Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Фармакогностическое описание, химический состав, фармакология и мето ды анализа сырья калины 11
1.1 Ботаническая и фармакогностическая характеристика сырья калины 11
1.1.1. Морфологические признаки исследуемых растений 11
1.1.2. Места обитания, ареал заготовки коры калины 12
1.1.3. Химический состав изучаемых растений 13
1.2. Калина как средство фитотерапии (фармакология) 16
1.3. Физико - химические методы анализа основных действующих веществ 20
1.3.1. Дубильные вещества 20
1.3.2.Иридоиды, флавоноиды, аминокислоты 28
Выводы к главе 1 32
Экспериментальная часть зз
ГЛАВА 2 Сравнительное химическое исследование коры и листьев калины
2.1 Определение углеводов и аминокислот 3 8
2.3. Определение фенольных соединений 35
2.3 1 Определение флавоноидов и фенолкарбоновых ки слот 40
2.3.2 Качественное определение стероидов 47
2.3.3 Определение тритерпеноидов 48
2.3.4 Определение кумаринов 49
2.3.5 Определение дубильных веществ 50
2.4. Определение аскорбиновой кислоты 52
2.5 Качественное определение каротиноидов 55
2.6 Качественное определение иридоидов 56
Выводы к главе 2 58
ГЛАВА 3 Подбор условий и разработка методик количественного определения дубильных вещеСТВ В КОре и листьях калины 59
3.1 Разработка методик количественного определения ду
бильных веществ 59
3.1.1 Изучение цветной реакции 60
3.1.2 . Методика определения дубильных веществ в коре калины 65
3.1.3 Сравнение результатов исследований с методом перманганатометрии 68
3.2. Определение дубильных веществ в листьях калины 70
3.2.1 Подбор условий экстракции дубильных веществ из листьев калины 70
3.2.2 Методика количественного определения дубильных веществ в листьях калины 73
3.3 Определение дубильных веществ в жидком экстракте коры калины 75
3.4 Определение фармакологической активности жидкого экстракта калины 77
Выводы к главе 3 79
ГЛАВА 4. Сравнительное определение амино кислот, флавоноидов, иридоидов, кислоты аскорбиновой в листьях и коре кали ны 80
4.1 Определение аминокислотного состава 80
4.2 Подбор условий и разработка методик качественного и количественного определения суммы флавоноидов в листьях калины 84
4.2.1Разработка методики идентификации в листьях калины 84
4.2.2 Подбор условий и разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в листьях калины 88
4.3 Сравнительное исследование содержания иридоидов в коре калины 99
4.3.1 Определение иридоидов в сырье калины 99
4.4 Определение содержания кислоты аскорбиновой в коре и листьях калины 105
Выводы к главе 4 111
ГЛАВА 5. Морфолого-анатомическое исследование коры калины
5.1. Изучение внешних отличительных признаков коры ка лины 114
5.2. Исследование анатомического строения и анатомо- диагностических признаков коры калины 115
Выводы к главе 5 124
Общие выводы 125
Использованная литература 127
- Места обитания, ареал заготовки коры калины
- Определение флавоноидов и фенолкарбоновых ки слот
- Методика определения дубильных веществ в коре калины
- Подбор условий и разработка методик качественного и количественного определения суммы флавоноидов в листьях калины
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи в области синтеза лекарственных веществ растения остаются важными источниками для получения медицинских препаратов. Более 1/3, применяемых в современной медицине препаратов вырабатывается из растительного сырья. В связи с этим возникает вопрос о расширении растительной лекарственной сырьевой базы для производства фитопрепаратов.
Калина обыкновенная с давних пор находит широкое применение в народной и современной практической медицине виде отваров, настоек, жидких экстрактов из коры в качестве эффективного кровоостанавливающего средства, при различных внутренних кровотечений (маточных, желудочных, кишечных, геморроидальных), а также как противовоспалительное, мочегонное, потогонное, поливитаминное средство (плоды калины).
Отвар коры калины применяют при простудных заболеваниях, а также обладают спазмолитическим, гфотивосудорожным, с успокаивающим действием.
Государственная фармакопея XI издания для использования в медицине рекомендует кору и плоды только калины обыкновенной. Сырье для получения препарата из коры калины (калины экстракта жидкого) явно недостаточно, так как кору можно заготовить один раз только при вырубке растения.
Другие виды калины применяются только в народной медицине. Недостаточно изучены в качестве сырья листья калины, которые можно заготавливать с растения несколько раз в год и без его уничтожения. Вид калины гордовины имеет широкий ареал произрастания в Дагестане и может значительно расширить сырьевую базу.
Следовательно, сравнительное исследование калины гордовины и калины обыкновенной является актуальной задачей.
Цель настоящего исследования: изучение химического состава коры и листьев калины гордовины и сравнение его с химическим составом сырья калины обыкновенной, а также разработка методик контроля качества и стандартизации сырья калины гордовины с использованием физико - химических методов анализа.
Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить качественный состав коры и листьев калины гордовины и сравнить его с химическим составом сырья калины обыкновенной.
Разработать методику количественного определения дубильных веществ в коре и листьях калины гордовины и обыкновенной.
3. Провести сравнительную оценку количественного со
держания аминокислот листьев и коры калины гордовины и ка
лины обыкновенной.
Разработать методику идентификации и количественного определения флавоноидов в листьях калины гордовины и калины обыкновенной.
Провести сравнительную оценку содержания иридоидов в сырье калины гордовины и калины обыкновенной.
Провести сравнительную оценку количественного содержания кислоты аскорбиновой в коре и листьях калины гордовины и калиной обыкновенной.
Провести морфолого — анатомическое исследование коры калины обыкновенной и калины гордовины в сравнительном аспекте, выделить морфолого - и анатомо - диагностические признаки, цельного, дробленного сырья и порошка, представить их количественные характеристики, зафиксировать признаки на микрофотографиях.
Научная новизна
Кора калины гордовины, как и кора калины обыкновенной содержит свободные сахара (глюкоза, фруктоза), аминокислоты, стероиды, тритерпи-ноиды, иридоиды, фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая, оксикоричная), кислоту аскорбиновую, дубильные вещества и каротиноиды.
Впервые установлен химический состав листьев калины гордовины и калины обыкновенной. В результате исследований установлено, что листья калины содержат те же химические вещества, что и кора калины, но в меньших количествах. Кроме того, обнаружено, что листья калины богаты флавоноидами (0,5 %).
Установлены морфолого — диагностические признаки коры калины гордовины в цельном, дробленном сырье и в порошке. Показано, что эти признаки имеют сходство, но отличаются количественными характеристиками.
Проведено сравнительное исследование анатомического строения коры калины обыкновенной и коры калины гордовины. Показано, что анатомическое строение изучаемых видов имеет сходство. Различие имеется в размерах анатомо — диагностических признаков (более крупные размеры характерны для калины обыкновенной).
Выделены анатомо — диагностические признаки коры калины гордовины в цельном, измельченном сырье и в порошке.
Подобраны условия и разработана методика спектрофотометриче-ского определения дубильных веществ в коре и листьях калины, основанная на реакции взаимодействия катехина гидрата с железо - тартратным реактивом в присутствии фосфатного буфера.
С помощью разработанной методики установлено содержание дубильных веществ в коре калины гордовины и калины обыкновенной, которые были сопоставлены с данными официнального перманганатометриче-
ского метода определения дубильных веществ. Показано, что пермангана-тометрический метод дает завышенные результаты.
На основании поученных результатов по качественному и количественному составу коры и листьев калины гордовины установлено, что данное растение является ценным лекарственным сырьем, перспективным для научной медицины.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработана и внедрена методика спектрофо-тометрического количественного определения дубильных веществ и установлены морфолого — и анатомо — диагностические признаки коры калины гордовины и обыкновенной и разработан проект ФС «Калины кора».
Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на ХИ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004,2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных статей и тезисов.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки: диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом. Научно - исследовательского института фармации «Разработка и усовершенствование методик анализа сырья и препаратов, содержащих витамины, гликозиды, иридоиды и флавоноиды» (номер государственной регистрации 01.9.70.001594), тематикой проблемной комиссии по фармации №и 36.08 РАМН,МЗ РФ.
На защиту выносятся:
результаты по изучению химического состава коры, плодов и листьев калины гордовины и калины обыкновенной
результаты количественного определения дубильных веществ в коре и листьях калины гордовины и калины обыкновенной.
- результаты морфолого — и анатомо - диагностических признаков коры калины гордовины и калины обыкновенной.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 25 рисунка.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, библиографии из 129 наименований из которых 33 на иностранных языках.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе на основании данных литературы рассмотрены сведения о фармакогностическом описании, химическом составе, фармакологии и методах анализа основных действующих веществ калины.
Вторая глава посвящена изучению качественного состава коры, листьев и плодов калины гордовины и сравнению его с химическим составом сырья калины обыкновенной.
В третьей главе изложены результаты исследования по подбору условий и разработке методики количественного определения дубильных веществ в коре и листьях калины гордовины и калины обыкновенной.
В четвертой главе приводятся результаты количественного определения флавоноидов, иридоидов и кислоты аскорбиновой в коре и листьях калины гордовины и калины обыкновенной.
В пятой главе рассмотрены результаты исследования анатомического строения коры калины гордовины.
Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах и на рисунках, выражены в соответствующих формулах.
Места обитания, ареал заготовки коры калины
В отношении химического состава различных видов калины, в литературе имеются противоположные сведения по отдельным видам калины, есть попытка обобщения этого материала.[93,94]
Кора калины содержит витамины: Ki (28-31 мкг/г), каротина (21 мг %) и аскорбиновую кислоту (70-80 мг %). В коре содержатся тритерпено-вой группы сапонины (до 7 %).кора содержит, кроме того, смолу (6,5 %) желто-красного цвета; в состав омыляемых части ее входит органические кислоты, а в неомыляемую часть — фитостеролин и фитостерин. установлено также наличие флобафенов и аморфного мало изученного гликозида вибурнина. В коре содержится до 20 мг % холилоподобного вещества. Плоды содержат до 32 % инвертного сахара, дубильные вещества, органические кислоты (до 3 %) и аскорбиновую кислоту. В семенах содержится жирное масло (до 20 %) [].
Впервые изучение химического состава коры калины обыкновенной было предпринято Kramer В 1844 г. он доложил о выделении горького вещества, названного им «вибурнином». Позднее Van Allen в 1880г. и Shennan [96] в 1897 г. сообщили о выделении из коры калины сливостной горького гликозида, вибурнина, обладающего сильным спазмолитическим и маточным кровоостанавливающим свойствами. Подобный гликозид был вьщелен также из листьев V. tinus L. [97], из коры V. refidulum Raf., V. alnifolium Marsh. V. trilobum L. [97], а также из плодов V. opulus L. [13]. Результат проведенных фармакологических и клинических исследований выделенного гликозида показали высокую фармакологическую активность — усиление сокращений сердца и усиление тонуса матки [98]. Гликозид вибурнин был выделен в виде оранжево-желтого аморфного порошка с температурой плавления 65-72 С. Он обладает горьким вкусом и специфическим запахом валериановой кислоты [95]. При гидролизе одни авторы получили глюкозу, другие — маннозу органические кислоты: муравьиную, уксусную, валериановую и изовалериановую [96,97,98]; агликон получен в виде маслянистой жидкости. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные выделению, очистке и выяснению химической природы гликозида вибурнина, до настоящего времени его структура не установлена. Вероятно, он не является индивидуальным веществом.
В 1972 г. Nicolson и соавт. из водного экстракта коры калины обыкновенной выделили вещество, получившее название, «виопудиал» (Viopudial), которое обладало спазмолитическими, кардиотоническими и седативными свойствами. На основе спектроскопического и элементного анализов было установлено, что виопудиал является сложным эфиром изовалериановой кислоты и сесквитерпенового спирта (СЮ), имеющего две альдегидные группы и две двойные связи. Дальнейшие публикации этих авторов по установлению структуры виопудиал в литературе не появились.
Godeau и соавт. [99] в экстракте листьев V tinus L. методом тонкослойной хромотографии обнаружили вещество, дающее реакции на сложные эфиры с гидроксиламином и динитрофенилгидразином. После кислотного гидролиза этого вещества было получено индивидуальное соединение состава СюН802 на основе УФ; ИК - , и ЯМР — спектров установлено, что выделенное вещество представляет собой 4-метил-7-формилциклопентана (с) пиран. Оно было названо вибуртиналом. Ранее вещество со схожим строением были выделены из корневища Valeriana wallachii L [100], а также и из других видов валерианы, входящих в сборный вид Valeriana Oficinalis L., и были названы валепотриатами, эти вещества считаются одними из основных действующих веществ валерианы.
Кроме иридоидов и сесквітерпенового спирта, из многих видов калины выделены тритерпеновые сапонины, являющиеся производными J и В -амиринов: олеаноловая, урсоловая, хедерагеновая кислоты [101,102].
Многочисленными исследованиями было доказано наличие в различных видах калины кумариновых соединений. Так, Hoerhammer и соавт. [94] из коры калины сливолистной и калины обыкновенной выделили оксикумарины скополетин, эскулетин и их гликозиды. Однако, по их мнению, из-за малого количества кумаринов в коре калины они не могут полностью определять фармакологическую активность коры калины. Аналогичные данные получены Yarboe и coaBT.Macholson [92,93]. Имеется сообщение о выделении изокумарина бергенина из корней Viburnum nervosum Hook [104].
В последние годы из многих видов калины выделены дубильные вещества конденсированного ряда, при исследовании их состава отмечено наличие катехина и эпикатехина.
Bohm и Glennic [107] и Jensen и соавт [106] в свежесобранных листьях V. davidi Frach обнаружили гликозиды, после кислотного гидролиза которых выделен агликон 2,4,4 і — триоксидигидрохалкон. Этими же авторами гликозиды халконов были выделены из листьев и цветков V. henrii Hemsl и V. lantana L. [107]. Наряду с халконами из листьев и цветков многих видов калины выделены гликозиды кверцетина, апигенина, лютеалина, кемпферола и цианидина [108-111]. Кроме того, в коре и листьях некоторых видов калины обнаружен очень редко встречающийся димер апигенина — аментофлавон [108]. Имеется несколько сообщений о вьщелении из листьев калины обыкновенной и коры калины сливолистной фенологлико-зида арбутина, из листьев калины вильчатой — фуркатина, из коры калины сливолистной и листьев калины Генри-салицилина [112-115].
Определение флавоноидов и фенолкарбоновых ки слот
Определение фенольных соединений проводят в этилацетатной и бутанольной фракциях. Предварительный анализ состоит из комплекса качественных реакций. Качественной реакцией на флавоноиды является цианидиновая проба.
1. К извлечению добавляют хлористоводородную концентрированную кислоту и кристаллический магний. Реакционную смесь нагревают на кипящей водяной бане, образуется красное окрашивание. Для извлечений из листьев калины реакция положительна, для извлечений из коры - отрицательна.
2. Реакцией на оксикоричные кислоты и флавоноиды является реакция с раствором аммиака. При добавлении к 1 мл этилацетатного извлечения 3-5 капель раствора аммиака наблюдается темно - желтое окрашивание верхнего слоя в извлечениях из листьев калины обыкновенной и калины гордовины.
3. Реакция на кислоты оксикоричные и флавоноиды проводится с диазотированным бензидином. Прибавляя этот реактив к 1 мл этилацетатной фракции наблюдается желтое окрашивание в извлечениях из листьев калины обыкновенной и калины гордовины.
4. Общей реакцией на фенольные соединения является взаимодействие извлечений с 1 % раствором железа окисного хлоридом
Таким образом, анализируя качественные реакции, можно предположить, что в исследуемых извлечениях из листьев калины обыкновенной и гордовины имеются флавоноиды и оксикоричные кислоты. Доказательством такого предположения являются результаты полученные с помощью ТСХ.
Бутанольные извлечения из листьев и коры калины обыкновенной и калины гордовины полученные раннее описанным способом, наносят с помощью микропипетки на линию старта в количестве ОД мл. Рядом наносят 0,05 % этанольный раствор стандарта рутина. В качестве подвижной фазы используют систему растворителей: н — бутанол — кислота уксусная ледяная — вода (4:1:2). Предварительно проводят насыщение камеры в течение 40 минут. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе, затем помещают в камеру с системой растворителей: н — бутанол - кислота уксусная ледяная — вода (4:1:2) и хроматогрфируют восходящим способом. После прохождения системой растворителей 12 см хромато-грамму высушивают на воздухе и обрабатывают 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида.
Флавоноиды должны проявиться после нагревания в сушильном шкафу при температуре 80 С в течение 5 минут в виде желтых пятен. На хроматограмме появились желтые пятна с Rf = 0,6 соответствующие зоне адсорбции рутина и Rf = 0,9 соответствующее зоне адсорбции кверцетина и еще ряд желтых пятен.
Следовательно, в листьях калины обыкновенной и калины гордовины присутствуют рутин и кверцетин.
Присутствие флавоноидов в листьях калины было доказано с помощью метода высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Полученные результаты представлены на рис 3,4 и 5
Методика определения флавоноидов в листьях калины 2,5 мл экстракта калины жидкого помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл. Прибавляют 20 мл 70 % этанола, тщательно перемешивают и выдерживают в темном месте 30 мин затем объем раствора в колбе доводят тем же раствором до метки и тщательно перемешивают.
10 мкл полученного раствора вводили в жидкостной хроматограф фирмы Perkin Elmar с диодно-матричным детектором и насосом. Хроматгорафировали при следующих условиях: стальная колонка фирмы Beckmam длиной 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом С18 с величиной частиц 5 мкм. Предколонка Security Guard Cartrige СІ8 (2) (4x3 мм) (Phenomenex, США). Программное обеспечение Turbo Chrom версия ТС4. скорость потока элюента 1 мл/мин. Длина волны детектирования 255 нм соответствуют максимуму поглощения рутина и других флавоноидов. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила с водой имеющей значение рН в интевале 2,2-2,8. (рН устонавли-вают с помощью фосфорной кислоты).
Параллельно в тех же условиях вводят в хроматограф 10 мкл раствора стандартного образца рутина.
Примечание:
Приготовление стандартного образца рутина: 0,0125 г помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 20 мл спирта этилового 70% и после полного растворения вещества доводят до метки этим же растворителем. Полученный раствор -рабочий стандартный образец (РСО) содержит 0,5 мг/мл рутина. Перед хроматографическим исследованием раствор РСО разбавляют в соотношении 1:10 тем же растворителем
Исследования на фенолкарбоновые кислоты проводили методом ТСХ. В качестве неподвижной фазы использовали пластинки «Силуфол» размером 15x15 см. Хроматогрфирование проводили в системах растворителей: бутанол - кислота уксусная - вода (4:2:1) и (4:1:5); хлороформ - кислота уксусная - вода (4:1:1); бензол - диоксан - кислота уксусная (90:25:4). Время насыщения камеры парами растворителей 30 мин. На линию старта хроматографической платники наносили 0,002 мл этилацетат-ной фракции, 1 % спиртового раствора кислоты хлорагеновой, 1 % спиртового раствора кислоты коричной. После прохождения фронтом растворителей 12 см пластинку вынимали из камеры, высупшвали на воздухе, затем проводили детектирование зон адсорбции 1 % раствором калия перманга-ната. Наилучшее разделение достигнуто в системе растворителей: бензол — диоксан — кислота уксусная (90:25:4). Схема хроматограммы проведена на рисЗ.
Методика определения дубильных веществ в коре калины
Подбор оптимальных условий экстракций дубильных веществ коры калины основан на методе определения дубильных веществ предложенной вГФХ1[32].
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с размером 3 мм. Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл воды и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл. К оставшемуся в колбе сырью добавляют 50 мл воды и ставят на водяную баню в течение 15 мин. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют в ту же колбу на 200 мл. Промывают вату с сырьем 2 раза по 20 мл и доводят колбу водой до метки и перемешивают. Затем фильтруют через бумажный фильтр (раствор А).
В три мерные колбы вместимостью 50 мл помещают по 10 мл раствора А, раствор стандарта, воды.
В каждую из трех колб добавляют по 5 мл фосфатного буфера, 12,5 мл железо - тартратного буфера и соответственно доводят водой до меток и перемешивают.
Измеряют оптическую плотность анализируемого и стандартного раствора относительно раствора сравнения в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 545 нм. Процентное содержание дубильных веществ рассчитывают по формуле: Дхшстх 20000 X = , где
ДохтхСЮО-W) D - оптическая плотность анализируемого раствора D0- оптическая плотность стандартного раствора шст- масса катехина гидрата, г m - масса навески сырья, г W - потеря в массе при высушивании 20000 - разведения
Для определения точности и воспроизводимости разработанной методики были проверены образцы коры калины обыкновенной и гордо вины и проведена статистическая обработка полученных результатов. Данные представлены в табл.1.
Из табл. 1 видно, что с помощью разработанной методики возможно определять дубильные вещества с достаточной точностью относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ±4,79%.
Для определения систематической ошибки определяют дубильные вещества с использованием методом добавок. Результаты метода добавок представлены в табл.2. 3 1,92 1,44 3,36 3,24 -3,7
Из данных табл. 1,2 следует что отсутствует систематическая ошибка и разработана методика определения дубильных веществ с достаточной воспроизводимостью и точностью.
Перманганатометрический метод является традиционным для количественного определения дубильных веществ, но он имеет ряд недостатков: способность калия перманганата окислять многие природные соединения, относящиеся к различным классам по химическому строению, различный пересчетный коэффициент для разных групп соединений, растянутость перехода окраски раствора при титровании [35].
Таким образом, данный метод не позволяет объективно оценить содержание дубильных веществ в коре калины гордовины, особенно при содержании не менее 10 %. Значительно возрастает ошибка определения за счет сопутствующих веществ.
Сравнительные данные по определению дубильных веществ спек-трофотометрическим методом и перманганатометрическим.
Результаты определения содержания дубильных веществ в коре калины гордовины представлены в табл. 3. Из выше приведенных данных следует что, метод спектрофотомет-рии является наиболее оптимальным для определения дубильных веществ в коре калины. Содержание дубильных веществ в коре калины гордовины и в коре калины обьпсновенной совпадают. Расхождение составляет не более 0,07 %.
При подборе оптимальных условий экстракции дубильных веществ из листьев калины обыкновенной и гордовины изучались следующие факторы: тип экстрагента, измельченность сырья, условия нагревания, время экстрагирования, соотношение сырья и экстрагента.
При установлении типа экстрагента исследовали воду и этанол различных концентраций (40 %, 70 %).
По данным исследования видно, что наиболее полное извлечение дубильных веществ из сырья происходит при использовании в качестве экстрагента воды.
При подборе оптимальной степени измельченности сырья использовали сита с диаметром отверстий 0,5 мм; 2,0 мм; 3,0 мм. Исходя из данных таблицы видно, что максимальное извлечение дубильных веществ из листьев калины обыкновенной достигается при использовании сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм.
При изучении оптимальной температуры экстракции использовали следующие режимы: извлечение на кипящей водяной бане, на огне, без нагревания ( перемешивание). Данные представлены в табл 7.
Подбор условий и разработка методик качественного и количественного определения суммы флавоноидов в листьях калины
Химическое исследование сырья калины гордовины и калины обыкновенной показало, что в листьях данных видов сырья, содержатся флавоноиды. С помощью хроматографии в тонком слое сорбента было установлено, что флавоноиды представляют сумму соединений, из которых основными являются рутин и кверцетин. Содержание флавоноидов в листьях было подтверждено, также методом ВЭЖХ.
Для сравнительного исследования калины гордовины и калины обыкновенной необходимо было разработать методику идентификации и количественного определения флавоноидов в листьях вышеуказанных объектов. Разработка методики идентификации в листьях калины
Дня идентификации флавоноидов широко применяются методы хроматографии на бумаге и хроматографии в тонком слое сорбента. При этом используются различные системы растворителей: н - бутанол - ки слота уксусная ледяная - вода (4:1:2); 15 % кислота уксусная ледяная; 2 % кислота уксусная; хлороформ - толуол - 95 % этанол (15:2:3). В результате проведенных исследований нами в качестве системы растворителей выбрана: н-бутанол- кислота уксусная ледяная -вода (4:1:2) [14,15,28]. На основе полученных результатов предложена методика идентификации флавоноидов в листьях калины.
Методика. Около 3 г сырья, проходящего через сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл 70 % спирта и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин. Затем охланодают и фильтруют через вату (раствор А).
На стартовую линию пластинки «Силуфол» УФ - 254 » размером 10X15 см наносят по 0,05 мл в первую точку раствора А, во вторую - раствора рутина, в третью - раствора кверцетина. Пластинку высушивают на воздухе и хроматграфируют восходящим способом в системе растврите-лей: н - бутанол - кислота уксусная ледяная — вода (4:1:2). Когда фронт растворителей дойдет до края пластишш (12-13см), пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе до удаления запаха растворителей. Затем обрабатывают 2 % спиртовым раствором алюминия хлоридом. Зоны адсорбции выявляют в УФ - свете при длине волны 366 нм. На хроматограмме должно быть два пятна желто — зеленоватого цвета на уровне «свидетелей» рутина и кверцетина. Допускается наличие и других пятен.
Примечание. 1. Приготовление 0,05 % раствора рабочего стандартного образца рутина. Около 0,025 г (точная навеска) свежевысушенного в течение 3 часов при температуре 135 С рутина растворяют при нагревании в 40 мл 70 % спирта в мерной колбе вместимостью 50 мл. После охлаждения доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.
2. Приготовление 0,02 % раствора рабочего стандартного образца кверцетина. Около 0, 020 г (точная навеска ) свежевысушенного в течение 3 часов при температуре 135 С кверцетина растворяют при нагревании в 40 мл 70 % спирта в мерной колбе вместимостью 50 мл. После охлаждения доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.
3. Приготовление 2 % раствора алюминия хлорида в 70 % спирте. Около 2.0 г алюминия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл растворяют в 90 мл 70 % спирта и доводят тем же спиртом до метки перемешивают.
Из рис.15 видно, что Rf рутина равно 0,6, Rf кверцетина равен 0,9 по интенсивности пятна можно заключить, что среди флавоноидов листьев калины рутин является преобладающим. При просматривании пластинки в УФ - свете при длине волны 254 нм на уровне пятна кверцетина должно быть пятно зеленовато — желтого цвета, на уровне пятна рутина — пятно темно — желтого цвета.
2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл прибавляют 10 мл 95 % этанола, 1,5 мл 2 % раствора алюминия хлорида, нагревая на кипящей водяной бане 3 мин, быстро охлаждают прибавляют 2 мл буферного раствора и доводят объем раствора водой до метки перемешивают; образуется желтое окрашивание.
Для количественного определения суммы флавоноидов, основываясь на данных литературы и собственных исследований, нами применен спектрофотометрический метод после проведения реакции комплексообразования с алюминия хлоридом. Реакция комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом вызывает батохромный сдвиг I полосы поглощения флавоноидов с 330 — 350 нм до 390 — 410 нм [18]. Это позволяет применять в качестве контроля испытуемый раствор без реактива и тем самым исключить влияние окрашенных сопутствующих веществ. Для получения более воспроизводимых результатов реакцию комплексообразования проводят в среде 40-50 % этанола и буферного раствора 4,0.
Целью настоящего исследования являлось: изучить условия проведения реакции флавоноидов с алюминия хлоридом, подобрать условия извлечения флавоноидов из сырья, очистку их от балластных веществ, и разработать методику количественного определения флавоноидов в листьях калины.
