Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
Природное нахождение дитерпеновых гликозидов 12
Основные типы дитерпеновых гликозидов 13
Сладкие дитерпеновые гликозиды стевии 13
Рубозозиды 20
Байунозид 20
Структура и химические свойства стевиозида 21
Установление структуры стевиозида 21
Химия стевиола и изостевиола 23
Получение стевиозида и остальных сладких дитерпеновых гликозидов стевии 25
Выделение 25
Синтез стевиозида 29
Модифицированные дитерпеновые гликозиды 30
Химическая модификация 31
Ферментативная модификация 36
Фармакологические свойства дитерпеновых гликозидов 37
Исследование безвредности и биологической активности экстрактов стевии 37
6.2. Фармакодинамические свойства экстракта стевии и стевиозида 40
7. Применение " сладких "дитерпеновых гликозидов 43
III. Результаты и их обсуждение 46
1. Получение сухого очищенного экстракта из листьев стевии 47
2. Разработка методики ТСХ для качественного определения стевиозида и его препаративного вьщеления из сухого очищенного экстракта из листьев стевии ; 52
3. Разработка универсальной методики количественного определения стевиозида в растительном сырье и сухом очищенном экстракте из листьев стевии 58
3.1. Подбор условий хроматографического разделения стевиозида 60
3.2. Выбор длины волны детектирования 63
3.3. Построение градуировочной кривой. Определение предела детектирования стевиозида 64
3.4. Отработка условий экстракции стевиозида из растительного сырья и последующей очистки экстракта 65
3.5. Метрологические характеристики методик анализа 70
4. Контроль качества и стандартизация сухого очищенного экстракта из листьев стевии 71
5. Исследование антивирусного и антибактериального действия сухого очищенного экстракта из листьев стевии 75
IV. Экспериментальная часть 79
1. Получение сухого очищенного экстракта из листьев стевии 82
2. Препаративное выделение стевиозида из сухого очищенного экстракта методом ТСХ 83
3. Качественное определение стевиозида в растительном сырье 85
4. Количественное определение стевиозида в растительном сырье и сухом очищенном экстракте стевии методом ВЭЖХ 86
4.1. Экстракция растительного сырья 86
4.2. Очистка экстракта с помощью метода ТФЭ 86
5. Исследование антивирусного и антибактериального действия сухого очищенного экстракта из листьев
стевии 87
V. Общие выводы 89
VI. Список литературы
- Основные типы дитерпеновых гликозидов
- Получение стевиозида и остальных сладких дитерпеновых гликозидов стевии
- Разработка методики ТСХ для качественного определения стевиозида и его препаративного вьщеления из сухого очищенного экстракта из листьев стевии
- Построение градуировочной кривой. Определение предела детектирования стевиозида
Введение к работе
В настоящее время одной из актуальных и первоочередных проблем отечественного здравоохранения является профилактика и лечение таких широко распространённых и трудно излечимых заболеваний, как диабет и гипогликемия. В связи с этим особое внимание уделяется поиску новых низкокалорийных, интенсивных и безвредных заменителей сахара. Повышенный спрос на низко калорийные напитки и продукты питания, а также высокая стоимость таких традиционных синтетических сахарозаменителей, как сахарин, ацесульфам, аспартам и цикломат стимулируют этот поиск [ 1 - 6 ].
Среди наиболее перспективных и эффективных современных природных подсластителей внимание привлекают сладкие дитерпеновые гликозиды, накапливающиеся в надземной части растения Stevia rebaudiana Bertoni (в дальнейшем -стевия) в достаточно большом количестве - до 20% в пересчёте на сухой вес и обладающие ярко выраженным сладким вкусом, в 250 - 300 раз превышающим сладость сахарозы. Стевия произрастает в основном в северной части Парагвая, а на сегодняшний день культивируется в промышленных масштабах в Бразилии, Израиле, Вьетнаме, Корее, Китае и Японии. В одной только Японии на нужды пищевой промышленности ежегодно тратится около 1700 тонн листьев стевии [ 7 ].
Экстракты стевии, фигурирующие на мировом рынке под названиями «Steviosin», «Stevix», и «Marumillon 50», используются либо индивидуально, либо в композициях с другими средствами для подслащивания напитков и других продуктов питания [ 8 ].
Во многих странах мира - в первую очередь, в Японии, а также Бразилии, Корее, США, Парагвае, Лаосе, Китае, Индонезии, Таиланде и других - стевиозид, основной дитерпеновыи гликозид стевии, используется как подсластитель в широком спектре продуктов питания: винах, безалкогольных напитках, плодово - ягодных сиропах, кондитерских изделиях, при производстве зубной пасты, жевательных резинок и косметических продуктов. Стевиозид нетоксичен, низко калориен, устойчив при температурной обработке (до 120С) и в широком диапазоне значений рН (2 - 10) [9-13]. При условии применения в частных технологиях производства алкогольных и безалкогольных напитков, молочных продуктов, хлебобулочных и кондитерских изделий, а также майонезов, соусов и консервов, стевиозид наилучшим образом подходит для использования в процессах смешивания в слабокислых средах, в процессах высокотемпературной обработки и может быть внесён в рецептуру на любой стадии [ 9 -13].
В последние годы в различных странах проводятся интенсивные исследования терапевтического действия стевиозида при таких распространённых заболеваниях, как гипогликемия и диабет. Обнаружены также и другие лечебные свойства, так, экстракт стевии согласно последним данным проявляет контрацептивную и антивирусную активности [ 1,14].
Растущий интерес к продуктам переработки стевии и появление продуктов питания и пищевых добавок на основе стевиозида на российском рынке обуславливают необходимость разработки эффективных методик контроля их качества с
использованием современных методов анализа. В связи с неординарными органолептическими свойствами и биологической активностью дитерпеновых гликозидов стевии требуется углублённое изучение физико - химических и биологических свойств данных соединений, а также совершенствование методов их выделения из растительного сырья.
Поэтому представляло интерес:
Разработать и оптимизировать универсальные и высокочувствительные методы стандартизации сухого очищенного экстракта стевии;
Совершенствовать способ выделения сухого очищенного экстракта из листьев стевии;
Оценить биологическую активность, в частности антивирусную и бактерицидную, полученного стандартизированного сухого очищенного экстракта стевии;
С этой целью в настоящей работе оптимизированы условия лабораторного получения сухого очищенного экстракта из листьев Stevia rebaudiana Bertoni (Mediplantex, Вьетнам) с содержанием стевиозида 65 - 80%.
Разработана и оптимизирована ТСХ - методика качественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки, позволяющая добиться чувствительности 0,5 мкг стевиозида.
Разработан метод ВЭЖХ для количественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки. Улучшены условия
хроматографического разделения, а также разработан новый способ экстракции растительного сырья и последующей очистки экстракта с использованием метода твердофазной экстракции. Чувствительность методики составляет 1 мкг стевиозида.
Исследованы физико-химические свойства сухого очищенного экстракта из листьев стевии и индивидуального стевиозида (УФ-, ИК - спектры, спектры 13С - ЯМР, удельное вращение), а также общие физико - химические показатели: температура плавления и потеря в массе при высушивании. Полученные данные использованы для стандартизации и контроля качества продукции, содержащей сладкие дитерпеновые гликозиды Stevia rebaudiana Bertoni.
В результате впервые проведённых биологических исследований совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии установлено, что сухой очищенный экстракт, выделенный из листьев Stevia rebaudiana Bertoni, обладает вирусстатическим и вирулицидным действием на ДНК- и РНК-содержащие вирусы, а также бактериостатическим и бактерицидным действием на возбудитель сибирской язвы в споровой форме.
Основные типы дитерпеновых гликозидов
Первый С - 5 интермедиат ( 13 ) синтезируется из пирувата ( 11 ) и D глицеральдегидо - 3 - фосфата ( 12 ) тиаминдифосфат - зависимой синтетазой. Редукто изомераза катализирует перегруппировку углеродной цепи ( 13 ), а также последующее НАДФ - Н - зависимое восстановление полученного альдегида с образованием ( 14 ). Биосинтез дитерпенового скелета начинается с конденсации диметилаллилдифосфата ( 16 ) и трёх молекул изопентенилдифосфата ( 15 ), приводящей к образованию геранилгеранилпирофосфата ( 17 ), в результате циклообразования и перегруппировки которого, образуется каурен ( 18 ), причём превращение ( 17 ) в каурен происходит в хлоропласте. На последующих стадиях происходит окисления каурена ( 18 ) до кауреновой кислоты ( 1 ) Р450 монооксигеназами микросом и гидроксилирование кауреновой кислоты по С - 13 с образованием стевиола (19 ) [ 19 ], [ 20 ].
НАДФ - Н - зависимое гидроксилирование кауреновой кислоты происходит при участии фермента 13 - гидроксилазы, являющейся гомотетрамерным белком с молекулярной массой 160 кДа. Последующее гликозилирование стевиола (19 ) по С - 13 и С - 19 приводит к образованию дитерпеновых гликозидов [ 21 ].
Помимо дитерпеновых гликозидов в листьях стевии содержатся флавоноиды в гликозилированной форме, такие как апигенин (20), а также некоторые лабдановые дитерпеноиды, включая йанол (21), аустроинулин (22) и их ацетаты вместе с несколькими биснордитерпеноидами, стеребинами А - D (23) - (26) и другими лабданами, стеребинами Е - Н (27) - (29) [ 1 ].
Из 154 видов рода Stevia 18 обладают сладким привкусом и содержат лабданы, кл еро даны, каурены, и бейерены [ 22 ]. Например, в Stevia paniculata были обнаружены каурановые гликозиды паникулозиды I - V (30) - (34) [ 1 ], а в корнях Stevia salicifolia найден горький гликозид стевисалиозид А (35) [ 23 ]. (22) (23) R!=R2=H (24 R1=Ac,R2=H (25) R!=H,R2=Ac (2 R = ДО (28) R = OH (29) R = OH і H C02Glc (31) (30) R1 = p-Glc, R2 = H, R3 = p-Glc )2_T 3_, (33) R1 = p-Glc, Rz = RJ = OH (34) R1 = p-Glc, R2 = H, R3 = OH = H CQ2R (35) )H QCHZOH ОН АсО-Л Сд -OAc 2.2. Рубозозиды. Китайское растение Rubus suavissimus (изначально идентифицированное как R. Chingii (Rosaceae)), используемое для приготовления сладких чаев, содержит в качестве основного сладкого компонента рубозозид (36). Содержание рубозозида в листьях доходит до 5% в пересчёте на сухой вес сырья. Также был выделен ряд минорных гликозидов, суавиозидов А - J (37, 38), а их структуры установлены стандартными спектроскопическими методами [ 1 ].
Китайское лекарственное растение Phlomis betonicoides (Labiatae) содержит несколько сладких лабдановых гликозидов, наиболее изученным из которых является байунозид (39). Был осуществлён его полный синтез и проведена оценка органолептических свойств [ 1 ]. 3. Структура и химические свойства стевиозида.
При ферментативном гидролизе стевиозида (2) образуется агликон стевиол (10) и три молекулы глюкозы, тогда как в результате кислотного гидролиза образуется изомер стевиола, изостевиол (36). При щелочном гидролизе стевиозида образуется стевиолбиозид (3). То, что стевиозид практически не обладает восстанавливающей способностью свидетельствует о присоединении одного глюкопиранозного остатка к карбоксильной группе через С - 1. В результате метилирования стевиолбиозида и последующего кислотного гидролиза были получены: метиловый эфир изостевиола, 3,4,6 - три - О - метил - D - глюкоза и 2,3,4,6 - тетра - О - метил - D - глюкоза. Таким образом, в качестве дисахарида в молекуле стевиозида присутствует относительно редкая софороза с 1 - 2 связью. Методом С13 - ЯМР было установлено, что софороза связана с агликоном при помощи /? - гликозидной связи. Химический метод получения стевиола из стевиозида включает периодатное окисление углеводных остатков и щелочной гидролиз. Были выделены два побочных продукта гидролиза стевиозида в виде соответствующих метиловых эфиров (37) и (38) [ 1 ], [ 24 ].
Структура агликона была установлена при помощи деградации стевиола и изостевиола. Дегидрогенирование изостевиола привело к 1,7 - диметилфенантрену. Структура и стереохимия углеродного скелета были установлены в результате деоксигенирования до С - 16 эпимеров [ 1 ], [ 25 ]. N (40) При озонолизе метилового эфира стевиола образовывался формальдегид, а также смесь кетола (39) и соответствующей кето - кислоты (40). Таким образом, было установлено положение гидроксильной группы, несущей остаток софорозы [ 1 ], [ 25 ].
Получение стевиозида и остальных сладких дитерпеновых гликозидов стевии
По мере развития способов переработки стевии как сырьевого продукта, получения экстрактов, выделения из них " сладких " дитерпеновых гликозидов, стевия и её производные нашли широкое применение не только как средство народной медицины, но также как признанный пищевой продукт и доступное лечебно-профилактическое средство.
Столь широкое и разнообразное использование стевии определило необходимость в глубоком изучении её безвредности и фармакологических свойств как в опытах на животных, так и в клинике.
Широкое изучение токсичности, по существу по программам тестирования медицинских лекарственных средств, проведено в отношении экстрактов из различных видов Stevia и отдельных веществ, выделенных из неё.
Острая токсичность. Острую токсичность стевиозида ( 2 ) и стевиола ( 17 ) ( продукта ферментативного гидролиза стевиозида ) исследовали на трёх видах лабораторных животных: мышах, крысах и хомячках [ 45 ]. Вещества вводили однократно внутримышечно, регистрировали симптомы и подсчитывали число погибших животных за период четырнадцати дней после введения, оценивая по тесту LD50 (летальная доза, вызывающая гибель 50 % животных). Стевиозид в высокой дозе 15 г/кг живого веса не вызывал гибель ни мышей, ни крыс, то есть был нетоксичен. При инъекции стевиола LD50 для хомячков составило 5-6 г/кг веса, a LD50 для мышей и крыс - выше 15 г/кг веса.
Гистопатологические данные показали дегенеративные изменения в почках, которые могут быть возможной причиной гибели животных. Экстраполируя эти данные по принятой методике от животных на человека можно прийти к исключительному выводу, что по тесту острая токсичность стевиозид и стевиол относятся к практически нетоксичным веществам.
Хроническая токсичность. Токсичность водных экстрактов стевии изучали на крысах при введении растворов в течение 20,40 и 60 дней по наиболее чувствительному тесту, как указано в работе [ 45 ], почечной функции и среднему артериальному давлению [ 46 ]. Введение животным необработанных водных экстрактов в течение 40 и 60 дней вызывало умеренное понижение артериального давления, диурез и повышенное выделение азота в ненарастающем количестве. По мнению авторов работы [ 46 ] эти результаты свидетельствуют скорее об определённой полезной биологической активности субстанции, чем о сколь - либо существенной токсичности.
Подтверждение безвредности экстрактов стевии, как сахарозаменителя на животных в дозах в 10 и 50 раз превышающих количество сахара в диете, можно найти в работе [ 47 ]. У животных, получавших экстракт стевии, не было найдено заметных отклонений в параметрах метаболитических процессов и морфологической картине внутренних органов.
В опытах на крысах [ 48 ] при содержании в диете стевиозида 0,31; 0,62; 1,25; 2,5; и 5% на протяжении двух лет наблюдений не отмечали: смертности животных, снижения веса, отличий в биохимических и гистопатологических показателях, а также возникновения раковых новообразований. Результаты данной работы свидетельствуют о том, что высокая доза ( 5 % от диеты) стевиозида является нетоксичной.
Канцерогенность и тератогенность. Необходимым условием оценки безвредности того или иного лекарственного средства или пищевого продукта является изучение отдельных последствий его применения, а именно, канцерогенности и тератогенности.
Биохимическим методом в длительных опытах (до трёх лет ) на мышах и крысах установлено отсутствие канцерогенного действия, то есть индуцирования возникновения доброкачественных и злокачественных опухолей [ 46,49, 50, 51 ].
Детальное исследование влияния экстрактов стевии и дитерпеновых гликозидов на течение беременности, плодовитость и повреждение потомства показало полное отсутствие вредоносного действия [ 46, 52 ].
Разработка методики ТСХ для качественного определения стевиозида и его препаративного вьщеления из сухого очищенного экстракта из листьев стевии
Для качественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки был использован метод ТСХ, как наиболее распространённый метод, характеризуемый нормальной чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью. При разработке методики ТСХ было использовано 4 вида систем: хлороформ-метанол-вода (10:5:1), хлороформ-метанол-вода (30:10:1), хлороформ-метанол-вода (30:20:1), бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1). Для обнаружения использовали различные реагенты: 2 % раствор ванилина в метаноле - ортофосфорная кислота (1:1), 50 % раствор серной кислоты, анисовый альдегид - серная кислота -ледяная уксусная кислота (0,5:1:50). Значения Rf для стевиозида в различных системах элюирования приведены в таблице 8. Наилучшие результаты были получены при использовании системы хлороформ-метанол-вода (10:5:1) и 50 % раствора серной кислоты в качестве проявителя. Пятна на хроматограммах испытуемых образцов оценивали в сравнении со стандартным образцом стевиозида (рис.7). Чувствительность методики определения - 0,5 мкг стевиозида.
Разработанный метод ТСХ был использован для препаративного выделения индивидуального стевиозида из сухого очищенного экстракта с целью его дальнейшего использования в работе в качестве рабочего образца. 85% чистота выделенного стевиозида была подтверждена методом ВЭЖХ. Подлинность была подтверждена методом С - ЯМР, а также методом ПМР. При снятии спектра ПМР в качестве эталонного соединения использовали ТМС. Дублет в области 6,0 м.д. и два неразрешённых дублета в области 5.6 м.д. (рис. 8) относятся к аномерным протонам в глюкозных остатках при положениях 19 и 13 стевиозида, соответственно, что согласуется с литературными данными [ 31, 33 ]. На основании полученного спектра можно сделать вывод о присутствии в стевиозиде примеси стевиолбиозида (3), соединения со свободной карбоксильной группой, причём содержание стевиолбиозида находится в пределах 15 - 20%. В связи с неинформативностью спектра ПМР и технически сложной процедурой снятия было решено в дальнейшем использовать метод ЯМР 13С для подтверждения подлинности стевиозида. Отнесение химических сдвигов сигналов в спектре ЯМР С проводили относительно внутреннего стандарта (ТМС) на основании литературных данных [ 63 ]. Для сравнения, в таблице 9 наряду со значениями химических сдвигов сигналов атомов углерода исследуемого стевиозида приведены значения, взятые из литературы.Представленные выше значения химических сдвигов атомов углерода исследуемого стевиозида хорошо согласуются с литературными данными [ 63 ], что подтверждает его подлинность. Незначительные отличия связаны как с погрешностью измерений, так и с тем, что литературные значения были получены на приборе с другой рабочей частотой. Наряду с основными сигналами в спектре присутствуют сигналы атомов углерода стевиолбиозида (3), соединения со свободной карбоксильной группой. Содержание этого соединения составляет не более 15 %. УФ - спектр выделенного индивидуального стевиозида в метаноле (рис. 9) показал наличие максимума поглощения при 206 нм и отсутствие плеча в области 224 - 240 нм, характерного для спектра сухого очищенного экстракта. Снятый в таблетках КВг ИК - спектр (рис 10) содержал полосы поглощения при 3390, 2930, 1730, 1080 см , хорошо согласующиеся с литературными данными [ 24, 25 ]. Также были получены следующие числовые показатели: удельное вращение [а]о 5% раствора в воде составило -31,5, а температура плавления - 198,5 - 199,5 Опубликовано множество методов количественного определения стевиозида, среди которых капиллярный электрофорез [ 64 ], газо - жидкостная хроматография, тонкослойная хроматография с денситометрией, газовая хроматография, противоточная жидкостная хроматография, ИК-спектрометрия [ 1 ]. Также в литературе описывался метод ферментативного определения стевиозида при помощи его последовательного гидролиза рядом ферментов, включая гесперидиназу, глюкозную оксидазу и пероксидазу, и последующего спектрофотометрического измерения концентрации продукта ферментативного гидролиза [65 ]. Однако из-за неспецифичности, громоздкости и больших временных затрат эти методы не приобрели популярность. Более привлекательным методом контроля содержания стевиозида является высокоэффективная жидкостная хроматография благодаря специфичности определения отдельных дитерпеновых гликозидов, а также простоте и надёжности. Множество работ посвящено ВЭЖХ анализу дитерпеновых гликозидов [ 62 ], [ 66 - 69 ]. В работе [ 62 ] описывается разделение 8 дитерпеновых гликозидов на аминофазной колонке, используя линейный градиент подвижной фазы и спектрофотометрическое детектирование. В работе [ 68 ] описывается анализ 4 дитерпеновых гликозидов в продуктах питания на аминофазной колонке со спектрофотометрическим детектированием. Работа [ 69 ] посвящена интересному методу предколоночной дериватизации двух дитерпеновых гликозидов из растительного сырья при помощи их этерификации п-бромфенацилбромидом и их последующему разделению на Сі8 колонке в виде соответствующих эфиров. Однако большинство этих методов обладают плохой воспроизводимостью и требуют больших временных затрат. Кроме того, на стадии экстракции большинство авторов использует органические растворители, что экономически невыгодно, а также требует дальнейшей подготовки образца, поскольку в экстракт помимо целевых веществ переходит множество органических компонентов, препятствующих разделению: жирные кислоты, сесквитерпены, алифатические углеводороды, стероиды и тритерпены.
В рамках данной работы нами были исследованы и усовершенствованны три стадии количественного анализа стевиозида в растительном сырье: экстракция стевиозида из листьев Stevia rebaudiana, очистка экстракта и хроматографическое разделение с помощью обращённо - фазного варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии на аминопропилсиликагеле. Нами показано, что разработанный метод может с успехом применяться для количественного определения стевиозида в сухом очищенном экстракте из листьев стевии, а также в продуктах питания, содержащих листья стевии [ 71 ].
Построение градуировочной кривой. Определение предела детектирования стевиозида
Стевиозид извлекали из высушенных и измельчённых (0,5 мм) образцов растительного сырья (1 г) трёхкратной водной экстракцией при температуре воды 100 С. Объём воды на каждой стадии экстракции составлял 20 мл, а время экстракции - 30 мин. Для экстракции использовали деионизированную воду с удельной проводимостью не более 0,2 мкС см. Экстракты объединяли, охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через бумажный фильтр и доводили их. суммарный объём до 100 мл деионизированной водой.
Колонку для твердофазной экстракции Strata NH2 подсоединяли к вакуумной линии и промывали последовательно 3 см3 ацетонитрила и 3 см3 деионизированной воды, не допуская осушения ее рабочей поверхности. Порцию экстракта, полученного в соответствии с п. 4.1, объёмом 2 мл пропускали через колонку для твердофазной экстракции при скорости 1 - 2 мл/мин. Первую порцию экстракта, объемом 1 см3 удаляют. Для хроматографического разделения используют последующую порцию экстракта объемом около 1 см3.
Испытания проводили с вирусом болезни Тешена (РНК - содержащий вирус), вирусом инфекционного ринотрахеита (ИРТ, ДНК - содержащий вирус), а также в отношении человеческого коронавируса, выделенного в ГУ НИИ гриппа РАМН от ребёнка в марте 2003 года в городе Санкт-Петербург, в культуре клеток и возбудителем сибирской язвы на жидких и твёрдых питательных средах.
При определении вируссаттического (ингибирующего) действия культуры клеток Vero заражали вирусами в дозе 0,0001 - 0,001 ТЦД50/КЛ После заражения культуры клеток инкубировали при 37 С в течение 1-1,5 часов (период адсорбции вируса) после чего в культуры клеток вносили сухой очищенный экстракт в различных концентрациях и инкубировали в термостате до чёткого проявления цитопатогенного действия (ЦПД) в контроле вируса. Контролями служили: культура клеток, заражённая вирусом (позитивный контроль) и интактная культура клеток, в которую вместо раствора вещества вносили поддерживающую среду (негативный контроль). После проявления ЦПД в контроле вируса опытные и контрольные образцы титровали в культуре клеток. Вирусстатическое действие определяли по разнице титров вирусов в опыте и контроле, которую выражали в lg ТЦД50 (тканевых цитопатических доз).
При определении вирулицидного (инактивирующего) действия раствор сухого очищенного экстракта смешивали в равных объёмах с вируссодержащим материалом и инкубировали при 37 С в течение 18 — 20 часов. Контролем служил вируссо держащий материал, к которому вместо раствора вещества добавляли плацебо (поддерживающая культуральная среда "Игла - М") и интактную культуру клеток. Смесь после контакта титровали параллельно с контролем. Результат учитывали через 72 - 144 часа после инкубирования при 37 С, после чёткого проявления ЦПД в контроле вируса. Вирулицидное действие определяли по разнице титров вируса в опыте и контроле и выражали в lg ТЦД50
Бактерицидное действие сухого очищенного экстракта изучали с возбудителем сибирской язвы в споровой форме согласно "Методическим указаниям по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней с/х животных" М. 1972г. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли по результатам сравнительного титрования контрольных и опытных проб возбудителя методом серийных разведений в мясопептонном бульоне (МПБ) с последующим высевом на мясопептонный агар (МПА).
![Получение и стандартизация органических солей магния и их таблетированных лекарственных препаратов [Электронный ресурс]](/i/i/4447/189958.png "Получение и стандартизация органических солей магния и их таблетированных лекарственных препаратов [Электронный ресурс] Григорян Ирина Валериковна")
