Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Свободно - радикальные процессы и биоантиоксиданты (обзор литературы) 12
1.1. Свободные радикалы и антиоксидантная система 12
1.2. Роль свободно - радикального окисления при старении и алкоголизме 18
1.3. Природные антиоксидантне вещества и создание на их основе комбинированных препаратов 25
1.4. Заключение 33
ГЛАВА 2. Изучение антиоксидантной активности нового комплекса 35
2.1. Материалы и методы 35
2.2. Влияние на аскорбат - зависимое ПОЛ 41
2.3. Изучение взаимодействия со стабильным радикалом 2,2 -дифенил-1-пикрилгидразилом 42
2.4. Эффекты при люминол-зависимой хемилгоминесценции 44
2.5. Влияние комплекса на параметры железо (II) индуцированой хемилюминесценции липидов 47
2.6.Действие на показатели АБАП- индуцированной хемилюминесценции 49
2.7. Заключение 52
ГЛАВА 3. Изучение влияния комплекса на морфо-функциональный статус крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов 54
3.1. Материалы и методы 54
3.2. Влияние на общее состояние и неврологические параметры старых крыс 66
3.2.1. Влияние на поведенческие реакции 66
3.2.2. Действие на память 69
3.2.3. Заключение 71
3.3 Действие комплекса на гемореологию и систему свертывания крови у крыс с ускоренным старением 72
3.3.1. Действие на гемореологические параметры 72
3.3.2. Влияние композиции из растительных флавоноидов на показатели системы свертывания крови 78
3.3.3. Заключение 80
3.4. Влияние на параметры атерогенеза у старых животных 82
3.5. Заключение 86
ГЛАВА 4. Изучение механизмов действия комплекса на морфо-функциональный статус крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов 88
4.1. Материалы и методы 88
4.2. Изучение параметров перекисного окисления липидов у старых крыс 94
4.2.1.Влияние на продукты ПОЛ и хемилюминесценцию 94
4.2.2. Действие на антиоксидантую систему 103
4.2.3. Заключение 107
4.3. Исследование морфологических показателей при старении 108
4.3.1. Изучение изменений в кардиомиоцитах и сосудах 108
4.3.2. Эффекты на гистохимичексие маркеры ПОЛ 116
4.3.3. Влияние на нейроны гловного мозга 119
4.3.4. Заключение 121
4.4.Заключение 123
ГЛАВА 5. Изучение алкогольпротективньгх свойств композиции на основе комплекса природных флавоноидов 124
5.1. Материалы и методы 125
5.2. Влияние на выживаемость крыс при введении высоких доз этанола 128
5.3. Действие на выраженность и динамику наркотического действия этанола 129
5.4. Заключение 137
ГЛАВА 6. Фармакологический анализ центральных механизмов неиротропного действия композиции на основе растительных флавоноидов 138
6.1. Материалы и методы 138
6.2. Действие на показатели двигательной активности 144
6.3. Влияние композиции на моноаминергические системы мозга 145
6.3.1. Эффекты на показатели фенаминовой стереотипии 145
6.3.2. Действие на эффекты апоморфина 147
6.3.3. Оценка изменения показателей клофелиновой гипотермии 148
6.3.4. Влияние на эффекты 5-окситриптофана 149
6.4. Изучение влияния композиции на холинэргическую систему мозга 150
6.4.1. Действие на эффекты ареколина 150
6.4.2. Влияние на показатели никотинового тремора 150
6.5. Заключение 152
ГЛАВА 7. Изучение острой токсичности нового комплекса 154
7.1. Материалы и методы 154
7.2. Исследование острой токсичности 156
7.3. Заключение 158
ГЛАВА 8. Обсуждение результатов 159
Выводы 170
Список литературы 171
- Природные антиоксидантне вещества и создание на их основе комбинированных препаратов
- Влияние комплекса на параметры железо (II) индуцированой хемилюминесценции липидов
- Влияние композиции из растительных флавоноидов на показатели системы свертывания крови
- Действие на выраженность и динамику наркотического действия этанола
Введение к работе
Актуальность темы. Многие распространенные болезни и осложнения связаны с дефицитом в организме человека эндогенных антиоксидантов - веществ, препятствующих накоплению избыточного количества свободных радикалов [Harman, 2006; Анисимов, 2008]. Дисбаланс показателей антиоксидантной и прооксидантной систем, приводит к нарушению регуляций клеточного гомеостаза, что индуцирует, в частности, процесс преждевременного старения [Зенков и соавт., 2001; Хавинсон и соавт., 2003; Дубинина, 2006], способствует развитию различных заболеваний. Для старения характерным является определенный "спектр" патологий: атеросклероз [Климов, Никульчева, 2001; Ланкин, 2004]; сердечно-сосудистые заболевания [Коган, 2002; Мирозоян, 2003; Капелько, 2009]; дисфункции мозга [Плотников, 2000; Дамулин, 2009], сахарный диабет [Дедов, 2003; Балаболкин, Клебанова, 2004; Bloomgarden, 2006] и др. В основе этих нарушений лежат процессы каскадной, свободно-радикальной окислительной модификации липидов, белков и ДНК [Подколзин, 2000; Владимиров, 2006; Slemmer, 2008].
Другим фактором, усугубляющим процессы старения, по мнению ряда ученых является чрезмерное употребление алкогольных напитков [Molina, Brooke, 2007; Сиволап, Савченко, 2008]. Алкоголь нарушает течение всех биохимических реакций организма, а это в свою очередь ведет к изменениям в структуре и работе всех органов [Тюренков, 2002; Нужный, 2006]. Токсическое влияние алкоголя на организм многообразно, однако одним из основных его проявлений является цепь нарушений, связанных со свободно-радикальным (СРО) и перекисным окислением липидов (ПОЛ) биомембран.
Антиоксидантные средства способны регулировать процессы свободнорадикального окисления, создавая оптимальные условия для нормального метаболизма и функционирования клеток и тканей в условиях окислительного стресса. Перспективным является создание комплексов веществ с антиоксидантыми свойствами [Сторожок, 2002; Pryor et al., 2006], имеющих широкий спектр антиоксидантных эффектов и ряд преимуществ перед монопрепаратами, в частности с целью геро- и алкогольпротекции.
При создании комплексов с антиоксидантой направленностью важно соблюдать сбалансированность состава, включая в него компоненты, действующие как в липидной, так и в водной фазах, влияющие как на процессы липопероксидации, так и на радикалообразование [Оковитый, Шуленин, 2005]. Основой таких компонентов могут стать биоантиоксиданты (БАО), как наиболее безопасные вещества.
На основании вышеперечисленного и опираясь на ранее опубликованные работы [Овчинникова, 2005], была спланирована дальнейшая работа по расширенному изучению фармакологических свойств антиоксидантного комплекса, состоящего из экстракта гребней винограда, токоферола, ретинола, аскорбиновой кислоты, глутатиона, экстракта корня солодки, янтарной кислоты, а также микроэлементов селена, магния и цинка, и возможности его использования для коррекции окислительно-восстановительных процессов, стабилизации метаболических изменений и уменьшения различных патологических процессов.
Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ ГР 01. 2001 16045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ ГР 01. 2006 09439), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от 12.10.2005 г.).
Целью исследования является изучение действия нового антиоксидантного комплекса на основе флавоноидов у крыс с дефицитом эндогенных антиоксидантов и интоксикацией алкоголем, определение его нейротропной активности и токсических свойств.
Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:
-
Исследовать антиоксидантную активность нового комплекса in vitro с детализацией спектра антирадикальных воздействий;
-
Изучить влияние комплекса на поведенческую активность, систему гемореологии и свертывания крови и показатели атерогенеза у крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов;
-
Детализировать механизмы влияния комплекса на показатели экспериментального дефицита эндогенных антиоксидантов по изменению морфологических показателей и параметров перекисного окисления липидов;
-
Установить действие комплекса на выживаемость крыс при острой алкогольной интоксикации и показатели выраженности и динамики наркотического действия этанола;
-
Изучить влияние нового комплекса на основные медиаторные системы мозга с определением возможного спектра нейротропной активности;
-
Исследовать показатели острой токсичности разработанного комплекса.
Научная новизна. Впервые были получены сведения о влиянии нового комплексного вещества на показатели перекисного окисления липидов и свободно-радикальных процессов in vitro. Впервые были получены данные об активности нового комплекса при экспериментальном дефиците эндогенных антиоксидантов по влиянию на поведенческие реакции, функции памяти, реологические функции крови, обмен липидов, а также изучены механизмы этих эффектов у крыс с дефицитом эндогенных антиоксидантов. Было установлено влияние нового антиоксидантного комплекса на выживаемость крыс при введении высоких доз этанола, а также выраженность и динамику наркотического действия этанола. Впервые были получены сведения об общей нейротропной активности данного комплекса и его токсических свойствах.
Научно-практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности создания и использования натуральных антиоксидантных комплексных веществ при свободно-радикальной патологии. Были получены данные о наличии у композиции на основе природных флавоноидов геропротективных эффектов по влиянию на индекс атерогенности липидов крови и улучшению ее реологических свойств, и установлены механизмы геропротекторного действия. Была экспериментально доказана возможность использования композиции с целью алкогольпротекции при острой и хронической алкоголизации. Выявленные антиоксидантные, антирадикальные и другие сопряженные эффекты композиции на основе природных флавоноидов определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований комплекса с целью создания на его основе нового антиоксидантного средства.
Реализация результатов исследования. Выявленные фармакологические эффекты и их возможные механизмы учитываются в экспериментальной работе лаборатории фармакологии антиоксидантных средств НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Ростовского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработанный комплекс обладает выраженной антиоксидантной активностью с широким спектром антиоксидантных эффектов;
-
Комплекс улучшает гемореологические и коагуляционные свойства крови, оказывает кардио- и эндотелиопротективное действие у крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов;
-
Новый антиоксидантный комплекс проявляет алкогольпротективные свойства при экспериментальной острой и хронической алкоголизации;
-
Разработанный комплекс относится к малотоксичным веществам (класс IV токсических веществ в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76).
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на X региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2005), на 64-ой открытой итоговой конференции молодых ученых и студентов ВолГМУ (Волгоград, 2006), на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Саратов, 2006), на V научной конференции "Практикующий врач" (Римини, 2006), на II (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007), на V конференции молодых ученных России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ (из них одна в центральной печати).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 37 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2–7), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 240 отечественных и 140 зарубежных источников.
Природные антиоксидантне вещества и создание на их основе комбинированных препаратов
Старение организма - сложный и многогранный процесс, который не может быть сведен к одному конкретному механизму, но среди групп влияний, играющих важную роль при старении, безусловно, большое значение имеет окислительное повреждение макромолекул. Основное положение свободно -радикальной теории старения сформулировал D. Harman еще в 1954 г. Он предположил, что универсальной причиной старения является свободно - радикальное окисление липидов (жиров) и белков, а это приводит к мутациям клеток, нестабильности генома и развитию ряда возрастных патологий: рака, сердечнососудистых заболеваний, возрастного угнетения иммунной системы, нарушения функционирования мозга, возрастных заболеваний глаз (катаракта) и др. [Bonnefoy, Drai, Kostka,2002; De Fuente,2002; Ивашкин, 2005; Соловьева, Миронова, 2008]. В последнее время эта теория находит все большее подтверждение [Хавинсон, Баринов, 2003; Янковский, 2008].
В норме образование и распад АФК должны находиться в состоянии баланса, что предохраняет клеточные структуры от повреждения и обеспечивает важные функции [Hung, Skepper, Burton, 2001; Чеснокова, 2004]. Но при окислительном стрессе наблюдается дисбаланс, между образованием активных форм кислорода и работой антиоксидантов, что довольно часто и наблюдается при возрастной патологии [Lane, 2003; Анисимов, 2006].
Окислительный стресс с накоплением в тканях АФК обнаружен при, более чем 200 болезнях, часто называемых свободно-радикальными патологиями, и в зависимости от того, на какие ткани направлена их атака, может привести к развитию различных старческих дегенеративных заболеваний [Болдырев, 2001; Дубинина, 2001; Терехина, Петрович, 2005]: - повреждение клеточных мембран в крови и сосудах предрасполагает к сердечно-сосудистым заболеваниям и инсульту; - повреждение внутриклеточных механизмов вызывает поломки ДНК, обусловливает предрасположенность к раку; - повреждение белков кожи снижает ее эластичность, ухудшает ее функциональное состояние; возникают морщины и различные кожные заболевания. - атака свободными радикалами поджелудочной железы, приводит к диабету; - повреждение липидов внутри хрусталика глаза, обуславливает образование катаракты и др. При этом важно отметить, что механизмы повреждений клеточных элементов при окислительном стрессе носят общий характер, независимо от причин, вызывающих окислительный стресс [Болдырев, Мальцева, 2002]. Как было уже сказано ранее, в процессе окислительного стресса происходит повреждение основных клеточных структур [Подколзин, 2000]: - повреждение ДНК; - белков; - липидов. Молекула ДНК может повреждаться напрямую, в основном - гидроксид-радикалом и (в гораздо меньшей степени) супероксид-анионом кислорода. Гидроксид-радикал ОН может действовать на пуриновые и пиримидиновые основания, а также на остатки рибозы и дезоксирибозы [Melov, 2003]. Супероксид-анион 0{ обладает избирательным действием, взаимодействуя с гуанино-выми основаниями, в результате чего образуются их разнообразные окисленные производные [Воейков, 2004; Меньшикова, 2008]. Радикалы, образующиеся при перекисном окислении липидов (ПОЛ), также повреждают молекулы ДНК [Rodriguez et al., 1995]. В ряде экспериментов было показано, что митохондриальная ДНК (мтДНК) подвергается окислительному действию АФК даже в большей степени, чем ядерная, так как она находится в непосредственной близости от источ ников АФК и не защищена гистонами [Finkel, Holbrook, 2000; Barja, Herrero, 2000]. Так при взаимодействии перекиси водорода, образующейся в дыхательной цепи, с ионами Fe2+ и Си2+, которые присутствуют в митохондриальных мембранах, образуется гидроксид-радикал, который и повреждает митохондри-альную ДНК [Kira, Sato, Inoue, 2003]. Она может повреждаться также и при действии перекиси водорода, образующейся в моноамино оксид азной реакции [Cadenas, Davies, 2000]. Повреждение митохондриальной ДНК ведёт к нарушению синтеза белков - переносчиков электронов дыхательной цепи. Торможение дыхательной цепи приводит к генерации ещё большего количества супероксида и как следствие, может возникнуть угроза уничтожения ядерной ДНК и клетки в целом.
Повреждение ДНК может происходить так же и в результате действия эндонуклеаз, которые активируются при повышении концентрации внутриклеточного Са , наблюдаемом в ходе окислительного стресса [Капелько, 2009]. В результате действия АФК на молекулу ДНК возникают хромосомные аберрации, которые представляют собой нарушения структуры хромосомы [Дурнев, Середенин, 2001].
Таким образом, повреждения ядерной и митохондриальной ДНК соматических клеток приводят к активации или инактивации специфических генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и контроль роста [Боровкова, Мя-котных, 2009], а накопление с возрастом таких мутаций в различных органах и тканях является основным фактором, определяющим развитие возрастных патологий, например, таких как рак [Thornalley, 2008].
При повреждения белков наиболее распространенный и легко обнаруживаемый тип - образование карбонильных групп при окислении аминокислот: лизина, аргинина и пролина [Stadtman, 2004]. В условиях окислительного стресса происходит окислительная модификация белков. Свободные радикалы атакуют белки по всей длине полипептидной цепи, нарушая не только первичную, но и вторичную, и третичную структуру белков, что приводит к агрегации или фрагментации белковой молекулы [Дубинина и соавт., 2002; Agarwal, Sohal, 1995].
Если белок содержит металл с переменной валентностью, в присутствии перекиси водорода образуется гидроксид - радикал, окисляющий аминокислоты [Raha, Robinson, 2000].
Так же карбоксильные группы белков под действием АФК превращаются в карбонильные группы, которые, в свою очередь, могут взаимодействовать с аминогруппами, образуя Шиффовы основания, приводящие в конечном итоге к образованию поперечных сшивок между белковыми молекулами и нарушению их активности [Янковский, 2008]. Процесс химического сшивания наблюдается и при гликозилировании белков, который существенно активируется при окислительном стрессе [Yan, Traber, Kobuchi, 1996]. Так образование поперечных сшивок в белке коллагене приводит к потере тканью эластичности, атеросклерозу, нефропатии при диабете, катаракты, болезни Альцгеймера и другой возрастной патологии [Vila, Perier et al., 2008; Peppa, Uribarri et al., 2008; Cai, He, et al., 2008].
Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) является важной причиной накопления клеточных дефектов [Бурлакова, 1998]. Усиление этого процесса ведет к образованию избыточного количества свободных радикалов, что нарушает состояние клеточных мембран и коллоидное состояние протоплазмы [Болдырев, Юнева, 2000].
Влияние комплекса на параметры железо (II) индуцированой хемилюминесценции липидов
Было показано, что композиция на основе комплекса природных флаво-ноидов оказывает антиоксидантное и антирадикальное действие на широком спектре моделей in vitro. Так на моделях аскорбат-зависимого ПОЛ и Fe -индуцированной ХЛ липидов доказаны ее антиоксидантные свойства. При изучении влияния комплекса на реакции аскорбат-зависимого ПОЛ выявили, что максимальный антиоксидантый эффект вещества наблюдался не только в дозе 50 мг/кг, но и при уменьшении терапевтической дозы в 2 раза. На реакциях железо (II) индуцированной хемилюминесценции липидов было установлено, что изучаемая композиция во всех представленных концентрациях препятствует ПОЛ, при этом, однако, именно в терапевтической дозе ПОЛ полностью подавляется. Аскорбиновая кислота в данной модели исследования во всех изучаемых концентрациях не показала выраженного антиоксидантого эффекта. По всей видимости, это объясняется тем, что механизм ее действия in vitro обусловлен антирадикальной активностью, а антиоксидантные свойства регистрируются in vivo и связаны с переводом токофероксила в активную форму токоферола, как было установлено Halliwell (1994).
При изучении взаимодействия композиции на основе комплекса природных флавоноидов со стабильным радикалом ДПФГ» было установлено, что исследуемая композиция обладает атирадикальной активностью как в водном, так и спиртовом растворе. При этом в обоих случаях отмечался дозозависимый эффект, однако водорастворимая фракция проявила меньшую дозозависи-мость.
Влияние на люминол-зависимую ХЛ свидетельствует о способности композиции на основе комплекса природных флавоноидов в широком диапазоне доз ингибировать образование АФК. При этом изучаемый комплекс превосходит по эффективности отдельно взятую аскорбиновую кислоту.
Подавление АБАП-индуцированной ХЛ, в данном случае, свидетельствует о перехвате композицией пероксильных радикалов R02\ их элиминации из сис темы, следствием чего является отсутствие свечения. С другой стороны, уменьшение амплитуды ХЛ расценивается, как способность вещества взаимодействовать с радикалами люминола и активными формами кислорода
Таким образом, изучение антиоксидантной активности композиции на основе комплекса природных флавоноидов in vitro показало, что композиция обладает широким спектром антиоксидантных свойств, основанных на перехвате различных форм свободных радикалов, и именно применение веществ в комплексе обладает наибольшей активностью по сравнению с отдельными компонентами.
Опираясь на полученные данные об антиоксидантой активности изучаемого комплекса, представляется актуальным дальнейшее изучение ее фармакологических свойств.
Антиоксидантные препараты широко используются в современной гериатрической практике [Bonnefoy, 2002; De la Fuente, 2002]. В частности, они применяются в комплексном лечении болезни Альцгеймера [Luchsinger, 2003], болезни Паркинсона [Milgram, 1990; Cadet, 1993]. Кроме того, осуществлен ряд экспериментальных попыток по продлению жизни животных с помощью анти-оксидантов [Milgram, 1990; Floyd, 1993; Kitani, 2001], а также имеются клинические наблюдения той же направленности [Luchsinger, 2003].
Учитывая то, что в предыдущей серии экспериментов нами было установлено выраженное антиоксидантное и антирадикальное действие композиции на основе комплекса природных флавоноидов на моделях in vitro, в последующих сериях экспериментов было выполнено исследование геропротективной активности комплекса на модели экспериментального старения.
В работе использовали следующие реактивы: «Тромбин» - лиофильно высушенный реагент (Россия), растворитель для тромбина (Россия, Барнаул), буфер трис-НС1 (Россия), лиофильно высушенная тромбопластинкальциевая смесь (Технология стандарт, Россия), контрольная плазма (Технология стандарт, Россия), кефалин (Технология стандарт, Россия), каолин (Технология стандарт, Россия), кальция хлорид (Технология стандарт, Россия), стандартную диету AIN-76 (ICN Biomedicals, США), безантиоксидантную диету Tocoferol defficient diet (ICN Biomedicals, США), наборы фирмы Biocon (Германия) для определения холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ) и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП).
Влияние композиции из растительных флавоноидов на показатели системы свертывания крови
Вязкость крови определяли на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия). Принцип действия прибора основан на методе ротационной вискозиметрии со свободно плавающим цилиндром-ротором [Добровольский, 1989]. Статор двигателя прибора создает магнитное поле, которое заставляет вращаться плавающий ротор. Показатель вязкости крови является производным от скорости вращения ротора в исследуемом образце крови.
Для этого 0,84 мл цельной крови инкубировали при 37 С в течение 10 минут, затем кювету с пробой и ротором помещали в прибор и исследовали вязкость крови при различных скоростях сдвига (от 300 до 5с"1). Вязкость крови измеряли при стандартном гематокрите 45% в сантипуазах (сПз). Величину гематокрита определяли центрифугированием капилляров с образцами крови на микрогемоцеитрифуге МГЦ-8 (8000 об/мин, 3 минуты) как отношение протяженности в центрифужном капилляре столбика эритроцитов к столбику плазмы. Индекс эффективности доставки кислорода в ткани рассчитывался как отношение гематокрита исследуемого образца к вязкости крови при высоких скоростях сдвига (300с"1) [Stoltz, 1991; Муравьев и др., 1998]. Уменьшение индекса свидетельствует о снижении эффективности доставки кислорода к тканям [Вшп, 1995]. Динамические характеристики поведения эритроцитов оценивали с помощью фильтрационного теста и методом вискозиметрии.
Деформабельностъ эритроцитов исследовали методом фильтрации и вискозиметрии. Для изучения методом фильтрации эритроциты крови отмывались в трис-HCL буфере троекратно методом центрифугирования. Затем готовились 2% эритроцитарные суспензии на физиологическом буфере. Взвесь в объеме 10 мл помещалась в фильтрационную установку с поддержанием отрицательного давления 15 см водного столба. Измерялось время прохождения взвеси через фильтр Millipore с диаметром пор 5 микрометров. Рассчитывалась средняя скорость фильтрации, которая выражалась в мл/мин. Оценка деформабильности эритроцитов вискозиметрическим методом проводилась при стандартизированном гематокрите 45% трехкратно. Эритроциты отмывали путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге ОПН-3. После отмывки и удаления супернатанта, 380 мкл эритро-цитарной взвеси ресуспендировали добавлением 460 мкл трис-НО буфера (рН 7,4). Вязкость взвеси эритроцитов измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2 (Россия) при скоростях сдвига 300, 30, 3 с"1.
Величина кислотного гемолиза эритроцитов оценивалась по снижению оптической плотности эритроцитов вследствие их гемолиза [Викулов и др., 2001] на лазерном анализаторе агрегации (модель 220 LA, НПФ "Биола", Россия), что позволило оценить кинетику и динамику процесса. Для исследования, трижды отмытые в трис-НС1 буфере (рН 7,4) эритроциты образца крови в количестве 0,01 мл ресуспендировали в 5мл этого же буфера. В качестве стандартного индуктора гемолиза использовалась 0,01н соляная кислота.
Для определения кислотной резистентности эритроцитов в кювету прибора последовательно вносили 290 мкл суспензии эритроцитов и магнитную мешалку. Кювету вставляли в термостатируемую ячейку и устанавливали скорость вращения мешалки на 800 об/мин. На 10 секунде после включения записи в кювету добавляли 10 мкл 0,01н раствора соляной кислоты. Кислотную резистентность эритроцитов оценивали по времени достижения половины величины максимальной амплитуды эритрограммы (Ті/2 гемолиза).
Вязкость плазмы определяли на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия) [Муравьев и др., 1998]. Использовали бедную тромбоцитами плазму, полученную при центрифугировании изучаемых образцов цитратной крови при 3000 об/мин в течение 15 минут. В ходе эксперимента в кювету вискозиметра вносили 0,84 мл плазмы, инкубировали при температуре 37С в течение 10 минут. После инкубации измеряли вязкость плазмы при скорости сдвига 300 с"1.
Агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA, НПФ "Биола", Россия) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и соавторов (1989). В качестве индуктора агрегации использовался 5 мкМ АДФ. Метод основан на регистрации степени изменений светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами, при добавлении к ней веществ, индуцирующих агрегацию, в условиях постоянного перемешивания, а также на анализе флюктуации светопропускания, вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале. Исследования проводили на богатой тромбоцитами плазме.
Для этого цитратную кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут на MultiCentrifuge CM 6М (Elmi, Латвия). Бедную тромбоцитами плазму, необходимую для колибровки, получали центрифугированием обогащенной тромбоцитами плазмы при 3000 об/мин в течение 15 минут. Оценивалась спонтанная и индуцируемая 5 мкМ АДФ и агрегация. В ходе эксперимента в кювету агрегометра вносили 0,3 мл плазмы, инкубировали при температуре 37С в течение 2 минут. После инкубации на 10 секунде добавляли индуктор агрегации динатриевую соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) (фирмы «Reanal», Венгрия) в конечной концентрации 5 мкМ. При графической регистрации процесса агрегации кровяных пластинок (в течение пяти минут) получали кривые, отражающие падение оптической плотности обогащенной тромбоцитами плазмы. Интенсивность агрегации оценивали по индексу агрегации тромбоцитов с использованием компьютерного обеспечения «Aggr 2.44.R (НПФ Биола, Москва).
Действие на выраженность и динамику наркотического действия этанола
Таким образом, в ходе исследований было установлено, что у старых контрольных крыс с дефицитом витамина Е отмечался комплекс нарушений гемо-реологических параметров и показателей свертывания крови.
Это выражалось в повышенной вязкости крови, особенно при высоких скоростях сдвига, что сопровождалось нарушениями деформабельности эритроцитов, повышением вязкости плазмы, уменьшением ИДК и снижением устойчивости эритроцитов к гемолизу. Кроме того, отмечалась повышенная агрегация тромбоцитов. При этом происходило снижение таких показателей свертывающей системы как ТВ и АПТВ.
Композиция на основе комплекса природных флавоноидов приводила к снижению вязкости крови при высоких скоростях сдвига по сравнению с контрольными крысами с ускоренным старением и дефицитом витамина Е. При этом комплекс повышал деформабельность эритроцитов, что выражалось в снижении вязкости взвеси отмытых эритроцитов во всем диапазоне скоростей сдвига и увеличении скорости их фильтрации. Также в группе старых крыс, получавших изучаемый комплекс, по сравнению с группой нелеченного контроля наметилась тенденция к увеличению кислотной резистентность эритроцитов и индекса доставки кислорода в ткани. При этом антиоксидантный комплекс по данным параметрам превосходил по действию чистый экстракт гребней винограда, изменения значений которого по отношению к контролю были статистически незначимыми.
Под влиянием изучаемой композиции происходило снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.
Композиция на основе комплекса природных флавоноидов статистически значимо влияла лишь на ТВ, а также нормализовало ПТВ, практически не изменяя остальные показатели коагуляционного звена гемостаза.
Проведенное исследование показало достоверное снижение содержания триглицеридов на 58,33% в плазме крови у старых крыс по отношению к контрольным молодым крысам (Таблица 16). Также в этой группе произошло статистически значимое снижение содержания фракции липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме крови на 34,9% (р 0.05). При этом, общая концентрация холестерина в плазме увеличилась в 2 раза. При расчете уровня липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) было выявлено достоверное их повышение в 6 раз у старых животных, не получавших композицию (Рис. 10 А).
Композиция на основе комплекса природных флавоноидов при перораль-ном введении не оказала значимого влияния на содержание триглицеридов в плазме крови (по сравнению со старыми нелеченными крысами произошло недостоверное увеличение на 17,3%). При этом в группе с изучаемой композицией наблюдалось достоверное повышение фракции липопротеидов высокой плотности на 34,9 % по сравнению с нелеченным старым контролем, а также некоторое снижение уровня холестерина (Рис. 10 Б). В целом это привело к улучшению показателей ЛПНП в группе старых леченных крыс.
Чистый экстракт гребней винограда при курсовом введении по отношению к старому контролю способствовал дальнейшему достоверному снижению концентрации триглицеридов на 57,515%. По остальным параметрам препарат сравнения уступал по действию комплексу.
Индекс атерогенности как показатель, характеризующий соотношение ате-рогенных и антиатерогенных фракций липидов в группе старых нелечениых крыс увеличился в 6,5 раза (Рис. 10 В). В группе крыс, принимавших комплекс, индекс атерогенности снизился на 81,8% по сравнению со старым контролем. Препарат сравнения по своему антиатерогенному действию уступал комплексу, статистически значимо снижая ИА на 74,9% по сравнению со старым контролем.
![Эффективность применения препаратов на основе плацентарного комплекса для коррекции функциональных нарушений зрительной системы у лиц с нормальным зрительным статусом [Электронный ресурс]](/i/i/4266/212988.png "Эффективность применения препаратов на основе плацентарного комплекса для коррекции функциональных нарушений зрительной системы у лиц с нормальным зрительным статусом [Электронный ресурс] Бугаенко Игорь Алексеевич")