Фармако-токсикологические свойства новых комплексов и композиций эссенциальных микроэлементов меди, кобальта, марганца, ванадия и лития с аминокислотами и олигопептидами Залялютдинова, Луиза Наильевна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Залялютдинова, Луиза Наильевна. Фармако-токсикологические свойства новых комплексов и композиций эссенциальных микроэлементов меди, кобальта, марганца, ванадия и лития с аминокислотами и олигопептидами : автореферат дис. ... доктора медицинских наук : 14.00.25.- Казань, 2001.- 38 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность темы. Эссенциальные микроэлементы наряду с заменимыми аминокислотами, кофакторами, жирными кислотами, играют жную роль в регуляции нормальных метаболических процессов. Ионы ікрозлементов соединяются с ДНК, образуют активные металлоферменты и другие таллосодсржащие протеиды, играют существенную роль на стадиях репликации, анскрипции и трансляции генов, влияют на рост и жизнедеятельность организма Эйнгорн,1978; А.П.Авцын и др., 1991; F.H.Nielsen, 1996; S.Chan et al., 1998).

Дисбаланс микроэлементов вносит вклад в патогенез различных заболеваний, менение содержания и соотношения микроэлементов имеет значение при емиях, опухолевом процессе, туберкулезе, коллагенозах, нейродегенеративных оцессах, атеросклерозе и многих других заболеваниях (Л.П.Волкотруб, В.Яковлева,1988; А.П.Авцын, 1991; О.А.Громова, 2001; P.K.Eegon,1999; )ominova, 1999; J.T.Saari,1999; D.S. McMillan et al.,2O0O). Но если витамины, цельные незаменимые аминокислоты, их производные и смеси, жирные кислоты троко используются в фармакотерапии различных заболеваний, то арсенал карственных средств, содержащих эссенциальные микроэлементы, за ключением препаратов железа, незначителен и, в основном, представлен органическими соединениями.

Из микроэлементов внимание исследователей привлекают литий и переходные таллы 4 периода таблицы Д.И.Менделеева, в частности, медь, кобальт, марганец, оадий как обладающие уникальным спектром биологической активности и эсобностью образовывать координационные соединения (К.Б.ІТцимирский, 1979; Ювсенян с соавт.,2000; P.C.Joshi,1998; S.Oikawa,1999; M.Kato et a.,2000).

Большая часть биометаллов существует в организме в виде биокомплексов с зличными лигандами, причем аминокислоты прочнее связываются с кроэлементами, чем простые пептиды, и активно транспортируются в клетку .Б.Яцимирский, 1979; М.Хьюз, 1983; C.W.Schwietert, J.P.McCue, 1999; [..Huffman, T.V. O'Halloran, 2001).

Поэтому синтез новых комплексов и создание композиций меди, кобальта, рганца, ванадия и лития с аминокислотами и олигопептидами и изучение их элогических свойств является актуальным.

Диссертация выполнена по плану НИР КГМУ (№ госрегистрации 01.20.00. 578).

Цель исследования. Экспериментальное обоснование и разработка нового ісса противоопухолевых и антианемических средств на основе оригинальных ^плексов и композиций меди, кобальта, марганца, ванадия и лития с L-инокислотами и олигопептидами.

Задачи работы:

1. Осуществить поиск новых комплексов и композиций микроэлементов с тіокислотами, проявляющих противоопухолевую активность, установить

зависимость между природой комплексообразователя, лигандного окружения ат( металла, токсичностью и выраженностью цитотоксического эффекта на опухоле; клетки.

2. Провести сравнительную оценку противоопухолевой активности

ПереВИВНЫХ ОПУХОЛЯХ ІП V1VO И ГСМОТОКСИЧеСКОГО Эффекта КОМПЛеКСОВ И КОМПОЗИ1

в сопоставлении с циклофосфаном, метотрексатом, фторафуром, глицифоном.

Изучить химиотерапевтическую эффективность наиболее активи соединений и композиций на перевивных опухолях in vivo (опухоль Эрлиха, сарю 37, лимфосаркома Плисса) в сравнении с известными противоопухолевы средствами.
Провести оценку антипролиферативной активности новых комплексе композиций микроэлементов с аминокислотами в сопоставлении с платидиаы на клеточных линиях опухолей человека SKOV-3 и MCF-7 и изучить некогор аспекты механизма их антибластического действия.
Изучить чувствительность биопсийного и операционного материа полученного от больных раком яичников III-IV стадий, к лития метионинаг композиции №3 в сравнении с представителями различных класс противоопухолевых средств.
Оценить влияние лития метионината и композиции №3 на синдр постлучевой миелосупрессии.

7. Исследовать влияние новых комплексов и композиций на течсі
гемолитической, дизэритропоэтической анемий, выявить наиболее зффективі
соединение с антианемической активностью и изучить некоторые сторо
механизма его действия.

8.Изучить влияние длительного воздействия наиболее активных комплекс (лития метионината и оксигенированного гистидината кобальта) и композит меди, кобальта, марганца с аминокислотами на организм здоровых животных

Научная новизна. Экспериментально обоснована перспективность пош противоопухолевых и антианемических средств среди новых оригиналы! комплексов и композиций меди, кобальта, марганца, ванадия и лити» аминокислотами.

Впервые оценены фармако-токсикологические свойства новых комплексо композиций микроэлементов с L-аминокислотами. Установлены противоопухолеї и антианемическая активности, токсичность и зависимость этих эффектов, как микроэлеиентного состава, так и природы аминокислотных и пептидных лиганл в комплексах и композициях. Выявлены наиболее эффективные соединенш композиции.

Показано, что аминокислотный комплекс лития (препарат №8) и композии микроэлементов с аминокислотами проявляют антибластомную активность перевивных опухолях животных, клеточных линиях опухолей человека. Препа} №8 по эффективности не уступает широко используемым противоопухолеві средствам, значительно менее токсичен и может быть применен в сочетанш

'чевой терапией. Результаты наших исследований свидетельствуют, что мпозиция меди, кобальта, марганца с природными аминокислотами (композиция :3), наряду с антибластомным и антианемическим действием, проявляет ресспротективную и радиосенсибилизирующую активности. В реализации їханизма антибластомного действия препарата №8 важное значение имеет гасобность соединения подавлять окислительно-восстановительные процессы в сухолевых клетках, композиции №3 - угнетать синтез нуклеиновых кислот. Оба іепарата снижают уровень цАМФ в опухоли.

Выявлено наиболее эффективное соединение с антианемической и диопротекторной активностью - аминокислотный: комплекс кобальта (препарат 27), который по фармакотерапевтической активности на моделях гемолитической дизэритропоэтических анемий сопоставим с цианокобаламином, но не имулирует опухолевый рост.

Результаты исследований расширяют теоретические представления о юлогической активности соединений меди, кобальта, марганца, ванадия и лития.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы обосновывают зможность создания на основе литий-, медь- и ванадийсодержащих пшокислотных комплексов и композиций природных аминокислот с медью, фганцем, кобальтом и литием препаратов, обладающих противоопухолевой тивностью.

Выявление зависимости структуры комплексов, состава композиций и юлогической активности позволяет осуществлять направленный синтез и крывает новый класс противоопухолевых препаратов.

Рекомендуется дальнейшее углубленное доклиническое изучение лития ггионината как потенциального противоопухолевого средства; оксигенированного стидината кобальта — антиансмического, радиопротекторного; композиции №3 -к средства адъювантной терапии онкологических больных. Результаты хледований указывают на целесообразность дальнейшего изучения ютивоопухолевых свойств композиции №4, меди бисметилметиошшата, сованадата, комплекса ванадия с гидразидом изоникотиновой и аспарагиновой слот.

По материалам диссертации получено одно авторское свидетельство с грифом '" для служебного пользования, 5 патентов и приоритет по заявке на изобретение. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аминокислотные комплексы лития, меди, ванадия и композиции меди,
бальта, марганца проявляют противоопухолевую активность. Наибольший
тибластомный эффект достигается комплексированием лития с гистидином,
:тионином, меди с метилметионином, ванадия с гидразидом изоникотиновой
слоты и аспарагиновой кислотой.

2. Лития метионинат и композиция №3 оказывают цитотоксическое действие
опухолевых клетки в экспериментах in vitro с использованием суспензионных

еточных тест-систем, проявляют противоопухолевые свойства на клеточных

линиях опухолей человека in vitro, перевивных опухолях in vivo, на биопсийноі» постоперационном материале от больных раком яичников III-IV стадии. Ош сравнении с известными антибластомными средствами значительно менее токсич и не уступают им по эффективности как в экспериментах in vitro, так и in vivo. В механизме реализации противоопухолевого действия аминокислотш комплекса лития и композиции №3 лежит их способность угнетать окислителы восстановительные процессы в опухолевых клетках, подавлять ДНК и РП синтезирующую активности клеток, снижать уровень ц-АМФ в опухоли.

Оксигенированный гистидинат кобальта (препарат №27) проявл; выраженную противоанемическую активность на моделях гемолитическоі дизэритропоэтических анемий, сопоставимую с таковой цианокобалами; отличается более быстрым наступлением эффекта, не вызывает полицитсмі Препарат оказывает защитное действие при свинцовой интоксикации животны радиопротекторное действие при лучевом воздействии; в отличие цианокобаламина, не стимулирует опухолевый рост. В механизме реализаи противоанемического действия соединения имеют значение t мембранопротекторные, антиоксидантные свойства и стимулирующее влияние костно-мозговое кроветворение.
Препараты №8 и №27 малотоксичны, композиция №3 относитель безвредна при однократном внутрибрюшинном введении, их курсовое введение вызывает выраженных патологических изменений в организме здоровых животш
Аминокислотные комплексы лития, кобальта и композиции меди, кобаль марганца, лития и аминокислот с низкой токсичностью являются перспективні классом для поиска эффективных противоопухолевых и антианемическ лекарственных средств.

Апробация работы. Основные положения диссертационной рабо
доложены и обсуждены на Всероссийской ко і іференции "Научная работа - как осік
творческого роста преподавателя" (Волгоград, 1993), Российской научи
конференции "Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы " (і
Петербург, 1994), Всероссийской конференции "Актуальные вопро
экспериментальной и клинической фармакологии", (Смоленск, 1994), II, III, IV
Российском национальном Конгрессе " Человек и лекарство" (Москва, 1995 - 199
1 -м Съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995); \\
Vth и Vlth International Symposium on Oncology Pharmacy Practice (Hamburg, 19'
Sidney, 1997, Washngton, 1998); Third spring meeting "New insights
Hematology"(Venice,l996); Российской научной конференции, посвященной
летию со дня рождения проф. И.В.Заиконниковой (Казань, 1996), Internatio
Symposium "Antidepressants therapy at the dawn of the of the 3 rd Millenium"(Castr
France, 1997); III International Congress of Pathophysiology (Lahti, 1998),na XII
International Congress of Pharmacology (Munchen,1998); Всероссийск
конференции с международным участием "Актуальные проблеї

экспериментальной и клинической фармакологии"(С.-Петербург, 199

Іеждународной конференции "Фармация s XXI пеке: инновации и традиции"(С-етербург, 2000); заседаниях предметно-проблемной и центральной проблемной эмиссий КГМУ (2000, 2001); International Workshop "Modern Development of Tagnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. Basic Physics and Applications in ledicine and Biology" (Kazan,2001).

Публикации. Опубликовано 45 работ, в том числе 1 авторское свидетельство грифом "Т", 6 патентов и приоритет по заявке на изобретение.

Структура н объем работы. Диссертация объемом 367 страниц состоит $ введения, обзора литературы, главы - материалы и методы, 5 глав результатов эбственных исследований, выводов, практических рекомендаций, приложения, казателя литературы, включающего 546 источников, из них 281 иностранных тгоров. Диссертация содержит 45 рисунков и 92 таблицы.

Материалы и методы исследования.

Эксперименты выполнены на 2160 нелинейных и 357 линейных мышах Balb, C_S7Bl/6, DBA/2), 1064 белых крысах, на клеточных тест-системах, перевивных неточных линиях опухолей человека SKOV-3 и MCF-7, биопсийном и перационном материале от больных раком яичников Ш-IV стадий.

Объектом исследования явились 37 новых комплексов и композиций, одержаших литий, ванадий, марганец, кобальт, медь и аминокислоты, лигопептиды, синтезированные в научно-исследовательской лаборатории эординационных соединений КГУ д.х.н., проф.А.В.Захаровым, к.х.н., в.н.с. .Г.Штырлиным, к.х.н., доцентом З.П.Сапрыковой, к.х.н., н.с. ГА. Назмутдиновой. 'зучаемые соединения представлены гомолигандными комплексами меди, лития, ксованадия, марганца и оксигенированного кобальта (1, 4-а, 6, 8, 9,10, 11-14, 19, 7), гетеролигандными комплексами меди и оксованадия (2, 1-а, 2-а, 7, 15-17, 20-5)(табл.1) и композициями десяти природных аминокислот (валин, лейцин, золейцин, фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, гистидин, серии, гутаминовая кислота) с медью, марганцем, кобальтом и литием, отличающимися о микроэлементному составу и содержанию аминокислот (1-7) (табл.2).

Первичную оценку биологической активности исследуемых веществ и эмпозиций проводили путем изучения острой токсичности для мышей и крыс vl.А.Беленький, 1963)(токсичность ванадийсодержащих комплексов определялась эвместно с к.м.н. А.Р. Госмановым); цитотоксичпости в отношении опухолевых петок in vitro (Б.Е.Айземан и др., I960; R.Bona et al, 1987); влияния препаратов а степень гемолиза эритроцитов in vitro в условиях гипотонического и зободнорадикального воздействия (A.D.Inglot et al., 1968; Л.В. Половинкин и p., 1994).

Антибластомную активность новых комплексов и композиций исследовали і экспериментальных моделях перевивных опухолей мышей: асцитной и солидной пухоли Эрлиха, саркоме 37; лнмфосаркоме Плисса крыс. Трансплантацию опухолей существляли общепринятыми методами (Г.Н.Першин, 1971; З.П.Софьина и р., 1980). Штаммы опухолей получены из банка РОНЦ. В качестве препаратов

сравнения использовали циклофосфан, метотрексат, фторафур и глицифон.

Противоопухолевую активность наиболее эффективных композиции комплексов оценивали на клеточных линиях опухолей человека SKOV-3 и МО in vitro по их влиянию на окислительно-восстановительную активность опухолев клеток с помощью МГТ-теста (T.Mosmann, 1983; M.C.Alley et al.,1988) и пролиферативную активность опухолевых клеток радиометрическим методом включению в опухолевые клетки ³Н-тимидина и ³Н-уридина (по 10.0 mkKh/mj объеме 20мкл) с использованием стекловолокошюго фильтра Filtermat и харвестс Tomtec (USA) для отмывания от несвязанного ³Н-тимидина и ³Н-уридина. Филі пропитывали твердым сцинтилляционным покрытием Meltilex А. Учет связанн радиоактивности производили на р-счетчике Microbeta Plus. 1450 фирмы Wal (Finland) ( выполнено при консультации профессора Н.С. Сергеевой , МНИОИ і П.Н.Герцена).

Влияние лития метионината и композиции №3 на морфологическую структ) лимфосаркомы Плисса и регионарных лимфатических узлов оценивали, изу срезы, окрашенные гематоксилин-эозином и по ван Гизону (Г.А. Меркулов, 196 На микропрепаратах при помощи морфометрической сетки случайного іш проводилось определение площади некроза опухоли (С.Б.Стефанов, 1974), состоят лимфатических узлов исследовалось по схеме ВОЗ (А. Котье и др.,197. Микропрепараты консультировались на кафедре патологической анатомии КГК доцентом, д.м.н. Д.Э.Цыплаковым.

Содержание ц-АМФ в крови и опухоли определяли радиохимическим метод (A.G.Gilman, 1970). Радиоактивность просчитывали в жидкостном сцинтиллятс "ЖС-8" на радиоспектрометре "Delta-300" (США).

Свободные радикалы в гепаринизированной плазме и в опухоли определя по парамагнитным центрам методом ЭПР на радиоспектрометре ER-200 D ("Brukc Германия), оснащенном компьютером "Aspect-2000" при 140±0.2 К. В качестве Э1 спинового зонда использовали водный раствор TEMPO (2,2,6, тетраметшшиперидин-1-оксил) в концентрации 5х10"³М (Л. Берлинер,1979).

Времена спин-решеточной (Т,) и спин-спиновой (Т₂) релаксации сыворот крови и опухоли животных определяли при 310± 1 К на ЯМР-релаксометре "Minisf РС-120" ("Bruker", Германия) п _еэ=19,5 МГц. Для измерения времени использовали последовательность 180-i -90, а для измерения ^-последовательное импульсов Карра-Персела-Мейбума-Гилла.

Измерение самодиффузии молекул воды выполняли на ЯМР-релаксомстрі резонансной частотой для протонов 60 МГц с импульсным градиентом магнитне поля с максимальной амплитудой 40 Тл/м. Применяли импульсн) последовательность "стимулированное эхо" ( J.Karger,1969; А.И.Маклаков и д 1987). Измерения производились при 310±0,2 К.

Спектры ЯМР-'Н высокого разрешения растворов композиций аминокисл с микроэлементами и супернатантов асцитической жидкости после ннкубац композиций с опухолевыми клетками регистрировались на спектрометре Van

nity 300 (USA) на частоте 300 МГц. Химические сдвиги в спектрах измеряли носительно внутреннего эталона 2,2-диметил-2-сшгапентан-5-сульфоната натрия )SS) и диоксана при температуре 293 К и идентифицированы (В.С.Христофоров Др., 1997).

Оценку чувствительности материала, полученного от онкологических больных, препарату №8 и композиции №3 в сравнении с фарморубицином, платидиамом, ірбоплатином, 5-фторурацилом, этопозидом и Тио-ТЭФ проводили с пользованием модифицированного МТТ-теста (О.А.Куриляк, 1993) и ³Н-[мидинового теста.

Оценка влияния препарата №8 и композиции №3 на центральную нервігую істему осуществляли с применением ориентировочно-исследовательской реакции мышей (J.R. Boissier et al.,1964), определения мышечного тонуса и координации іижений (N.W.Dunham et al., 1957); влияния на судорожный итоксический эффекты )разола (Н.К.Барков, В.В.Закусов,1973). Изучали взаимоотношение с іркотическим средством - гексеналом, нейролептиком - галоперидолом /І.Д.Машковский с соавт.,1993). Влияние на устойчивость животных к гипоксии денивали по продолжительности жизни в герметически закрытом сосуде, после іедения натрия нитрита (Н.В.Кораблев, П.И.Лукиенко,1976) и натрия фторида 5.А.Шугаев, Н.С.Андросов, 1968). Стресспротективные свойства изучали на оделях иммобилизационного стресса (И.И. Брехман, О.И.Кириллов, 1968) и ;избегаемого стресс-воздействия — плавательного теста (R.Porlsot et al.,1977; .Ю.Русаков, А.В. Вальдман,1983).

Антианемическую активность комплекса кобальта и композиций оценивали і традиционных экспериментальных моделях анемии крыс, вызванных введением шянокислого фенилгидразина, нитрата свинца и общим у -облучением. Для эделирования гемолитической анемии солянокислый фенилгидразин вводили эдкожно в дозе 30 мг/кг/сутки ежедневно на протяжении четырех дней [.В.Лазарев, 1954). Дизэритропоэтическую анемию у крыс вызывали ежедневным эдкожным введением свинца нитрата в дозе 50 мг/кг/сут в течение 7 дней І.М.Явербаум, 1988). Для моделирования апластической анемии вызывали острую тевую болезнь у крыс общим однократным у -облучением в дозе 4,5 Грей (исто-іик у -излучения-Co⁶⁰, мощность дозы 0,444 Гр/мин) на гамма-терапевтической :тановке АГАТ-PI (Р.П.Пулатов,1969). Дозиметрический контроль за дозой їлучения производился с помощью дозиметра VA-J—18(Германия)(совместно с м.н. Н.Э.Бакировой).

Для оценки влияния комплексов и композиций, проявляющих эотивоопухолевую активность, на гемопоэз и эффективности композиций и імплексов на моделях анемий исследовали показатели периферической крови ровень гемоглобина, число эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, матокрит, лейкоцитарную формулу) (А.Н.Альтгаузен,1964). При оценке [тианемической активности рассчитывали цветовой показатель (ЦП), индексы штроцитов: Ср.ОЭ- средний объем эритроцита, ССГЭ- среднее содержание

гемоглобина в эритроците, СКГЭ- среднюю концентрацию гемоглобина эритроците ( Г.И.Козинец ,1998). Исследования костного мозга проводили пут подсчета числа ядросодержащих клеток костного мозга (ОККМ)( H.W. Geran 1956), а также подсчета миелограммы и парциальной эритробластограмл общепринятыми методами (М.Г.Абрамов,1985; В.В.Меньшиков,198 Е.Б .Владимирская. 1993). Функциональную активность нейтрофилой оценивалі спонтанном и стимулированном тесте восстановления нитросинего тетразол (А.Н.Маянский, 1988).

Изучение эритропоэтической активности сыворотки крови животнь получавших препарат №27, проводили по методу Krystal.A. в модификации Т. Монаковой и НА. Сеткова (1989). Стандартом эритропоэтина служил коммерческ препарат "Epoetin ALFA" (Epogen, США) с активностью 2000 ЕД/м Радиоактивность отдельного образца измеряли на жидкостном сцинтилляционш счетчике Beckman LS 1801 (Германия).

Кроме того, на модели острой лучевой болезни крыс было проведе исследование влияния препаратов № 8,27, композиции №3 и цианокобаламина постлучевое восстановление организма подопытных животных с учет< выживаемости по 30-дневному тесту и средней продолжительности жиз (Р.А.Бесядовский и др.,1978).

Для обоснования безвредности комплексов лития, кобальта и ком поз иц проведены исследования по изучению подострой токсичности на крысах п внугрибрюшинном введении лития метионината в дозах, соответствующих 1/5( 1/10 DL₅₀, гистидината кобальта в 1/20 DL_J0 и композиции №3 в до: соответствующей терапевтической. В конце курса инъекций регистрировались общ состояние, поведение животных и прирост массы тела, оценивались функционалы! активность почек по реакции на водную нагрузку, некоторые биохимическ показатели крови, состояние периферической крови, коэффициенты масс внутрснн органов; измерялась температура тела и регистрировалось время выполнен "норкового рефлекса".

При моделировании острой лучевой болезни, изучении стресспротективн активности на модели иммобилизационного стресса и в серии опытов по изучеш безвредности препаратов №27, 8 и композиции №3 при многократном введен здоровым животным определялись содержание общего белка, глюкозы, обще холестерина, общего билирубина, железа, мочевины, мочевой кислоты, креатинш триглицеридов, активность сывороточных ферментов: аланинаминотрансфера и аспартатаминотрансферазы, а-амилазы, у-глутамилтранспептидаз лактатдегидрогеназы на биохимическом анализаторе Cobas MiraPlus 1997 ("Roche и тимоловая проба с использованием реактивов Био-Ла-Тест "Тимоловая проб ("Лахема"). Некоторые биохимические исследования выполнены на базе ДНУ КГМУ совместно с к.б.н., с.н.с. И.Х.Валеевой: определение общ ангиокислительной активности сыворотки, определение активное антиоксидантных ферментов - пероксидазы и каталазы сыворотки (Т.Попоп

p.,1971; М.А.Королюк и др., 1988); определения уровня диеновых конъюгатов и одержання малонового диальдегида в сыворотке и гомогенатах органов И.Д.Стальная, 1977; Э.Н.Коробейникова, 1989), определение содержания идроперекисей липидов в плазме крови (В.Б.Гаврилов и др., 1983).

Статистическая обработка результатов исследований производилась с спользованием t-критерия Стьюдента, пакета компьютерных программ "Aspect-000, таблиц Генеса (1964). Альтернативные реакции оценивались методом Фишера Д.И.Закутинский, 1960). Построение графиков и таблиц осуществлялось с спользованием компьютерной программы Excel/ Windows.