Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Роль гемопоэзинд уцирующего микроокружения в регуляции гемопоэза
1.2. Нарушения кроветворения в условиях цитостатических воздействий и механизмы их развития
1.3. Лекарственные препараты, применяемые для фармакологической коррекции нарушений в системе крови при анемиях, вызванных цитостатическими агентами
1.4. Заключение
Глава 2. Материал и методы исследования
Глава 3. Результаты собственных наблюдений
3.1. Реакции системы крови при введении цитостатических препаратов и механизмы их развития
3.1.1. Циклофосфан
3.1.2. 5-фторурацил
3.1.3. Адриамицин
3.1.4. Карбоплатин
3.2. Действие гемостимуляторов на гемопоэз при введении цитостатиков
3.2.1. Циклофосфан
3.2.1.1. Влияние рекормона на процессы восстановления кроветворения, подавленного циклофосфаном
3.2.1.2. Влияние таблетированной формы рекомбинантного чело-
3.2.1.4. Влияние экстракта шлемника байкальского на процессы восстановления кроветворения, подавленного циклофосфаном 148
3.2.1.5. Влияние байкалина на процессы восстановления кроветворения, подавленного циклофосфаном 157
3.2.1.6. Влияние N-ацетилнейраминовой кислоты на процессы восстановления кроветворения, подавленного циклофосфаном
3.2.2. 5-ФТОРУРАЦИЛ 171
3.2.2.1. Влияние рекормона на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом 171
3.2.2.2. Влияние таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом 181
3.2.2.3. Влияние поэтама на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом 190
3.2.2.4. Влияние экстракта щлемника байкальского на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом 200
3.2.2.5. Влияние байкалина на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом 210
3.2.2.6. Влияние N-ацетилнейраминовой кислоты на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом 214
3.2.3. Адриамицин 223
3.2.3.1. Влияние рекормона на процессы восстановления кроветворения, подавленного адриамицином 223
3.2.3.2. Влияние поэтама на процессы восстановления кроветворения, подавленного адриамицином 228
3.2.4. Карбоплатин 232
3.2.4.2. Влияние рекормона на процессы восстановления кроветворения, подавленного карбоплатином 232
3.2.4.2. Влияние поэтама на процессы восстановления кроветворения, подавленного карбоплатином 240
3.2.5. Влияние гемостимуляторов in vitro на эритроидное колониеобразование 246
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 250
Выводы 320
Список литературы 324
Приложение
- Нарушения кроветворения в условиях цитостатических воздействий и механизмы их развития
- Лекарственные препараты, применяемые для фармакологической коррекции нарушений в системе крови при анемиях, вызванных цитостатическими агентами
- Циклофосфан
- Влияние таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом
Введение к работе
Актуальность. Современные данные, касающиеся распространенности заболеваний, сопровождающихся угнетением кроветворения, в частности, эритропоэза, показывают, что анемии являются одним из основных проявлений различных патологических процессов [8, 42, 62, 96, 103, 149]. Наряду с часто возникающими и легко диагностируемыми формами анемии в клинической практике встречаются и более редкие анемические синдромы, требующие сложных методических приемов для диагностики и лечения. К этой группе можно отнести анемии с таким сложным механизмом формирования, как костномозговая недостаточность, анемии у больных с хронической почечной недостаточностью, некоторыми эндокринопатиями и др. [96, 103, 149, 158, 197]. В терапии анемического синдрома актуальным является как лечение ведущей нозологии, поскольку анемии, как правило, вторичны и обычно представляют собой проявление основного заболевания, так и своевременная коррекция нарушений, возникших в системе эритрона. Многочисленными исследованиями установлено, что изменения в системе крови, возникающие при действии различных болезнетворных факторов, во многом однотипны и заключаются в последовательной активации отдельных звеньев единого каскадного механизма регуляции кроветворения. Поэтому, несмотря на большое разнообразие причин, лежащих в основе развития анемий, адекватные патогенетически оправданные методы их фармакологической коррекции могут быть разработаны лишь на основе детального изучения общих механизмов управления гемопоэзом [36, 46, 55, 175].
Существующая теория регуляции кроветворения свидетельствует о наличии в организме единой, сложноорганизованной, взаимосвязанной системы управления гемопоэзом [50, 53, 59, 62]. Ее основными компонентами являются центральные нейроэндокринные механизмы, элементы гемопоэзин-дуцирующего микроокружения, осуществляющие локальный контроль за
9 процессами кроветворения, и цитокины - активные вещества, секретируемые клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток. Учитывая вышесказанное, фармакологическая коррекция нарушений, возникающих в системе крови, вероятно, может осуществляться путем модуляции центральных механизмов регуляции гемопоэза, функций элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения и применения заместительной терапии препаратами, аналогичными естественным регуляторам кроветворения.
Действительно, существует ряд биологически активных веществ, которые, модулируя функции центральной нервной системы, способны изменять и функционирование аппарата системы крови, приводя к развитию позитивной динамики со стороны показателей периферического звена эритрона [2, 47, 51, 52, 58, 87, 359]. Перспективным также является создание препаратов на основе гликозаминогликанов. Данные вещества, являясь составной частью экстрацеллюлярного матрикса, клеточной мембраны, влияют на процессы пролиферации кроветворных клеток, регулируют продукцию цитокинов, то есть могут опосредованно (путем активации гемопоэзиндуцирующего микроокружения) стимулировать процессы репарации подавленного гемопоэза. Создание гемостимуляторов на основе цитокинов продемонстрировано многочисленными работами иностранных и отечественных авторов [35, 141, 357, 494,495,616].
Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные, позволяющие дать патогенетическое обоснование применения различных препаратов в терапии нарушений эритрона, возникающих при отдельных нозологиях. Это обусловлено как отсутствием соответствующих данных, касающихся механизмов их действия, так и недостаточной изученностью патогенеза развивающихся анемических синдромов. С указанных позиций удобными моделями для вскрытия закономерностей и механизмов функционирования кроветворной ткани при анемическом синдроме и разработки патогенетически обоснован-
10 ных методов терапии являются цитостатические миелосупрессии, вызванные различными по механизмам действия антибластомными средствами, так как одним из наиболее тяжелых осложнений токсической миелодепрессии является развитие анемического синдрома различной степени выраженности.
Изучение механизмов действия стимуляторов эритропоэза на моделях миелосупрессии, вызванных повреждающими агентами (цитостатиками), влияющими на отдельные структуры гемопоэзиндуцирующего микроокружения, позволит дать патогенетическое обоснование подходов к дифференцированному применению гемостимуляторов в лечении анемического синдрома и разработать целенаправленные методы терапии отдельными препаратами в клинической практике.
Цель исследования. Вскрыть механизмы регуляции эритропоэза при миелоингибирующих воздействиях. Разработать патогенетически обоснованные методы коррекции гемостимуляторами анемического синдрома на моделях цитостатических миелосупрессии.
Задачи исследования
Изучить механизмы развития цитостатических миелосупрессии, вызванных введением циклофосфана, 5-фторурацила, адриамицина и карбопла-тина.
В сравнительном аспекте оценить эффективность действия гемостимуляторов (рекормон, таблетированный эритропоэтин, препарат сверхмалых доз антител к эритропоэтину - поэтам, экстракт шлемника байкальского, байкалин, N-ацетилнейраминовая кислота) на эритропоэз на моделях цитостатических гемодепрессий, вызванных введением циклофосфана и 5-фторурацила.
Вскрыть специфические для каждого из гемостимуляторов механизмы участия элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения в восстановлении эритрона при моделировании цитостатических миелосупрессии.
Разработать патогенетически обоснованные методы коррекций нарушений в системе эритрона в условиях повреждения кроветворной ткани противоопухолевыми препаратами.
Положения, выносимые на защиту
Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами эритроидного ростка кроветворения при введении рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, N-ацетилнейраминовой кислоты, экстракта шлемника байкальского и его биофлавоноида байкалина является избирательная чувствительность прекурсоров эритропоэза и клеточных элементов ГИМ к действию цитостатиков и гемостимуляторов.
В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений эритрона является рекормон и N-ацетилнейраминовая кислота, в случае назначения фторпиримидинового антиметаболита значительная стимуляция эритропоэза наблюдается под влиянием рекормона и препаратов экстракта шлемника байкальского. При моделировании миелосупрессии адриамицином и карбоплатином рекормон более эффективен в сроки развития депрессии эритроидного ростка, поэтам - в период его активной регенерации.
В основе регуляторного действия рекормона и таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина на костномозговой эри-тропэз в условиях цитостатических миелосупрессии лежит стимуляция про-лиферативной активности и интенсивности дифференцировки эритроидных клеток-предшественников, поэтама — увеличение уровня гуморальных регуляторов эритропоэза (в том числе, сывороточного эритропоэтина). Вместе с
12 тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани N-ацетилнейраминовой кислотой и препаратами шлемника байкальского при назначении циклофосфана вызвано формированием гемопоэтических островков эритроидного и смешанного типа, в случае применения 5-фторурацила - возрастанием концентрации гемопоэтических факторов роста в экстрацеллюлярном матриксе.
Стимуляция периферических альфа-адренергических структур стро-мальных элементов ГИМ восстанавливает подавленную циклофосфаном фидерную активность адгезирующих клеток в отношении эритроидных прекурсоров и значительно усиливает ее в присутствии эритропоэтина (рекормон).
Рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, N-ацетилнейраминовая кислота, экстракт шлемника байкальского и его биофлавоноид байкалин оказывают умеренное стимулирующее влияние на гранулоцитарный росток кроветворения в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила. В основе действия препаратов лежит увеличение функциональной активности клеточных элементов ГИМ.
Научная новизна. Впервые выявлена многофакторная природа, лежащая в основе развития длительной депрессии костномозгового кроветворения в условиях введения цитостатических препаратов с различными механизмами действия (алкилирующий агент, антиметаболит). Основной причиной падения содержания эритрокариоцитов в системе крови у мышей при введении циклофосфана выступает подавление функциональной активности пула ком-митированных предшественников кроветворения и, в меньшей степени, нарушение межклеточных взаимодействий и выработки гуморальных регуляторов клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения. При этом развитие анемии на фоне увеличения числа эритроидных гемопоэтических островков свидетельствует в пользу функциональной несостоятельности образованных de novo клеточных комплексов.
Развитие гемодепрессии при назначении 5-фторурацила в первую очередь связано с нарушением формирования клеточных ассоциаций и, в меньшей степени, с угнетением процессов деления и созревания прекурсоров и снижением продукции ростовых факторов адгезирующими клетками гемопо-эзиндуцирующего микроокружения.
В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из стимуляторов эритропоэза (рекормон, таблетированная форма рекомби-нантного человеческого эритропоэтина, поэтам, экстракт шлемника байкальского, флавоноид байкалин, N-ацетилнейраминовая кислота) механизмов участия клеток кроветворного микроокружения в регуляции эритрона при его восстановлении. При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции эритрона, в ответ на введение гемостимуляторов. Мишенью для рекормона и таблетированной формы эритропоэтина являются прекурсоры эритропоэза. N-ацетилнейраминовая кислота оказывает преимущественное влияние на формирование эритроид-ных клеточных комплексов. С модуляцией активности дистантных структур (эритропоэтическая активность сыворотки крови) связано стимулирующее действие на эритропоэз экстракта шлемника байкальского и поэтама...
Впервые показано, что в условиях моделирования гипопластических состояний циклофосфаном гемостимуляторы в большей степени активируют процессы регенерации эритропоэза, чем при назначении 5-фторурацила, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения и нарушениями функций системы дальноранговой регуляции эритропоэза, вызванными антиметаболитом.
Патогенетически обоснована эффективность применения N-ацетил-нераминовой кислоты и рекормона при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом, рекормона и препаратов шлемника байкальского - в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита, рекормо-
14 на и поэтама - при лечении анемий, вызванных введением карбоплатина и
адриамицина.
Практическое значение работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции анемий, вызванных противоопухолевыми агентами. Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию создания новых гемостимуляторов для лечения анемий различного генеза.
Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).
В настоящее время разрешен к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации препарат на основе сверхмалых доз антител к эритропоэтину - поэтам (выпускается НПФ «Материа Медика Холдинг», Москва), препарат шлемника байкальского в таблетках (НПЦ натуральных продуктов "Даника", Харьков, Украина; ООО "Амрита", Киев, Украина).
По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина и препарата N-ацетилнейраминовой кислоты для получения разрешения на клинические исследования в качестве гемостимуляторов. Получены патенты: (RU) №2001100123 от 03 января 2001 г., (RU) №2003116260 от 02 июня 2003 г.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2000, 2001, 2003), на Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на конфе-
15 ренциях молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2001, 2002), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002, 2005, 2007), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006, 2007), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (Томск, 2004), на III Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 15 - в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 412 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 119 таблицами (таблицы 96-119 размещены » приложении). Библиографический указатель включает 647 источников, из них 249 отечественных и 398 иностранных.
Нарушения кроветворения в условиях цитостатических воздействий и механизмы их развития
Одним из основных методов, применяемых в онкологической практике, является химиотерапия, что означает использование цитотоксических агентов, то есть лекарств, токсичных для клеток. К настоящему времени проде 28 монстрировано, что изменение свойств элементов кроветворного микроокружения под действием экстремальных факторов, и в том числе при цитоста-тическом воздействии, оказывает существенное влияние на характер течения процессов подавления и восстановления гемопоэза [4, 29, 50, 54, 75, 106, 120, 348, 354, 369, 375, 515, 619]. По механизмам действия выделяют несколько групп химиотерапевтических препаратов. Их классификация не имеет жесткой структуры и связана с особенностями воздействия препарата на клетку. Широкое распространение получила группа противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда, представители которой являются одними из самых активных цитостатических средств (адриамицин, фарморубицин, акла-рубицин, идарубицин, рубомицин, карминомицин) [43, 176, 187]. Обширный класс синтетических противоопухолевых препаратов, применяемых в клинике, составляют соединения алкилирующего типа действия [43, 176, 187]. К ним относятся хлорэтиламины (эмбихин, сарколизин, циклофосфан, ифосфа-мид и др.), азиридины (тиофосфамид, имифос, фотрин и др.), эфиры дисуль-фоновых кислот (миелосан), производные нитрозомочевины, метилирующие агенты (дакарбазин, натулан), производные платины (карбоплатин, циспла-тин) [176]. Весьма распространенными противоопухолевыми препаратами являются антиметаболиты. Представителями данной группы являются 5-фторурацил, фторафур, 6-меркаптопурин, метотрексат и др. [23, 43, 416]. В практику лечения онкологических больных уже прочно вошли цитостатики растительного происхождения: производное подофиллотоксина - этопозид, выделенный из корневищ подофилла щитовидного, такие алколоиды, как винбластин и винкристин, содержащиеся в растениях барвинок розовый и карантус розовый, а также винфлюнин и винореблин, синтезированные из вышеуказанных соединений [175, 427].
Механизм действия у различных химиотерапевтических веществ направлен на разные этапы (фазы) клеточного цикла и разные процессы в клетке. Практически все химиотерапевтические препараты действуют на «рабо 29 тающую» клетку и не действуют на неактивную фазу или фазу покоя, именуемую Go. Следовательно, чем интенсивнее клетки растут и делятся, тем чувствительнее они к химиотерапии. Кроме того, известно, что большинство противоопухолевых препаратов способны индуцировать биохимически специфический, генетически запрограммированный тип гибели клеток - апоптоз [308, 333, 339, 516, 539]. Данные литературы указывают на существенную разницу в глубине и продолжительности гемодепрессии после применения различных цитостатиков в эквивалентных по общебиологическому эффекту дозах [72]. Указанный факт объясняется как неодинаковой степенью повреждения кроветворных клеток, отличающимися по механизму действия препаратами, так и неоднозначным их влиянием на регуляторныи аппарат системы крови. Более детально указанные механизмы можно рассмотреть на примере наиболее ярких представителей вышеперечисленных групп цитостатиков.
Цитотоксичность алкилирующих агентов связана с их способностью ковалентно присоединять алкильные радикалы к активным группам нуклеоти-дов ДНК [22, 30, 194, 244, 256]. К числу активных групп пуриновых и пири-мидиновых оснований, способных к алкилированию, относятся азот в 1, 3, 7 положениях молекулы аденина; азот - в 3, 7 и кислород в 6 положении молекулы гуанина; азот - в 3 и кислород - во 2 — цитозина; азот — в 3 и кислород -2 и 4 - тимина [255]. Помимо азотистых оснований, алкилированию могут подвергаться фосфатные группы молекулы ДНК. В результате происходит нарушение процессов репликации и транскрипции ДНК, что, в конечном итоге, приводит к митотическим блокам, подавлению синтеза РНК и белка, несбалансированному росту и гибели клеток [256, 369, 403, 413, 457].
Высокой чувствительностью к алкилирующим агентам обладают ядра клеток гиперплазированных (опухолевых) тканей и лимфоидной ткани. В то же время они легко взаимодействует с нуклеопротеидами клеточных ядер кроветворной ткани [176]. Так, уже через 24 часа препараты из группы нит-розомочевины на 90 % ингибируют синтез ДНК в клетках костного мозга, поражая в основном активно пролиферирующие клетки, что приводит к истощению пула кроветворных клеток-предшественников [42, 369, 429, 455, 534, 548, 565], которое может наблюдаться с первых суток после введения алкилирующих препаратов [335, 351, 369]. В свою очередь, нарушение ими способности к дифференцировке костномозговых элементов приводит к подавлению процессов нормального кроветворения [8, 42, 369]. Наиболее часто при этом отмечается снижение показателей лейко- и тромбоцитопоэза и, в меньшей степени, эритропоэза [30, 74, 176, 254].
Большинство алкилирующих агентов проявляют иммунодепрессивныс свойства: снижение абсолютного числа Т- и В-лимфоцитов, подавление пролиферации лимфоцитов, ингибиция синтеза антител [118, 155, 168, 389, 406]. Имеются сведения о снижении активности свертывающей системы крови под действием указанных цитостатиков, что выражается в уменьшении количества тромбоцитов и содержания прокоагулянтных и антикоагулянтных факторов в крови [84, 187].
Необходимо отметить, что глубина и продолжительность вызываемой алкилирующими соединениями миелосупрессии находятся в прямой зависимости от дозы препарата [11, 48, 71, 83, 117, 128, 153, 187, 228, 328, 497]
Лечебная эффективность алкилирующих соединений зависит от их растворимости, абсорбции, распределения по органам и тканям, скорости и путей выведения из организма, метаболизма и взаимодействия активного вещества с рецепторами. Представители данного класса цитостатиков с успехом используются в онкологической практике для лечения новообразований кроветворных органов, рака молочной железы, яичников, саркомы Капоши, злокачественных опухолей яичка, мелкоклеточного рака легкого и др. [23, 44, 74, 142]. При этом, в системе крови больных, получавших алкилирующие агенты в комбинации с другими противоопухолевыми препаратами, либо при монохимиотерапии, наблюдались изменения, сходные с таковыми у экспериментальных животных: сокращение пула костномозговых и циркулирующих гемопоэтических прекурсоров, развитие гипоплазии кроветворной ткани костного мозга, преимущественно за счет депрессии содержания гранулоци-тарных и эритроидных элементов, сопровождающееся явлениями панцито-пении в периферической крови [170, 175, 219, 260, 270, 450, 465, 471, 530, 542, 574, 577].
Одним из наиболее распространенных в клинике среди алкилирующих препаратов является циклофосфан (N,N - бис (2-Хлорэтил)тетрагидро-2Р-1,3,2 - оксазафосфорин-2-амин-2-оксид).
Циклофосфан (ЦФ) подвергается биотрансформации в печени с образованием активных алкилирующих метаболитов. Препарат обладает широким спектром противоопухолевой активности. В дозах, близких к лечебным, циклофосфан может вызывать побочные явления, проявляющиеся в сильном угнетении костномозгового кроветворения, в частности, грануло-, лимфо-, эри-тропоэза и нарушениях функции желудочно-кишечного тракта [1,6, 24, 106, 70, 176, 187,202,254].
При однократном введении в максимально переносимой дозе (МПД) (250 мг/кг) мышам циклофосфана, уже с первого дня после введения цитостатика были заметны глубокие изменения процессов гемопоэза [1, 24, 106, 202, 254, 455, 512]. Наиболее глубокая депрессия была зарегистрирована со стороны эритроидного ростка кроветворения. По данным большинства авторов, изменениям гемопоэза в костном мозге после введения циклофосфана соответствует динамика абсолютного содержания лейкоцитов и их отдельных форм в периферической крови [24, 106, 202, 254].
Лекарственные препараты, применяемые для фармакологической коррекции нарушений в системе крови при анемиях, вызванных цитостатическими агентами
Гипопластические состояния кроветворения представляют собой нередкое явление в клинической практике. Наряду с апластическими анемиями и острыми лейкозами, недостаточность гемопоэза может быть вызвана дефицитом цианокобаламина и фолиевой кислоты, бактериальными и вирусными инфекциями (подострый инфекционный эндокардит, вирусный гепатит, корь, краснуха, грипп), либо явиться следствием дизрегуляции процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток (нарушения функционирования нервной и эндокринной систем) [8, 42, 54]. Наиболее частыми причинами угнетения кроветворения в современных условиях можно считать миелотоксические воздействия химических агентов: бензола, анилина, тяжелых металлов, действие ионизирующего излучения, и особенно - цитостати-ческих препаратов, применяемых для лечения опухолей и индукции терапевтической иммуносупрессии. Причем цитостатики поражают практически все ростки гемопоэза [43, 134, 187]. Поэтому борьба именно с гематологическими осложнениями противоопухолевой химиотерапии представляет собой важнейший вопрос современной онкологии и гематологии [46, 55, 175].
У большинства онкологических больных анемия обусловлена не только спецификой основного заболевания, но и проводимой терапией. По данным, полученным в результате полугодового наблюдения 15 000 больных с различными новообразованиями в Европе (ECAS), анемия осложняла течение опухоли у 39 % пациентов. При этом анемия возникала у 63 % пациентов, получавших химиотерапию (75 % — после режимов содержащих препараты платины, и 54 % - после прочих) [152].
Развитие анемии является неблагоприятным прогностическим фактором и сопровождается тягостными симптомами. В некоторых ситуациях недостаточный контроль анемии может вести к прерыванию курса противоопухолевой терапии, что отрицательно сказывается на общем результате лечения. Данные проспективных и ретроспективных клинических исследований свидетельствуют о том, что влияние анемии на течение опухолевого заболевания может быть более разрушительным, чем это представлялось ранее. Помимо таких хорошо известных симптомов, как слабость, одышка, снижение умственной активности, анемия способна влиять на продолжительность жизни больных с опухолевыми заболеваниями. Анализ данных онкологических регистров показывает, что анемия является независимым отрицательным фактором прогноза. Так, у больных раком простаты, раком ротоглотки и лимфо-мами риск смерти повышается на 50-75 % при наличии у них анемии [152].
Пациенты с самыми разными типами опухолевых заболеваний способны значительно лучше отвечать на проводимое лучевое лечение с или без сопутствующей химиотерапии в случае коррекции анемии. В одном из ретроспективных исследований была прослежена долговременная выживаемость 889 пациентов с чешуйчатоклеточным раком головы и шеи, получавших радиотерапию. 5-летняя выживаемость для мужчин, у которых концентрация гемоглобина превышала 130 г/л, и для женщин с концентрацией гемоглобина более 120 г/л достигала 58,20 %, в то время как у больных с содержанием гемоглобина ниже указанных параметров выживаемость составила 28,40 % (р 0,0001)[152].
Существуют лабораторные и клинические данные, свидетельствующие о возможности влияния анемизации на чувствительность опухолевых клеток не только к лучевой терапии, но и к химиопрепаратам. В качестве факторов, которые могут увеличить врожденную или приобретенную резистентность опухолевой клетки к цитостатикам, называют неадекватную васкуляризацию опухоли, ее гипоксию, наличие значительной доли клеток, находящихся вне цикла деления, а также генетические изменения опухолевой клетки, например, гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости или мутации гена р53, которые могут возникать при гипоксии [152].
Наиболее распространенным методом коррекции анемии, до последнего времени, являлись трансфузии донорской эритроцитной массы. Этот метод позволяет достаточно быстро восстановить нормальные показатели гемоглобина, и относительно недорог. К отрицательным сторонам метода относят риск трансфузиологических реакций (групповая несовместимость, анафилаксия, цитратные реакции), возможность передачи инфекции (вирусы гепатита, иммунодефицита человека и др.), а также гемосидероз внутренних органов. В некоторых исследованиях было показано, что переливание эритроцитов донора оказывает иммунодепрессивное действие. Риск инфекционных осложнений и рецидивов опухоли у больных, оперированных по поводу рака толстой кишки и получавших донорские трансфузии, был выше, чем у пациентов, не получавших таких трансфузий. Важным недостатком коррекции гемоглобина путем переливания донорских эритроцитов является краткий эффект. Без повторных, иногда множественных гемотрансфузий анемизация быстро прогрессирует [152].
Для того чтобы нивелировать миелоингибирующий эффект цитостати-ков, при проведении химиотерапии назначают препараты, обладающие гемостимулирующим действием. К ним относятся неспецифические протекторы гемопоэза - зимозан, спленин, витамины группы В, предшественники синтеза нуклеиновых кислот - нуклеиновокислый натрий, пентоксил, метацил. Свойством стимулировать гемопоэз обладают гормоны, соли лития [8, 111, 157, 364]. Однако применение вышеперечисленных препаратов в эксперименте и клинике показало, что при выраженных миелосупрессиях они либо малоэффективны, либо сами обладают целым рядом неблагоприятных побочных эффектов [8, 46, 111, 182, 360, 537].
Еще одним методом коррекции анемии является введение полипептидов, стимулирующих продукцию эритроцитов костным мозгом. Некоторые цитоки-ны побуждают стволовую клетку дифференцироваться в направлении эригро-идного звена гемопоэза, а другие, воздействуя на уже относительно дифференцированные эритроидные предшественники, побуждают их пролиферировать, увеличивая продукцию эритроцитов костным мозгом. Преимущества лекарственных средств на основе эндогенных регуляторов гемопоэза обусловлены их исключительно высокой активностью и возможностью целенаправленного воздействия на отдельные ростки кроветворения [35, 357, 494, 613, 616]. Одним из наиболее важных, с точки зрения регуляции эритропоэза, цитокинов является эритропоэтин.
Первое сообщение о существовании вещества, избирательно стимулирующего эритропоэз, появилось еще в 1906 г., когда Carnot и Deflandre показали, что сыворотка кроликов, анемизированных повторными кровопусканиями, при подкожном или внутривенном введении здоровым кроликам вызывает эритроцитоз и гиперплазию эритроидного ростка костного мозга [226, 267]. В чистом виде гормон был выделен лишь в 1977 году, а в 1985 году ген клонирован и экспрессирован на клетках яичника китайского хомячка [267, 44 521]. Эритропоэтин представляет группу цитокинов (гемопоэтических гормонов). В отличие от других цитокинов, он не обладает полифункциональностью, а регулирует только эритропоэз и обеспечивает поддержание необходимого объема эритроцитарной массы в соответствии с потребностями организма в кислороде [159, 172, 241]. ЭП был признан главным, так как только он является абсолютно необходимым для продолжения пролиферации и выживания эритроидных клеток-предшественников, или так называемых коло-ниеобразующих эритроидных единиц [102, 445]. Также центральная роль ЭП определяется теми обстоятельствами, что он продуцируется несколькими органами и всегда присутствует в плазме крови. От остальных гемопоэтических факторов эритропоэтин отличается тем, что он ведет себя как гормон и его концентрация в сыворотке не влияет на величину его продукции [445, 582].
Циклофосфан
Изучение картины костномозгового кроветворения у мышей после однократного введения им циклофосфана в МПД позволило выявить глубокое угнетение всех ростков гемопоэза. Так, общее количество миелокариоцитов на 3-й сут после инъекции цитостатика достигало минимальных значений и составляло 17,19 % от начального уровня. При этом максимально выраженную депрессию числа незрелых элементов (до 32,51 % от фоновых величин) регистрировали также на 3-й сут, а зрелых гранулоцитов (до 1,47 %) - на 4-е сут эксперимента. Однако, содержание незрелых форм нейтрофилов восстанавливалось уже к 4-м сут опыта, а с 5-х сут отмечалось развитие гиперплазии гранулоцитарного ростка кроветворения (табл. 2). Количество эритрокарио-цитов было сниженным весь период наблюдения и составляло от 5,70 % (на 3-й сут) до 32,78 % (на 12-е сут) от исходного (табл. 2). Следует отметить, что содержание лимфоидных клеток в костном мозге с первых суток и до конца эксперимента оставалось значительно сниженным, а число моноцитар-но-макрофагальных элементов колебалось в пределах от 1,45 до 81,15 % от контроля (табл. 2).
Депрессия кроветворения, вызванная введением циклофосфана, сопровождалась развитием лейкопении в периферической крови, которая оказалась наиболее выраженной на 3-й и 4-е сут, когда общее количество лейкоцитов уменьшилось на 84,07 % и 82,00 % соответственно, по сравнению с таковым у интактных животных. В этот период сегментоядерные лейкоциты полностью отсутствовали в гемограммах, а содержание моноцитов и лимфоцитов было минимальным и составляло (на 3-й сут) 20,31 % и 3,23 % от начальных показателей соответственно. На 6-е сут количество сегментоядерных ней-трофильных лейкоцитов статистически значимо не отличалось от исходного, а на 8-12-е сут наблюдения было выявлено увеличение числа полиморфноя-дерных гранулоцитов в среднем на 146 % по сравнению с фоном. Содержание моноцитов возросло до 342 % на 10-е сут. Число лимфоцитов оставалось сниженным до конца эксперимента.
Анализ динамики показателей периферической крови позволил также установить, что уровень эритроцитов в опытной и фоновой группах достоверно не различался на протяжении раннего периода постцитостатическои регенерации кроветворения (3-6-е сут), а на 10-12 сут отмечался подъем ука-занного показателя (до 12,74-11,89x10 /л при исходном значении 10,62x10 /л). В то же время содержание ретикулоцитов существенно изменялось. Так, на 3-й сут после введения циклофосфана их число резко снижалось до 4,71 % от исходного. Величина данного показателя постепенно восстанавливалась к 8-м сут. Последующее развитие процесса регенерации эри-трона приводило к дальнейшему возрастанию уровня ретикулоцитов (в 2,12-2,67 раз относительно фона на 10-12-е сут соответственно) (табл. 3).
Развитие гипоплазии костного мозга у мышей, после инъекции алкили-рующего агента, сопровождалось выраженными изменениями колониеобра-зующей способности костного мозга. Так, содержание эритроидных коло-ниеобразующих единиц оказалось сниженным на протяжении всего периода наблюдения (табл. 4). При исследовании пролиферативной активности коммутированных предшественников эритропоэза в кроветворной ткани экспериментальных мышей было выявлено достоверное снижение доли КОЕ-Э в S-фазе митотического цикла на 3-10-е сут после введения препарата (табл. 4). Статистически значимое уменьшение индекса созревания эритроидных прекурсоров было также зарегистрировано на 3-12-е сут опыта (минимально на 71,43 % от начального уровня) (табл. 4).
Введение циклофосфана оказывало влияние на содержание в костном мозге и прекурсоров грануломоноцитопоэза. Уже с первых суток опыта отмечалось значительное снижение числа гранулоцитомакрофагальных клеток-предшественников в кроветворной ткани экспериментальных мышей. При этом максимальные различия количества КОЕ-ГМ с фоновыми показателями были зафиксированы на 3-й сут (57,06 % от начального уровня) после применения алкилирующего агента. Начиная с 5-х сут наблюдался временный подъем выхода гранулоцито-макрофагальных колоний, сменявшийся повторной депрессией на 8-е сут и окончательной нормализацией лишь к 12-м сут опыта (табл. 4). Изучение пролиферативной активности ДНК-синтезирующих КОЕ-ГМ обнаружило снижение их числа в костном мозге мышей, получавших цитостатик, на 4-е, 5-е и 6-е сут опыта (соответственно до 57,64 %, 35,18 % и 37,50 % при контроле 76,47 %). В дальнейшем, на 10-12-е сут после введения циклофосфана изученные показатели достоверно превысили исходные значения (табл. 4). В то же время интенсивность созревания гранулоцито-макрофагальных предшественников после кратковременного периода угнетения возрастала (в 1,77 и 1,43 раза) на 5-е и 6-е сут эксперимента (табл. 4).
Данные процессы сопровождались значительными нарушениями в структурно-функциональной организации костного мозга. Минимальные значения общее количества ГО были зафиксированы на 3-й сут после цито-статического воздействия (до 51,91 % от фона). При этом в большей степени имело место угнетение образования клеточных ассоциаций с центрально расположенным фибробластом (до 32,73 % от фона). Содержание указанных типов ГО нормализовалось к 5-м сут исследования и достигло достоверных различий с контролем на 10-е сут эксперимента. Восстановление содержания клеточных ассоциаций с центрально расположенным макрофагом, как и общего числа ГО, отмечалось несколько ранее (на 4-е сут), статистически значимо - на 6-е сут (табл. 5).
Влияние таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина на процессы восстановления кроветворения, подавленного 5-фторурацилом
Таблетированный эритропоэтин вызывал умеренное ускорение восстановления ОКК, подавленного 5-фторурацилом (8-е, 12-е, 14-е сут). Это было обусловлено повышением содержания в костном мозге незрелых и зрелых нейтофильных гранулоцитов в соответствующие сроки, лимфоидных клеток - на 8-е сут и эритронормобластов — на 12-е сут опыта (табл. 52).
Следствием стимулирующего эффекта препарата ЭП в отношении костномозгового кроветворения, подавленного 5-ФУ, явились соответствующие различия между опытными и контрольными мышами в картине периферической крови. Оказалось, что стимулятор вызывал выраженный подъем общего количества лейкоцитов на 8-е, 12-е и 14-е сут исследования. Наиболее существенная разница наблюдалась на 12-е сут опыта, когда степень увеличения содержания сегментоядерных гранулоцитов в крови была в 2,56 раза, а лимфоцитов - в 3,15 раза больше аналогичных показателей у мышей, получавших только 5-ФУ.
Количество ретикулоцитов в периферической крови статистически значимо возрастало на 8-е сут после комбинированного использования 5-ФУ и таблетированной формы эритропоэтина (на 1700 % по сравнению с животными, которым вводили только цитостатик). В то же время уровни содержания эритроцитов у мышей опытной и контрольной групп достоверно не различались на протяжении всего периода наблюдения (табл. 53).
Изучение пула коммитированных гемопоэтических прекурсоров в условиях данной экспериментальной модели показало, что таблетированная форма эритропоэтина вызывает некоторые изменения содержания как КОЕ-Э, так и КОЕ-ГМ в костном мозге опытных животных. В период, соответствующий активной регенерации кроветворения, (с 3-по 8-е сут) число эритро-идных прекурсоров оказалось сниженным, по сравнению, как с фоновыми значениями, так и с данными группы контроля. На все остальные сроки значимых отличий между исследуемыми группами не было (табл. 54). Изучение функциональной активности эритроидных прекурсоров выявило снижение темпов деления и одновременное усиление дифференцировки КОЕ-Э - на 4-6-е сут, с последующим ростом пролиферативной активности (на 10-14-е сут) и падением индекса созревания ниже контрольных значений (на 10-е и 14-16-е сут) (табл. 54).
С 4-х по 6-е сут стимулирующий эффект препарата ЭП в отношении числа гранулоцитомакрофагальных предшественников оказался достоверно выше такового в контрольной (только 5-фторурацил) группе. В отдаленные сроки исследования (12-14-е сут), наоборот, число КОЕ-ГМ оказалось достоверно ниже в группе, без стимулятора (табл. 54). Максимальная величина пролиферативной активности гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников, повышавшейся на 3-5-е и 8-12-е сут опыта, отме-чалась на 12-е сут после цитостатического воздействия, когда число КОЕ-ГМ в 1,87 раза превышало контроль (табл. 54). Исследование интенсивности дифференцировки гранулоцитарных прекурсоров показало, что на 3-й сут эксперимента происходит увеличение (в 3,40 раза) индекса созревания КОЕ-ГМ. Затем, на 5-е сут регистрируемое значение становилось достоверно ниже контрольного, и на 8-10-е сут опыта наблюдался повторный подъем данного показателя (табл. 54).
Применение таблетированной формы эритропоэтина на фоне введения 5-ФУ в МПД вызывало восстановление общего количества гемопоэтиче-ских островков в кроветворной ткани мышей, по сравнению с фоном на 14-е сут опыта, при сниженном содержании островков в группе без стимулятора на протяжении всего периода исследования. При этом наблюдалось преимущественное усиление образования структурно-функциональных ассоциаций, кроветворные элементы в которых были связаны с центрально расположенным макрофагом (на 3-й, 4-е, 8-е и 12-16-е сут опыта) (табл. 55). Анализ качественного состава гемопоэтических островков показал, что приросту числа макрофагположительных формирований соответствовало увеличение содержания эритроидных ГО - на 3-4-е, 14-е сут и смешанных ГО - на 14-е, 16-е сут опыта (табл. 55).
Введение мышам эритропоэтина per os после инъекции 5-ФУ не оказывало положительного влияния на секрецию эритропоэтическои активности прилипающими клетками костного мозга, напротив, на 8-12-е сут уровень данного показателя оказался на 63,63 %-45,16 % ниже такового у животных, получавших только цитостатик (табл. 56). В то же время уровни КСА элементов указанной фракции в опытной группе статистически значимо превышали контрольные значения на 4-е и 6-е сут наблюдения (56).
Влияние рчЭП на содержание ростовых факторов в сыворотке периферической крови выражалось в достоверно более высоком уровне Э11А на 4-е и 16-е сут эксперимента. Однако на 6-е, 8-е и 12-е сут после введения цитостатика уровень ЭПА значительно снижался. Применение стимулятора практически не влияло на колониестимулирующую активность сыворотки крови, за исключением 3-х сут, когда уровень данного показателя оказался на 48,28 % ниже такового у животных, получавших только цитостатик (табл. 56).
Таким образом, таблетированная форма эритропоэтина на фоне однократного применения мышам 5-фторурацила в МПД, вызывала некоторую стимуляцию кроветворения, подавленного цитостатиком, что выражалось, в накоплении нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов в костном мозге и увеличении содержания ретикулоцитов в периферической крови. В отдельные сроки было зафиксировано повышение содержания в кроветворной ткани лимфоидных элементов.
Полученные данные о функциональной активности пула прекурсоров гемопоэза свидетельствуют о том, что на модели гемодепрессии, вызванной 5-фторурацилом, отсутствует накопление КОЕ-Э в костном мозге под действием таблетированного эритропоэтина. Подъем показателей костномозгового кроветворения обусловлен при этом, вероятно, более высокими темпами дифференцировки, а затем и пролиферации кроветворных предшественников.
