятствует гипопротеинемии, угнетая выраженность данного процесса относительно контрольных опытов на 14,5 % в артериальной и 17,8% в венозной крови (рис.14). Экспериментально также показано, что в группе животных, которым вводили экстракт гинкго билоба, наблюдается ограничение «гипокальцие-мии» в артериальной пробе и отсутствие существенных отличий со стороны данного показателя в венозной пробе (рисЛ4). Но терапевтическое применение экстракта гинкго билоба в условиях ишемии мозга не оказывает значи- мого влияния на уровень средних молекул в плазме животных в сравнении с группой животных без лечения (рис.14). Установлено что введение экстракта гинкго билоба способствует ограничению гипергликемии в артериальной и венозной крови, снижая данный показатель относительно контрольных животных соответственно на 17,4% и 15,9% (рис.15). Экспериментально установлено отсутствие значимых изменений со стороны концентрации пирувата в артериальной и венозной крови (рис.15).
При анализе влияния экстракта гинкго билоба на содержание молочной кислоты в условиях ишемии мозга установлено, что экстракт гинкго способствует повышению концентрации лактата на 18,8% в артериальной крови, а в венозной крови изменений уровня данного метаболита глюкозы относительно контрольных животных не выявлено (рис.15). Экспериментально показано, что в условиях ишемического повреждения мозга применение экстракта гинкго билоба способствует повышению утилизации лактата мозгом на 11,6% относительно контроля (рис.16). Вместе с тем, статистически значимых изменений со стороны утилизации глюкозы и пирувата мозгом не выявлено (рис. 16). 5.3. Исследование эффективности совместного применения экстракта гинкго билоба и циннаризина на показатели метаболизма мозга при церебральной ишемии. Введение животным циннаризина в условиях ишемии мозга способствует снижению накопления первичных продуктов ПОЛ в правом полушарии мозга на 30,7%, и увеличению содержания данных продуктов пероксидации в левом на 33,3% (рис.17). Совместное применение циннаризина с экстрактом гинкго билоба способствует снижению накопления ДК в обоих полушариях мозга. Так содержание исследуемых продуктов ПОЛ в левом полушарии было на 28,1%, а в правом - на 41,3% ниже, чем в контрольных опытах (рис.17). Следует особо обратить внимание, что компоненты данной комбинации потенцируют действие друг друга, о чем свидетельствует показатель Е, рассчи- При анализе влияния циннаризина на концентрацию общего белка в сыворотке крови установлено, что у опытной группы содержание исследуемого показателя было выше на 35,6% в артериальной и ниже на 23,0% в венозной крови относительно контрольной группы животных (рис.19). Важно отметить, что совместное применение циннаризина с экстрактом гинкго билоба снижает концентрацию общего белка в артериальной крови и венозной крови на 22,7% и 24,1% соответственно (рис.19). Для данной комбинации характерен антагонизм действия ее компонентов (Е арт =0,38 и Е вен =0,97, табл. 35). При изучении концентрации ионов кальция в сыворотке крови установлено, что при терапевтическом применении циннаризина концентрация кальция была на 65,6% в артериальной и на 23,4% - в венозной пробах выше чем в контрольной серии опытов.(рис. 19). Сочетанное введение объектов исследования препятствует снижению уровня кальция при ишемии мозга, как в артериальной, так и в венозной крови на 70,0% и 46,8% соответственно (рис.19).Таким образом, совместное использование объектов исследования оказывает более выраженное угнетающее влияние на процесс, гипокальцие-мии в венозной крови, чем моноприменение данных нейропрртекторрв. Потенцированное влияние совместного применения циннаризина и экстракта гинкго билоба подтверждено и при анализе показателя «эффект комбинации», который в данном случае составляет 2,0 (табл. 35). Кроме того, терапевтическое введение циннаризина способствует снижению концентрации среднемолекулярных пептидов в сыворотке крови на 57% (рис. 19). Важно отметить, что совместное применение экстракта гинкго билоба и циннаризина приводит к повышению исследуемого показателя, на 85,7% по сравнению с контролем (рис.19), т.е. установлен антагонизм действия компонентов комбинации на исследуемый показатель (Е=0,45, табл.34).
При анализе углеводного обмена установлено что, применение циннаризина способствует снижению (на 35,3%) содержания глюкозы в артериальной крови, и повышению (на 19,0%) в венозной (рис.20). Но данный препарат не влияет на концентрацию ПВК в артериальной и венозной крови (рис20.). Важным аспектом действия циннаризина следует считать угнетение развития Комбинация «циннаризин-гинкго» не оказывает существенного влия ния на уровень глюкозы в артериальной крови относительно контрольных опытов и увеличивает (на 53,8%) содержание данного углевода в венозной (рис.20). Более того, исследуемая комбинация приводит к снижению потреб ления глюкозы мозгом на 43,0% (рис.21). Экспериментально показано, что данная комбинация способствует повышению ПВК в венозной крови на 10,0% (рис.20). Со стороны концентрации лактата и пирувата в артериальной крови, а также потребления лактата мозгом при совместном применении циннаризина и гинкго статистически значимых изменений относительно кон трольных опытов не выявлено (рис.20). Опытным путем установлено, что применение нимодипина приводит к повышению накопления ДК как в левом, так и в правом полушарии мозга на 128 % и 49,7% соответственно (рис.22) относительно контрольных животных. Совместное введение животным нимодипина и экстракта гинкго билоба приводит к снижению на 34,1% содержания первичных продуктов ПОЛ в левом полушарии (Е=0,13 табл.33) и увеличению (Е=0,87 табл.33) на 84,9% в правом (рис.22). Применение нимодипина не оказывает статистически значимого влияния на накопление ТБК активных продуктов в правом полуша- рий и препятствует на 14,3% росту данного показателя в левом полушарии мозга (рис.22), а совместное введение объектов исследования приводит к повышению содержания вторичных продуктов пероксидации как левом (Е=0,79 табл.33), так и в правом (Е=1,20 табл.33) полушариях мозга на 23,1% и 16,8% соответственно (рис.22). Изучение влияния нимодипина на накопление ТБК-активных продуктов в гемолизате эритроцитов показало, что при введении данного препарата статистически значимого отличия со стороны данного показателя от контрольной группы животных не отмечено (рис.22). Аналогичный результат (Е=1,10 табл.34) получен и при совместном применении нимодипина и экстракта гинкго билоба (рис.22).
