Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Теоретические основы изомерии, оптической активности 8
1.2. Взаимосвязь стереохимии с эффективностью и безопасностью лекарственных средств 17
1.2.1. Фармакокинетические различия в действии оптических изомеров различных лекарственных средств 21
1.2.2. Фармакокинетические различия в действии оптических изомеров атенолола 26
1.3. Методики анализа изомеров 29
Выводы по главе 40
Глава 2. Материалы и методы , 41
2.1. Материалы, оборудование, реактивы 41
2.2. Объекты анализа, содержащие атенолол 43
2.3. Тактика фармакокинетического исследования 45
2.4. Обработка результатов 48
2.4.1 . Оценка хроматографических параметров 48
2.4.2. Статистическая обработка результатов количественного определения 49
Глава 3. Разработка методики определения изомеров атенолола 51
3.1. Выбор оптимальных условий разделения изомеров атенолола 51
3.2. Приготовление растворов сравнения атенолола 53
3.3. Оценка хроматографических параметров разделения изомеров атенолола на выбранных подвижных фазах 54
3.3.1. Требования к хроматографическим параметрам 54
3.3.2. Оценка хроматографических параметров в выбранных условиях разделения 56
3.4. Разработка методики количественного определения 60
Выводы по главе 66
Глава 4. Определение содержания изомеров атенолола в субстанциях и таблетках 67
4.1. Определение содержания изомеров атенолола разработанной методикой в образцах субстанций 67
4.2. Определение содержания изомеров атенолола и их высвобождение из таблеток различных производителей 72
4.2.1. Изучение высвобождения изомеров атенолола из таблеток различных производителей 72
4.2.2. Изучение соотношения содержания изомеров в зарегистрированных таблетках атенолола разных производителей 75
Выводы по главе 80
Глава 5. Фармакокинетическое исследование изомеров атенолола 81
5.1. Методика определения изомеров атенолола в плазме крови 81
5.2. Анализ фармакокинетических данных 82
5.3. Динамика концентраций R,S- атенолола в плазме крови 83
Выводы по главе 99
Общие выводы 101
Список литературы 102
Приложения 118
- Фармакокинетические различия в действии оптических изомеров различных лекарственных средств
- Оценка хроматографических параметров
- Оценка хроматографических параметров разделения изомеров атенолола на выбранных подвижных фазах
- Изучение высвобождения изомеров атенолола из таблеток различных производителей
Введение к работе
1. Актуальность темы.
Стереохимическая специфичность является одним из важнейших свойств всей живой природы. Известно широкое распространение в живой природе оптически активных органических соединений [1,4]. Оптически активны белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, флавоноиды, аминокислоты, ряд витаминов (например, витамины К, Е, С - макромолекулы построены из асимметричных фрагментов) [34,51,120].
Большая часть ферментов также проявляет стереохимическое действие, при этом они инициируют превращение только одного из нескольких стереоизомерных веществ (субстратов) [3,10]. Сорбенты: крахмал, целлюлоза также стереоспецифичны и сорбируют одни из оптически активных веществ в большей степени, чем другие. Во многих случаях из двух оптически активных форм лекарственных препаратов специфическое фармакологическое действие проявляет лишь одна форма или проявляют обе формы, но с различной активностью. Асимметричные синтезы в живых организмах осуществляется с помощью ферментов, молекулы которых также асимметричны, то есть "асимметрия рождает асимметрию" [12]. Еще в 1860 году Пастер высказал предположение, что асимметрия молекулярного строения образует "четкую границу между живой и неживой природой" [12,29]. Учитывая различное действие отдельных стереоспецифических лекарственных препаратов, возникает необходимость в разделении их на соответствующие изомеры, и затем индивидуальное исследование их фармакологических и токсикологических свойств, установления их чистоты с применением современных способов анализа. Для проведения таких исследований необходимо использовать современные специфические методы анализа (поляриметрию, хроматографию, спектроскопию ЯМР,
электрофорез и др.)- Таким образом, необходимо изучать лекарственные препараты и биологически активные соединения с учетом их оптической активности, что позволит значительно повысить их фармакологическое действие и снизить токсичность. Важно это и для лекарственных веществ, влияющих на сердечно-сосудистую систему — бета-блокаторов (ацебутолол, пропранолол, атенолол, бупранолол, надолол), блокаторов кальциевых каналов (никардипин, верапамил), и для других лекарственных веществ. Всё вышесказанное определило цель и задачи настоящего исследования.
2. Цель планируемого исследования.
Изучить влияние оптической изомерии на фармакокинетику лекарственных средств, на примере атенолола.
3. Задачи исследования.
Разработать методику количественного определения R- и S-энантиомеров атенолола в растворах и плазме крови.
Определить содержание R- и S- атенолола в субстанциях атенолола различных серий.
Определить содержание R- и S- атенолола в таблетках различных производителей.
Изучить высвобождение R- и S- атенолола из таблеток различных производителей в условиях in vitro.
5. Изучить фармакокинетику R- и S- атенолола у здоровых
добровольцев после однократного перорального приема.
4. Научная новизна.
Разработана методика идентификации, разделения и количественного определения изомеров атенолола методом ВЭЖХ в растворах и плазме крови.
Впервые изучены особенности фармакокинетики изомеров атенолола после однократного перорального приема препаратов атенолола различных производителей.
Впервые изучено соотношение изомеров атенолола в субстанциях и препаратах разных производителей.
Определена динамика высвобождения R- и S- атенолола из таблеток в условиях in vitro.
5. Практическая значимость.
Полученные результаты показывают необходимость определения R- и S- изомеров в препаратах атенолола, при стандартизации и проведении фармакокинетических исследований.
6. Личный вклад соискателя.
Автором лично разработана методика количественного определения энантиомеров атенолола в растворах и плазме крови методом ВЭЖХ, определено содержание R- и S- атенолола в субстанциях и таблетках атенолола различных производителей, изучено высвобождение R- и S-изомера атенолола в условиях in vitro, изучена фармакокинетика изомеров атенолола у пациентов после однократного перорального приема, проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов.
7. Апробация работы.
Апробация работы проведена на кафедре фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова 15 сентября 2008 года.
Основные результаты работы доложены на XV-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008г.), восьмом конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007г.), конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2008г.).
8. Связь задач исследования с проблемным планом.
Диссертационная работа выполнена на кафедре фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова в соответствии с плановой темой «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (номер государственной регистрации -01.200.110545).
9. Публикации по работе.
По результатам проведенных исследований опубликовано 5 печатных работ, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Фармакокинетические различия в действии оптических изомеров различных лекарственных средств
Существуют лекарственные средства, которые могут выборочно замедлять процесс метаболизма у одного из изомеров. Это может также приводить к возникновению побочных эффектов и изменению мощности воздействия фармакологического препарата. Например, антикоагулянт варфарин: ряд противовоспалительных средств замедляет метаболические процессы только «левой» формы, поэтому в плазме повышается концентрация именно L-варфарина [1,29].
Известны факты, когда применялись лекарства, в составе которых один из хиральных изомеров оказывал мощное токсическое действие на организм: трагически известный L-изомер талидомида обладает транквилизирующим действием, помогает беременным справиться с тошнотой, а его «правый» коварный двойник несет угрозу мутаций, уродств их младенцам [4].
То же самое можно сказать и о морфине. Это вещество, добытое из природного сырья, является «левым» изомером и оказывает, как известно, сильнейшее обезболивающее действие. Когда же был получен синтетический морфин, оказавшийся «правым», то ученые столкнулись с тем, что он не имеет вообще обезболивающих свойств [1,4,72].
Правило «левой руки» оказалось верным и для вещества допамин, способного защитить человека от болезни Паркинсона. Допамин должен поступать в организм только с «левыми» молекулами (препарат Леводопа). Подобная картина наблюдалась и при производстве синтетических гормонов: производителям гормональных противозачаточных средств приходилось включать в свои препараты большие дозы гормонов. Причина та же — в них содержались обе формы хиральных изомеров, а функцию выполнял только один [18,68].
Разное фармакологическое действие изомеров одного и того же вещества встречается и в различных лекарственных средствах растительного происхождения. Например, алкалоид коры хинного дерева (Cinchona succirubra Pav., Cinchona ledgeriana Moens.) сем. мареновых (Rubiaceae) хинин, обладает противомалярийным действием, а его правовращающий изомер хинидин, проявляет антиаритмические свойства [13].
Начиная с 70-х и до конца 80-х годов XX века, во многом благодаря исследованиям лауреата Нобелевской премии Дж. Блэка, «золотым стандартом» секретолитической терапии признавались Н2-гистаминовые блокаторы. О высокой степени востребованности и относительной безопасности этих средств свидетельствует опыт их многолетнего использования, несмотря на ограниченность Н2-гистаминовых блокаторов и возможности контроля желудочной кислотопродукции. Так, фамотидин ингибирует базальную желудочную кислотопродукцию не более чем на 80-85% и не обеспечивает ее адекватный контроль в течение суток [14]. Данное обстоятельство вызвало к жизни разработку принципиально нового класса препаратов ингибиторов протоной помпы (ИНН) - антисекреторных средств из группы замещенных бензимидазолов, обладающих высокой эффективностью и избирательностью действия. На сегодняшний день, основываясь на принципах доказательной медицины можно со всей уверенностью утверждать, что эффективность ИНН достоверно выше по сравнению с блокаторами Н2-гистаминовых рецепторов (Bardhan К. et al, 1991, данные метаанализа Chiba N. et al., 1997). В последние годы в связи с насущной необходимостью использования ингибиторов желудочной секреции, обладающих максимальным антисекреторным эффектом при практическом отсутствии побочных эффектов был создан новый препарат эзомепразол (Нексиум), представляющий собой S-изомер (левовращающии) омепразола. Это первый представитель нового класса секретолитиков, синтезированный в виде оптического моноизомера омепразола. В отличие от омепразола, представляющего рацемическую смесь S- и R- оптических изомеров, эзомепразол содержит только S-изомеры, что позволяет ему в меньшей степени зависеть от цитохрома Р-450 и преодолевать основной недостаток других ИПП - вариабельность метаболизма и более предсказуемо и стабильно ингибировать секрецию НО в желудке [29]. По сравнению с омепразолом у эзомепразола более быстрый, выраженный и продолжительный антисекреторный эффект. Фармакологические свойства препарата позволяют использовать и более низкие дозировки (по 20 мг 2 раза в неделю). Последнее очень важно при длительной поддерживающей и противорецидивной терапии больных хроническим дуоденитом [1,28].
Помимо малой эффективности, рацемические препараты могли оказывать серьезные побочные действия на печень, вынужденную справляться с обеими формами изомера, а также на другие органы. Кроме того, серьезность проблемы заключалась еще и в том, что до определенного момента было неизвестно влияние «двойников» на гены человека. А после драматической ситуации с талидомидом, когда было доказано токсическое воздействие на гены еще не рожденного ребенка, ситуация с препаратами, содержащими обе формы хиральных изомеров, еще более накалилась [4].
Исключение составляют препараты, которые имеют в своём составе изомеры, дополняющие эффект каждого из них. Так, например, препарат соталол, объединяющий свойства ААП (антиаритмических препаратов) II и III класса, представляющий собой смесь право- и левовращающего стереоизомеров. На 60% соталол состоит из левовращающего изомера (L-соталол), который наполовину является бета-адреноблокотором, а наполовину увеличивает продолжительность потенциала действия кардиомиоцитов. Оставшиеся 40% соталола — это правовращающий изомер (D-соталол), полностью обладающий свойствами ААП III класса. Таким образом, смесь двух изомеров (Б,Ь-соталол), которую и называют соталолом, на 30% обладает бета-адреноблокирующей активностью (II класс ААП), а на 70% увеличивает продолжительность потенциала действия кардиомиоцитов (III класс антиаритмиков) [40,64,69,122,142].
К таким препаратам относится и опиоидный анальгетик трамадол, который оказывает выраженное анальгезирующее действие, обусловленное агонистическим влиянием на опиоидные рецепторы в ЦНС. Трамадол является синтетическим опиоидом, представляет собой рацемат (R) и (S) изомеров, которые различным способом участвуют в анальгезирующем действии. Изомер (R) является чистым агонистом опиоидных рецепторов, изомер (S) угнетает нейрональный захват норадреналина, активирует центральную нисходящую норадренергическую систему, что нарушает передачу болевых импульсов в желатиновую субстанцию спинного мозга, оба изомера действуют синергически, вызывая седативный эффект [10,12,31].
Аналогичное сочетание обнаружено, например, у бета-блокатора небиволола. R-изомер блокирует бета-адренергические рецепторы, в то время как S-изомер расширяет кровеносные сосуды. Вместе изомеры вызывают эффективное понижение артериального давления [11,21,55,70,74,135,136].
Оценка хроматографических параметров
Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI [11,44]. При статистической обработке оценивались следующие параметры: 2 .
Обработка экспериментально полученных фармакокинетических кривых производилась с помощью программы «Kinetika 2000». Данный метод позволяет дать обобщённую характеристику фармакокинетических процессов без применения структурных моделей путем оценки интегральных параметров, относящихся ко всему организму в целом и не зависящих от типа и структуры модели. Анализ изменения фармакокинетических параметров изомеров атенолола проводился с помощью однофакторного дисперсионного анализа и t-теста Стьюдента при доверительной вероятности 95%.
Современные хиральные неподвижные фазы на основе силикагеля обладают эффективностью порядка 30-80 тыс.т.т./м по оптически неактивным тестовым соединениям. По изомерам достигаемая эффективность всегда меньше предельной, поскольку многоточечное взаимодействие адсорбента с хиральными адсорбатами, необходимое для их дискриминации (распознавании), всегда приводит к ухудшению кинетики массообмена, и, следовательно, эффективности.
Хиральная колонка ChiraDex При выборе аналитической длины волны УФ - детектора, анализировали максимумы поглощения в УФ - спектре атенолола [ВР,2007]. Согласно Британской Фармакопее (2007) ультрафиолетовый спектр поглощения раствора препарата в области от 230 нм до 350 нм должен иметь максимумы при длинах волн (275 + 2) нм и (282 + 2) нм.
Полученные нами спектры поглощения атенолола в УФ-области, подтвердили наличие максимумов поглощения при 255 нм и 285 нм. Учитывая максимальный коэффициент молярной экстинкции, нами была выбрана длина волны 282 нм.
При выборе скорости потока, руководствовались наиболее оптимальными скоростями, согласно уравнению Ван-Деемптера, для аналитической колонки с внутренним диаметром 4 мм, и размером частиц 5 мкм. То есть, скорость потока составляла 0,7 мл/мин (при оптимальном давлении 120 атм.). Объем введения при оптимальной чувствительности -50 мкл.
С целью воспроизводимости времен удерживания, аналитическую колонку термостатировали при температуре 20 С.
Органическим компонентом подвижной фазы был выбран ацетонитрил, который по сравнению с другим часто применяемым растворителем - метанолом, имеет ряд преимуществ: более высокая температура кипения и меньшая вязкость. Ацетонитрил также характеризуется меньшим значением предела прозрачности в УФ - свете по сравнению с метанолом - 195 нм против 205 нм.
Было исследовано влияние ПФ различного состава на хроматографические характеристики разделения изомеров атенолола. При этом отношение ацетонитрила и водного компонента в элюентах, позволивших добиться приемлемых параметров разделения, составляло от 5:95 до 15:85, соответственно. Нами было исследовано несколько вариантов подвижных фаз. Состав изучаемых подвижных фаз представлен в таблице 9.
Оценка хроматографических параметров разделения изомеров атенолола на выбранных подвижных фазах
В данном исследовании ориентировались на требования к хроматографической системе, представленные в таблице 10. Однако для повышения точности и воспроизводимости анализа стремились к достижению более высоких показателей. ЕР и USP определяют минимальные требования к эффективности для каждого лекарственного средства в отдельности. Для атенолола в зависимости от состава подвижной фазы и анализируемого соединения этот параметр должен быть минимально 500-2500 т.т.
В данной работе мы придерживались той позиции, что при разработке методик анализа в биологических объектах, для лучшего разделения аналита и сопутствующих компонентов, следует придерживаться больших значений эффективности. При этом достижение числа теоретических тарелок 4000 т.т и более является предпочтительным, поскольку это позволяет добиться лучшей селективности и значительно снизить ложноположительные результаты.
Фармакопейные требования к параметрам пригодности при анализе атенолола методом ВЭЖХ (таблица 10) демонстрируют средние значения фактора симметрии от 0,8 до 2 [ЕР]. Относительное стандартное отклонение имеет первостепенное значение при количественном определении лекарственных средств. Для основных веществ при количественном анализе лекарственных форм в биожидкостях относительное стандартное отклонение варьирует в зависимости от метода RSD 5-15 %. Требуемое количество последовательных хроматограмм от 3 до 6. В ЕР за предел детектирования принимают отношение сигнал/шум не менее 3, за предел количественного определения отношение сигнал/шум не менее 10. Однако на такие значения можно ориентироваться только при практически полном отсутствии колебаний базовой линии. В реальных условиях необходимо готовить растворы с такими концентрациями, чтобы отношение сигнал/шум было выше минимальных требований. Разработанная методика разделения изомеров атенолола методом ВЭЖХ подразумевает использование ПФ с соотношением водного и органического компонентов (15:85). На практике при использовании двух насосов это часто приводит к колебанию базовой линии в пределах 0,001 (по шкале оптической плотности при использовании УФ - детектора), что соответствует отношению S/N 15: 1. Эти колебания приемлемы, но при анализе разбавленных растворов увеличивается ошибка при определении действующих веществ.
Поэтому в настоящей работе при разработке методик количественного определения ориентировались на отношение S/N, равное 10. Аналитическая область методики (концентрация раствора). Для оценки аналитической области (линейности) готовили растворы с концентрациями от 0,1 до 1000 мкг/мл. Количественное определение изомеров атенолола проводили методом ВЭЖХ с использованием хроматографического комплекса фирмы «Shimadzu» (Япония). Пробы готовили непосредственно перед анализом. Разделение проводили на колонке ChiraDex (250мм L 4,5мм ID) при температуре колонки 20С. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и буферного раствора в соотношении 27:1 (об/об) с добавлением натриевой соли гексансульфоната (буферный раствор содержал 190 мл дигидрофосфата калия рН 4,9).
Скорость потока составляла 0,7 мл/мин, детектирование проводили при длине волны 282 нм. Калибровочный график атенолола линеен в диапазоне концентраций от 10 до 250 мкг/мл. Минимальная определяемая концентрация - 0,1 мкг/мл. Относительная погрешность определения атенолола при его концентрации от 10 до 100 мг/мл составляет 3,8 %; при концентрации от 100 до 250 мкг/мл - 2,5 %.
Согласно литературным данным [94,106] для анализа изомеров наилучшее разделение (а =1.30) происходит при использовании подвижной фазы, содержащей n-гексан/ этанол/ диэтиламин = 80/20/0,6, но в ходе проведения эксперимента данная подвижная фаза была мало эффективна.
Условия хроматографирования: Колонка: ChiraDex (250мм L 4,5мм ID) с хиральным селектором Р-циклодекстрином; Детектор: Флуориметрическая детекция (Азх = 270 нм, Хэм = 300 нм); Ультрафиолетовая детекция (X = 282 нм); Скорость: 0,7 мл/мин; Время регистрации хроматограммы — 30 минут; Объём вводимой пробы: 10 мкл.
В ходе предварительных испытаний нами было исследовано несколько вариантов подвижных фаз. Хроматографические параметры разделения изомеров атенолола представлены в таблицах 11,12. На рисунке 13 представлена хроматограмма изомеров R,S - атенолола, полученная при УФ - детектировании - длина волны 282 нм. Рисунок 13. Хроматограмма стандартов изомеров R,S - атенолола (УФ- детектор). Справа налево: R- атенолол, S- атенолол. В связи с тем, что препарат удалось разделить с помощью флуориметрического и ультрафиолетового детекторов, решено было отказаться от флуориметрического дектора, учитывая большую распространённость УФ — детектора.
Изучение высвобождения изомеров атенолола из таблеток различных производителей
Среда растворения: вода. На анализ были отобраны коммерчески доступные образцы таблеток атенолола, с заявленным содержанием активного вещества 50 мг, следующих фирм: Pliva Hrvatska d.o.o., Хорватия; Ratiofarm GmbH, Германия; Nycomed Danmark AS, Дания; Синтез АКО, Россия; Оболенское фармацевтическое предприятие, Россия; Скопинфарм, Россия. Исследование проводили параллельно на 6 образцах таблеток для каждого препарата. 900 мл воды помещали в каждый сосуд. При достижении температуры воды в сосудах 37,0 ± 0,5С, таблетки, взвешенные на аналитических весах, помещали в сосуд и немедленно начинали вращение аппарата при 75 об/мин. В течение получаса каждые 5 минут отбирали 20 мл раствора из сосуда на расстоянии середины между поверхностью воды и верхней части лопасти и не менее чем 1 см от стенки сосуда. Результаты определения высвобождения R-,S- атенолола из таблеток приведены в таблице 20. Таблица 20 Кинетика высвобождения атенолола из таблеток (п=6)
Как видно из графиков (см. приложение ), кинетика высвобождения R- и S-изомеров атенолола из таблеток достоверно различается, т.е. скорость и степень высвобождения R- и S- атенолола из ЛФ соответствует друг другу и не отличается от производителя к производителю.
Извлечение атенолола из таблеток проводили согласно их нормативным документам по разделу «количественное определение». Взвешивали 10 таблеток Атенолола 50 мг, измельчали и помещали их в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 100 мл подвижной фазы.
Встряхивали раствор в течение 25 минут и подвижной фазой доводили объём до метки. После этого раствор фильтровали через стекловолокнистый фильтр, отбрасывая первые 5 мл фильтрата. 1 мл фильтрата, переносили в мерную колбу вместимостью 20 мл и доводили объем раствора до метки подвижной фазой (раствор А). Хранили раствор в защищенном от света месте. Раствор использовали в течение одного дня.
Из представленных данных следует, что таблетки атенолола содержат как S-, так и R-энантиомеры в различных количествах. В некоторых таблетках атенолола содержание S -энантиомера было значительно меньше R-атенолола (р 0,05). С учетом того, что терапевтическое действие атенолола обусловлено действием левого изомера атенолола, данные таблетки не могут иметь полной терапевтической активности. Выводы по главе
1. Изучены хроматографические характеристики подвижной фазы и проведена оценка пригодности системы. Эффективность составила не менее 5000 т.т., фактор симметрии - не менее 0,9 и не более 1,5. Отношение «сигнал/шум» во всех случаях было не ниже 10.
2. Определено содержание изомеров атенолола разработанной методикой в образцах субстанций различных серий производства ЗАО «Скопинфарм» (41,2 % R — атенолола и 58,8 % S- атенолола) и ЗАО «Фармацевтическое предприятие Оболенское» (40,5 % R- атенолола и 59,5 % S- атенолола).
3. Изучено высвобождение R- и S- атенолола из таблеток в условиях in vitro. Определено, что степень и скорость высвобождения R- и S- атенолола статистически достоверно отличаются у разных производителей.
4. Определено содержание изомеров атенолола разработанной методикой в таблетках производства Pliva Hrvatska d.o.o. (76 % R - атенолола и 24 % S- атенолола), Ratiofarm GmbH (58 % R- атенолола и 42 % S- атенолола), Nycomed Danmark AS (56 % R - атенолола и 44 % S- атенолола), Атенолол - ФПО (75 % R - атенолола и 25 % S- атенолола), Синтез АКО (63 % R - атенолола и 37 % S- атенолола), Скопинфарм (53 % и 47 % соответственно).
Количественное определение изомеров атенолола, в пробах плазмы крови проводили методом ВЭЖХ с использованием хроматографического комплекса фирмы «Shimadzu» (Япония).
К плазме добавляли кислоту для высвобождения атенолола из связи с белками. Установлено, что лучше использовать фосфорную кислоту. Разницы в степени экстракции при использовании плазмы либо сыворотки не обнаружено. В результате эксперимента так же установлено, что исходная рН биопробы - кислая, щелочная или нейтральная - не влияет на выход атенолола.
С целью оценки воспроизводимости метода изучали аналитическую вариацию разработанной методики в серии (в течение 1 лабораторного дня -11 определений) и во времени (в течение 1 месяца - 22 определения). В ходе эксперимента плазма оттаивалась и подвергалась полной процедуре экстракции.
Подготовку проб проводили следующим способом: к 1 мл плазмы прибавляли 1 мл хлороформа, смесь встряхивали на механическом шейкере в течение 1 минуты, затем центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин, отбирали надосадочную жидкость, упаривали, а сухой остаток разбавляли в 150 мкл подвижной фазы. Через 10 минут аликвоту (100 мкл) вводили в хроматограф. Пробы готовили непосредственно перед анализом. Разделение проводили на колонке «ChiraDex» LiChroCART 250-4 при комнатной температуре. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и буферного раствора в соотношении 27:1 (об/об) с добавлением гексансульфоната натрия (буферный раствор содержал 190 мл дигидрофосфата калия рН 4,9).
