Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из основных направлений лечения сепсиса является інтибактериальная терапия. В 40-е годы на 60 тысяч обшехирургических больных іастота развития сепсиса составляла 0,6%, по секционным материалам достигала 1,5% -12%, а в период Второй мировой войны - 22,1% (С.С. Гирголаев, 1951, И.В. Давыдовский, 1956). Применение антибактериальных препаратов позволило в іервьіе годы снизить частоту развития септических состояний до 2,1%, однако иирокое и нерациональное их использование обусловило появление штибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, что вновь привело к увеличению частоты возникновения сепсиса до 3,4% (А.А. Балябин, 1986, B.C. ^альченко, 1988).
Серьезной проблемой стало возникновение внутрибольничного сепсиса зследствие оперативных вмешательств, реанимационных мероприятий, сложных інагностических и лечебных процедур. В последние годы отмечено повышение частоты случаев токсико-септических состояний, например, в больницах США эна повысилась на 139% (Marik Р.Е. et al., 1995).
Установлено, что сепсис - это двухфазный иммунный процесс: после гипервоспалительного ответа с избыточной продукцией фактора некроза опухоли [ФИО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1) следует гиповоспалительная фаза, которая ассоциируется с иммунной недостаточностью («иммунопараличем») /Volk H.-D. st al., 1996/. При бактериемии нередко происходит инфицирование почки с отсроченным (спустя несколько недель) появлением в ней гнойного очага. Последний при интенсивной антибактериальной терапии может подвергаться обратному развитию, но не ликвидируется полностью, и при снижении иммунореактивности организма может вновь возникнуть септицемия или даже септикопиемия. Бактериальные поражения почек возникают и восходящим путем. При этом патологический процесс может ограничиться бактериальной инвазией клеток эпителия и близлежащих тканей, однако в ряде случаев наблюдается проникновение бактерий в лимфо- и кровоток с развитием генерализованной инфекции и формированием метастатических очагов. При этом судьба микроорганизма зависит от его устойчивости к действию неспецифических и специфических гуморальных и клеточных бактерицидных систем хозяина (Карлов В.А., 1986). В связи с ростом удельного веса пиелонефритов и снижением эффективности монотерапии антибиотиками, все более важным становится терапевтические подходы, направленные на стимуляцию собственных иммунных процессов организма. Актуальной и востребованной представляется работа, направленная на разработку средств и методов терапии сепсиса, основанных на снижении избыточной продукции провоспалительных цитокинов в гнпервоспалительную фазу септического процесса и реактивации
неспецифических и специфических звеньев иммунитета в фа «иммунопаралича».
Одной из наиболее перспективных групп иммуномодуляторов являют
производные мурамилдипептида (МДП) - компонента бактериальной стенки ря
бактерий (Chedid L., 1986). Несмотря на то, что синтезировано болыи
количество дериватов МДП, лишь некоторые из них нашли клиническ
применение или находятся на разных стадиях клинических испытаний. Среди н
можно отметить отечественный препарат Ликопид, представляющий собой '.
ацетилглюкозаминил-МДП (Пинегин Б.В. и соавт., 1997), хорої
зарекомендовавший себя в лечении заболеваний, связанных с вторнчн иммунной недостаточностью.
Ранее в эксперименте показана способность Р-гептилгликозид-MjE существенно снижать летальность животных на моделях септикотоксемі вызванной Salmonella typhi (Калюжян О.В. и соавт., 1999). Однако механизмы, счет которых этот гликопептид стимулирует резистентность организма условиях септических моделей, до конца не ясны. Кроме того, представляет актуальным исследование профилактической и терапевтической активности гептилгликозид-МДП при экспериментальном сепсисе, вызванном другш грамотрицательными и грамположительными бактериями. Рациональнь выглядит изучение эффективности Р-гептилгликозид-МДП на септическ моделях с использованием возбудителей, характерных для гематогенні поражений почек.
Цель исследования
Целью работы является изучение профилактических и терапевтическ
эффектов Р-гептилгликозид-мурамилдипептида (Глимурида) п;
экспериментальном сепсисе и септических поражениях почек, вызванш различными грамотрицательными и грамположительными бактериями, исследование механизмов реализации этих эффектов.
Задачи исследования
/. Исследовать влияние Глимурида на выживаемость животных экспериментальным сепсисом, вызванным Escherichia coli, Staphylococcus aurei Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa.
-
Исследовать действие Глимурида на бактериальную обсемененное внутренних органов и биологических жидкостей организма животных экспериментальным сепсисом.
-
Исследовать динамику патоморфологических изменений в почечн паренхиме при сепсисе на фоне применения Глимурида.
4. Изучить влияние Глимурида на некоторые показатели иммунитета, ірактеризуюшие основные звенья противоинфекционного иммунного ответа при ссперименталыюм сепсисе.
Научная новизна работы
Впервые изучена профилактическая и терапевтическая активность эигинального деривата мурамилдипептида - р-гептилгликозид-урамилдипептида (Глимурида) при экспериментальном сепсисе, вызванном ззбудителями, характерными для инфекционных заболеваний почек (. coli, S. itreus, P. vulgaris, К. pneumoniae, P. aeruginosa).
При этом помимо таких интегральных показателей, как выживаемость и родолжительность жизни, большое внимание уделено исследованию актериальной обсеменности внутренних органов и тканей, динамики атоморфологических изменений в почечной паренхиме и иммунологических цвигов на всех этапах развития сепсиса.
Описано новое направление применения иммуномодуляторов-урамилпептидов в профилактике и комплексной терапии сепсиса.
Впервые разрабатывается схема комбинированного лечения сепсиса и гматогенных заболеваний мочеполовой системы (МПС) с применением нтибактериальных препаратов и иммуномодулятора Глимурида.
Теоретическая и практическая ценность исследования
Большое теоретическое значение имеет определение принципиальной озможности и целесообразности применения иммуномодуляторов-урамилпептидов в профилактике и лечении сепсиса, вызванного различными рамотрицатедьными и грамположительными бактериями, и септических сражений почек.
Научный интерес представляют данные по патоморфологическим зменениям в почечной паренхиме и динамике иммунологических расстройств в азвитии сепсиса.
Практическая значимость работы заключается в том, что настоящее сследование является серьезным шагом в расширении сферы применения іурамилпептидов.
Положения выносимые на защиту
Профилактическое и терапевтическое применение р-гептилгликозид-МДП существенно улучшает показатели выживаемости и продолжительности жизни животных при экспериментальном сепсисе, вызванным Б. coli, S. aureus, P. vulgaris, К. pneumoniae, P. aeruginosa.
Глимурид снижает бактериальную обсемененность внутренних органов і биологических жидкостей при сепсисе.
Глимурид снижает выраженность воспалительных изменений в почечноі паренхиме при сепсисе и ускоряет их разрешение.
Производные МДП оказывают значительный модулирующий эффект н; концентрацию противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови і активность макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов npi экспериментальном сепсисе.
Апробация диссертации
Материалы диссертации представлены на: 2-ом Съезде иммунологов Россиі (Сочи, 1999), 3-ем международной конференции по восстановительной медицині (Московская область, Одинцовский район, поселок санатория им. Герцена Ml УДП РФ, 2000), конференция, посвященная 120-летию 29-ой городскоі клинической больницы (Москва, 2000), 2-ой Российской конференции молоды: ученых (Москва, 2001), научной конференции по актуальным вопроса» инфекционной патологии (Нальчик, 2001).
Структура диссертации
Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы описания материалов и методов исследования, результаты собственны: исследований, заключение, выводы и список литературы. В начале работь приводится список используемых сокращений. Диссертация написана на русскои
языке на страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицами
3 схемами, 42 рисунками. Указатель литературы содержит источника, в ток
числе отечественных и иностранных автора.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Эксперименты проводились на базе лаборатории непарентеральных методо: иммунизации ЦНИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН і лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ Морфологи] человека РАМН.
Глимурид (Р-гептилгликозид-мурамилдипептид) синтезирован на кафедре рганической химии Симферопольского государственного университета октором химических наук, профессором кафедры А.Е. Земляковым (А.Е. емляков, В.Я. Чирва 1987).
В опытах использовали мышей С57В1/6 и F) (СВАхС57В1/6) (Центральный итомник экспериментальных животных, отделение «Крюково») обоего пола ассой 14 - 16 г. Животных содержали в условиях вивария ЦНИИ Вакцин и ывороток им. И.И. Мечникова РАМН и НИИ Морфологии человека РАМН.
Выбор антибактериальных средств основывался на результатах определения увствительности к ним используемых в работе микроорганизмов и литературных анных. Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам пределяли диско-диффузионным методом, для этого использовали бумажные иски производства bioMerieux (Франция), включающие в себя: гентамицин, оксициклин, эритромицин, офлоксацин, цефотаксим. При зоне задержки роста іикроорганизмов вокруг диска с антибиотиком до 10 мм штамм считали стойчивым, 11-15 мм - малочувствительным, более 15 мм - чувствительным.
В серии предварительных экспериментов были отобраны следующие нтибиотики: гентамицина сульфат («Мосхимфампрепараты», Россия) для S. ureus, Е. coli, цефотаксим («LEK», Словения) для P. vulgaris К. pneumoniae, Р. eruginosa.
Для моделирования сепсиса внутрибрюшннно вводили штамы К. pneumoniae К16; P. aeruginosa - № 1677 (6-ой серотип); P. vulgaris - ЛЬ 177; S. aurp.us - № 7; Е. coli - К87. При изучении показателей выживаемости и продолжительности :изни использовали минимальные дозы возбудителя, вызывающие 100% - гибель сивотных (107 микробных тел для К. pneumoniae и 108 для P. aeruginosa, Р. ulgaris, Е. coli и S. aureus), при исследовании обсемененности и ммунологических показателей - сублетальные дозы (104 микробных тел для К. neumoniae и 105 для P. aeruginosa, P. vulgaris, Е. coli и S. aureus).
р-гептилгликозид-МДП и антибиотики разводили в 0,9%-раствора хлорида атрия. Р-гептилгликозид-МДП вводили per os ежедневно в дозе 1 мг/кг. ентамицин вводили внутримышечно (в/м) ежедневно в дозе 50 мг/кг, ефатоксим - 500 мг/кг.
Все препараты применяли в течение 5 дней, начиная со дня заражения. Іервая группа экспериментальных животных получала Р-гептилгликозид-МДП и 00 мкл 0,9%-раствора хлорида натрия в/м, вторая - антибиотик и 100 мкл 0,9%-аствора хлорида натрия per os, третья - комбинацию иммуномодулятора и нтибиотика. Мыши контрольной группы получали ежедневно по 100 мкл 0,9%-аствора хлорида натрия per о.ч и в/м.
Для определения обсемененности внутренних органов животных вскрывали а 2-й день после заражения сублетальной дозой. На чашки Петри с МЛА делали ысевы из крови и внутренних органов: печени, селезенки, почек и мочевого узыря. Рассчитывали индекс обсемененности (ИО) - отношение положительных
проб высева микроорганизмов ко всем проводимым пробам посева из различи! органов и тканей.
Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов делали мазок предметном стекле, высушивали его и фиксировали 10 минут в метаноле. Окрас мазков производили по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали процент активі фагоцитирующих клеток - фагоцитарное число (ФЧ) и среднее чис. поглощенных микробов на один макрофаг - фагоцитарный индекс (ФИ).
Изучение влияния Глимурида на митоген-индуцированную пролифераш лимфоцитов проводили, используя метод, описанный Stromberg et al. (198( Пролиферативную активность оценивали с помощью индекса пролифераш (ИП), вычисленного по формуле: ИП = А:В, где А и В - включение Нз-тимиди (имп/мин) в пробах с митогеном (липополисахарид или конканавалин А) и Є него соответственно.
Продукцию ФИО и ИЛ-1 индуцировали по методу методу, описанної Lovett et al. (1986). Тестирование ИЛ-1 проводили по методу Uede et al. (1986; использованием в качестве индикаторных клеток тимоцитов мышей С57В1, Активность ФИО определяли по лизису ФНО-чувствительных клеток L-929 (Fi and Gifford, 1983).
Полученные данные подвергалиси статистической обработке использованием параметрических и непараметрических методов. Достоверное различий между двумя независимыми количественными показателями п] нормальной распределенной совокупности оценивали, используя двусторонні вариант критерия Стьюдента. Анализ повторных изменений (например, сравнен признаков, установленных до и после лечения) проводили вычислением парно критерия Стьюдента или критерия Вилкоксона в зависимости от ви. распределения. Для выявления различий между группами по выделеннь качественным признакам использовали точный критерий Фишера. Статмстичесі значимыми считали различия при р<0,05.
