Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Рецептор NR3C4: строение, свойства, механизмы действия
1.2 Роль рецептора NR3C4 в возникновении и развитии различных физиологических нарушений 18
1.3 Компьютерный скрининг потенциальных лиганд биологических мишеней. Основные этапы 24
1.3.1 Настройка трехмерной библиотеки структурных формул . 25
1.3.2 Методы компьютерного скрининга. 29
1.3.3 Оценочные функции . 30
1.3.4 Обработка результатов докинга . 32
1.3.5 Сравнительный анализ инструментов докинга 34
1.4 Применение микроволнового излучения в синтезе биологически активных соединений . 35
Глава 2 Обсуждение результатов исследований 40
2.1 Компьютерный скрининг соединений – потенциальных блокаторов рецептора NR3C4 40
2.2 Синтез наиболее перспективных по расчетным оценкам соединений 53
2.3 Физико-химический анализ синтезированных соединений 56
2.4 Определение кинетических закономерностей получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в концентрированной серной кислоте в условиях микроволнового излучения 60
2.5 Исследования биологической активности синтезированных соединений 69
2.5.1 Исследование аффинности испытуемых веществ к рецептору NR3C4 с помощью тест-системы PolarScreen Green 69
2.5.2 Исследования цитотоксичности испытуемых соединений по отношению к клеткам AR-UAS-bla GripTite 293 74
2.5.3 Исследования антагонистической активности испытуемых соединений к рецептору NR3C4 клеток AR-UAS-bla GripTite 293 79
Глава 3 Экспериментальная часть 86
3.1 Ацилированные амиды L- и D-аминокислот 86
Ацилированные сложные эфиры L- и D-аминокислот N-ацилированные аминоакридин-9(10Н)-оны Ацилированные по N-концу пептиды
Очистки синтезированных соединений
Физико-химический анализ синтезированных веществ...
Кинетические исследования получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в среде концентрированной серной кислоты в условиях микроволнового излучения
Порядок проведения исследований биологической активности и цитотоксичности соединений –потенциальных блокаторов рецептора NR3C4
Исследование аффинности синтезированных соединений к рецептору NR3C4 с помощью тест-системы PolarScreen Green .
Культивирование клеточной культуры AR-UAS-blaGripTite 293
Определение неспецифической цитотоксичности испытуемых соединений по отношению к клеткам AR-UAS-bla GripTite методом флуоресцентной микроскопии .
Исследования антагонистической активности испытуемых соединений
Выводы список литературы .
- Роль рецептора NR3C4 в возникновении и развитии различных физиологических нарушений
- Сравнительный анализ инструментов докинга
- Исследования биологической активности синтезированных соединений
- Порядок проведения исследований биологической активности и цитотоксичности соединений –потенциальных блокаторов рецептора NR3C4
Роль рецептора NR3C4 в возникновении и развитии различных физиологических нарушений
Рецептор NR3C4 (nuclear receptor subfamily 3, group C, member 4), также известный как рецептор андрогенов, является типом ядерных рецепторов [15]. Это самый большой белок из данного семейства рецепторов [16-19].
Ген рецептора NR3C4 (около 90 килобайс, кб) был впервые клонирован в 1988 г. [17, 20]. Транскрипт рецептора после сплайсинга и процессинга размером около 11 кб оснований содержит открытую рамку считывания размером около 2,8 кб [21]. Соответствующий нормальный белок состоит из одной полипептидной цепи и содержит 919 аминокислотных остатков [17].
Существует две изоформы рецептора NR3C4: изоформа А, в которой отсутствуют первые 187 аминокислот (87 кДа) и изоформа B с полной длиной аминокислотной последовательности (110 кДа). В молекуле рецептора выделяют четыре основных структурных домена (пептидных фрагмента) [22-23].
Как и другие ядерные рецепторы, рецепторы NR3C4 имеет модульную структуру и состоят из следующих функциональных областей [24]: 1. A/B или N-концевой домен, NTD [25] содержит около 559 аминокислот. Это наиболее вариабельный по длине и последовательности участок [22, 26]. В данном домене условно выделяют следующие более мелкие участки: последовательность 141 - 337 (или 101 - 370) образует участок с так называемой активационной функцией-1 (AF-1) [22, 27]. Она обусловливает основную транскрипционную активность рецептора [22, 28]; участок AF-5 (последовательность 360-485) обуславливает транскрипционную активность не связаную с лигандом; участок (последовательность 1-36) отвечает за димеризацию (FXXLF, где F – Phe, L – Leu и X – любой аминокислотный остаток), и совместно с участком (последовательность 370-494) осуществляет внутримолекулярное
Рецепторы NR3C4 модулируют важные нормальные клеточные процессы и действуют как транскрипционные факторы в контроле роста клеток, дифференциации, пролиферации и апоптоза в клетках-мишенях для андрогенов не только у мужчин, но и у женщин [32]. Ген рецептора находится на высоко-консервативном участке X хромосомы млекопитающих – Xqll-12 [16, 33].
Для взаимодействия комплекса рецептор-лиганд с ДНК и инициации биологического ответа необходимо участие целого ряда белков-корегуляторов и факторов транскрипции [20]. Обнаружены как не специфические регуляторы действия – общие для стероидных гормонов и общие при механизмах транскрипции, так и специфические регуляторы для отдельного типа стероидов. Некоторые корегуляторы являются отдельными идентичными белками [19], а некоторые – образуют целое семейство белков-кофакторов [34]. Корегуляторы делятся на стимуляторы активности рецепторов стероидных гормонов (коактиваторы) и на ингибиторы (корепрессоры) [19]. Показано in vitro, что сигнальная система рецептора NR3C4 человека активируется с участием ростовых факторов (фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста) [21, 35]. Корегуляторные белки, по-видимому, не связываются со специфическими последовательностями ДНК, а действуют как адаптеры (модуляторы) между доменами молекулы рецептора и общим транскрипционным комплексом, образуя мультибелковые комплексы и модулируя функции рецептора при их транс-активации [19, 21].
Основными предположительными механизмами действия лигандов на клетку-мишень являются:
1. Диффузия тестостерона в клетку благодаря наличию положительного градиента концентрации [35-36];
2. Превращение тестостерона под действием 5-редуктазы (5-Р) в 5-дигидротестостерон [32, 35-36];
3. Связывание лиганда (тестостерона или дигидротестостерона) с определенным участком молекулы рецептора NR3C4, который в цитоплазме находится в составе мультибелкового комплекса, приводит к ряду физико химических преобразований этого мультибелкового комплекса и самой молекулы рецептора; конформационные изменения белковой цепи рецептора, его диссоциация из мультибелкового комплекса, гомодимеризация, демаскировка определенного(ых) участка(ов) молекулы рецептора, которая в комплексе с лигандом становится более компактной и стабильной. Все эти сложные внутримолекулярные преобразования получили название «активация рецептора» [21];
4. Перенос (транслокация) активированной формы рецептора в ядро [35-36];
5. Связывание активированной формы рецептора с определенными акцепторными (гормончувствительными элементами – AREs) участками ДНК [23, 35-36];
6. Реализация специфического ответа – изменение экспрессии определенных генов и синтеза специфических белков (ферментов, рецепторов и т.п.) [21, 35-36].
В настоящее время нет единого мнения относительно того, находятся ли рецептор NR3C4 в цитоплазме клетки-мишени в виде апобелка (белок без простетической группы) в составе комплекса с белками теплового шока (Hsp90, Hsp70) и другими шаперонами (p23, p60, FKB506) [37] и перемещаются в ядро только после связывания со стероидом, или в нормальных условиях рецептор NR3C4 постоянно находятся в ядре, а дигидротестостерон из цитоплазмы проникает в ядро, где и происходит «активация» комплекса рецептор-дигидротестостерон. Мнения исследователей отличаются существенно:
1. При физиологических условиях не только основная часть рецептора NR3C4 сконцентрирована в клеточном ядре, но и в отсутствие дигидротестостерона остается там [38];
2. Свободные рецепторы NR3C4 могут находиться и в цитоплазме, и в ядре; присутствие лиганда и его связывание с рецепторами NR3C4 регулирует распределение рецептора между цитоплазмой и ядром [23, 39].
Сравнительный анализ инструментов докинга
Компьютерный скрининг выполнялся с целью предварительного отбора перспективных веществ – потенциальных блокаторов рецептора NR3C4 для их последующего синтеза и тестирования на наличие антагонистической активности.
Для компьютерного скрининга степени связывания веществ с белком рецептора NR3C4 (докинга) и оценки данной энергии связывания использовался программный комплекс «Алгокомб». Атомы белка рецептора считались неподвижными; конформация искомого лиганда изменялась так, чтобы обеспечить наилучшее расположение в лигандсвязывающем домене белка рецептора и наибольшую энергию связывания.
Среди требований к разрабатываемым веществам, выполнение которых с наибольшей вероятностью обеспечит необходимый физиологический эффект, можно выделить следующие: 1) большая энергия образования комплекса вещества с лиганд связывающим доменом рецептора NR3C4; 2) эффективный перенос электронной плотности с молекулы вещества на рецептор NR3C4 с последующим изменением его конформации в результате электронно-конформационного взаимодействия.
Было выдвинуто предположение, что одним из факторов, влияющих на возникновение антагонистического эффекта, вызываемого связыванием лиганда с рецептором NR3C4, является пространственная конфигурация (конформация), которую принимает белок рецептора в результате связывания с лигандом. Исходя из этого предположения, для докинга была выбрана конформация белка из комплекса с известным антагонистом рецептора. Такой выбор конформации белка для докинга должен повысить долю антагонистов среди веществ с высокой оценкой связывания с рецептором NR3C4. При выборе конформации рецептора NR3C4 для докинга руководствовались двумя соображениями: 1) структура белка должна быть расшифрована с хорошей точностью; 2) белок должен быть в комплексе с уже известным антагонистом – селективным модулятором рецептора NR3C4.
Общепринятым источником данных о конформациях белка является база данных структур белок-лигандных комплексов Protein Data Bank (PDB) [84]. Для некоторых белков в PDB представлено много различных конформаций, полученных в разных условиях или в комплексе с разными лигандами. Как было показано ранее, выбор конформации белка для докинга существенно влияет на результаты расчетов [183].
Нет прямых доказательств связи антагонистического эффекта и селективного действия лигандов на рецептора NR3C4 с конформацией, принимаемой белком при образовании комплекса. Однако, мы исходили из предположения, что принимаемая белком конформация – это один из факторов, определяющих действие лиганда на рецептор. В результате чего, для докинга была выбрана конформация белка из комплекса с индексом 1XNN – комплекс рецептора NR3C4 с селективным модулятором бицикло-1H-изоиндол-1,3(2H)-дионом.
В активном сайте белка в комплексе 1XNN содержатся две молекулы воды, которые существенно участвуют в образовании комплекса между лигандом и белком рецептора NR3C4. Одна из молекул воды образует водородные связи с лигандом и с двумя боковыми цепями рецептора (рисунок 2.1.1).
При использовании стандартной методики докинга, нативный лиганд и все вспомогательные молекулы (вода, растворители и т.п.) удалялись из комплекса белок-лиганд. На оставшейся структуре белка задавался активный сайт, в который производился докинг искомых лигандов. Для лучшего учета молекул воды в активном сайте в ходе проведения исследований разработана методика учета наличия молекул воды в активном сайте белка рецептора при докинге.
Расчеты для комплекса 1XNN проводились как с учетом наличия воды в сайте связывания, так и без него. Результаты расчетов показали, что программа докинга правильно учитывает наличие или отсутствие воды. Так, при докинге без учета наличия молекул воды программа стремилась поместить на место удаленных молекул воды, заменяющие их атомы лиганда подходящего химического типа. При докинге же с учетом наличия молекул воды программа стремилась разместить лиганды так, чтобы они образовывали с ней водородную связь. При помощи программного комплекса Accelrys Discovery Studio (DS Version 2.5.0.9167) проводился дополнительный расчет ADME/Т-свойств (растворимость соединения, пассивное всасывание в кишечнике, связывание соединений с белками плазмы крови, коэффициент липофильности лигандов, токсичность).
Расчет липофильности соединения производили для прогнозирования процессов поглощение, проникновение в клетку, выделение. Для характеристики липофильности использовали коэффициент распределения концентраций препаратов между н-октанолом и водой (log P). При выборе рекомендуемых значений исходили из предположения, что чем больше липофильность соединения, тем лучше препарат будет растворяться в липидной фазе и тем больше вероятность проникновения его в клетку [184].
Уровень связывания препарата с белками плазмы крови имеет важное фармакокинетическое значение, поскольку несвязанная часть препарата свободно диффундирует через биологические мембраны и достигает места расположения рецептора, после чего вызывает фармакологический эффект и наиболее быстро элиминируется. При определении допустимых значений степени связывания препаратов с белками плазмы руководствовались значениями данного параметра для уже известных антагонистов рецептора NR3C4 (флутамид, бикалудамид, этинилэстрадиол, ципротерон), для которых он составляет более 90%.
При пероральном приеме препаратов, прежде чем достигнуть системного кровотока, препарат должен быть абсорбирован в желудочно-кишечном тракте (тонком кишечнике). Необходимыми условиями этого процесса являются адекватные водорастворимость и всасывание в кишечнике. В качестве дескриптора растворимости препарата в воде использовали десятичный логарифм величины растворимости log Sw (моль/л). При расчете степени пассивного всасывания испытуемого соединения в кишечник рекомендуемым значением являлся уровень в 90% и более.
Исследования биологической активности синтезированных соединений
Из данных таблицы и рисунка видно, что для контрольного антагониста ципротерона ацетата величина I превышает значения контроля в 4 раза. У наиболее аффинных лигандов рецептора NR3C4 отмечена выраженная антагонистическая активность для 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]-L-пролина (величина I превышает значения контроля в 4,41 раза), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил]-L-пролина (в 4,22 раза), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]-L-пролина (в 4,11 раза) [202-205].
Проведен скрининг аффинности и цитотоксичности 32 соединений – потенциальных лигандов рецептора NR3C4; по результатам скрининга аффинности определены наиболее аффинные лиганды: 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]-4-гидрокси-D-пролина (соединение 11, таблица 2.5.1.1), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 16), 2-(2-нитрофенил) этиловый эфир 1-[(4-фторфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 17), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил] 85 L-пролина (соединение 18), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 19).
По результатам исследований цитотоксичности аффинных соединений к целевому рецептору NR3C4 клеток культуры AR-UAS-bla GripTite 293 вещества 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 16, таблица 2.5.2.1, 2.5.2.2), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 18), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 19) показали схожий уровень токсичности с контрольным антагонистом (ципротерона ацетатом) рецептора, вследствие чего, были отобраны для дальнейшего исследования антагонистической активности.
Соединения 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 16, таблица 2.5.3.1), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 18), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил]-L-пролина (соединение 19), показавшие наиболее высокую аффинность и малую цитотоксичность, являются перспективными новыми антагонистами рецептора NR3C4. 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1) Гидрохлорид метилового эфира аминокислоты (соединение II, рисунок 2.2.1). Через суспензию 22,9 ммоль аминокислоты (I) в 36 мл метилового спирта при перемешивании барботировали хлористый водород при 0 оС до получения раствора. Далее повышали температуру до комнатной и выдерживали смесь в течение 48 ч. Фракцию с продуктом упаривали в вакууме при 45 оС. Продукт лиофилизировали. Выход: 81-89%.
2) Метиловый эфир N-ацилированной аминокислоты (соединение III, рисунок 2.2.1). К охлажденному до 0 оС раствору смеси 11,7 ммоль гидрохлорида метилового эфира аминокислоты (II) и 11,7 ммоль карбоновой кислоты в 33 мл безводного диметилформамида (DMF) при перемешивании добавляли 24,8 ммоль N-этил-N,N-диизопропиламина (DIEA), 25,7 ммоль 1-гидроксибензотриазола (HOBt) и 25,7 ммоль гидрохлорида 1-этил-(3 -(3-диметиламино)пропил)карбодиимида (EDCI) и температуру повышали до комнатной. Смесь выдерживали в течение 36 ч и добавляли 150 мл воды. Продукт выделяли при помощи флеш-хроматографии на картриджах PF-15C18/35G (InterChim). Фракцию с продуктом упаривали в вакууме при 45 оС. Продукт лиофилизировали. Выход: 76-83%.
3) N-ацилированная аминокислота (соединение IV, рисунок 2.2.1). К раствору смеси 9,47 ммоль метилового эфира N-ацилированной аминокислоты (III), 25 мл тетрагидрофурана и 25 мл метилового спирта добавляли 20,0 ммоль 1М водного раствора гидроксида лития. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч и упаривали в вакууме, остаток подкисляли 1М раствором хлористоводородной кислоты до рН=2. Продукт выделяли при помощи флеш-хроматографии на картриджах PF-15C18/35G (InterChim). Фракцию с продуктом упаривали в вакууме при 45 оС. Продукт лиофилизировали. Выход: 48-74%. 4) N-ацилированный амид аминокислоты (соединение V, рисунок 2.2.1).
Смесь 0,68 ммоль N-ацилированной аминокислоты (IV) и 0,75 ммоль соответствующего амина в 4,4 мл безводного DMF охлаждали до 0 оС. Добавляли 0,75 ммоль DIEA, 1,36 ммоль HOBt и 1,36 ммоль EDCIHCl. Температуру повышали до комнатной и выдерживали в течение 36 ч. Далее добавляли 4,4 мл воды и выделяли полученный продукт при помощи флеш-хроматографии на картриджах PF-15C18/35G (InterChim). Фракцию с продуктом упаривали в вакууме при 45 оС. Продукт лиофилизировали. Выход: 35-41%.
5) N-Метил-N-{[2-(трифторметил)фенил]ацетил}-D-тирозинамид (соединение V, рисунок 2.2.1). Газообразный метиламин пропускали через раствор 0,50 ммоль метилового эфира N-{[2-(трифторметил)фенил]ацетил}-D тирозина (III) в 50 мл метанола до постоянной массы реакционной смеси. Выдерживали при постоянном перемешивании 15 часов и упаривали в вакууме. Вещество выделяли при помощи флеш-хроматографии на картриджах PF 15C18/35G (InterChim). Фракцию с продуктом упаривали в вакууме при 45 оС. Продукт лиофилизировали. Выход: 77%.
Порядок проведения исследований биологической активности и цитотоксичности соединений –потенциальных блокаторов рецептора NR3C4
Исследование аффинности синтезированных соединений к рецептору NR3C4 проводили с помощью тест-системы PolarScreen Green Invitrogen P3018 (Life Technologies, USA) методом измерения изменений поляризации флуоресценции. Аффинность синтезированных веществ определяли в концентрации 10 мкМ. Испытуемые и контрольные соединения растворяли в ДМСО, а затем доводили реакционным буфером до нужной концентрации (конечная концентрация ДМСО составляла 1%). В качестве положительного контроля при анализе связывания с рецептором NR3C4 использовали антагонист рецептора NR3C4 - ципротерона ацетат.
В микропробирки вносили контрольные и испытуемые вещества, и добавляли равный объем комплекса LBD (His-GST) и Fluormone AL Green. Также готовили дополнительные контроли, содержащие раствор комплекса LBD-Fluormone AL Green в реакционном буфере. Контрольные и исследуемый вещества инкубировали в течение 6 ч и проводили измерения поляризации
Для проверки активности соединений на клетках культуры AR-UAS-bla GripTite 293 предварительно определяли неспецифическую цитотоксичность синтезированных веществ на данной культуре клеток. Криопробирки с клетками AR-UAS-bla GripTite 293 извлекали из криобанка и помещали на 5-7 минут в теплую воду (37 0С) для быстрого размораживания. Размороженные клетки отмывали средой ДМЕМ (среда МЕМ в модификации Дюльбекко) без сыворотки с помощью центрифугирования. Клеточный осадок ресуспендировали в ростовой среде, до концентрации 1-3105/мл и культивировали на среде ДМЕМ (Invitrogen), содержащей 10% диализованной фетальной сыворотки (Invitrogen).
Для культивирования поверхностно-зависимых клеток AR-UAS-bla GripTite 293, суспензию клеток вносили в матрасы для культивирования клеток и помещали на 2-3 суток в СО2-инкубатор. При достижении клетками монослоя ростовую среду сливали, монослой промывали раствором Хенкса, и клетки трипсинизировали в растворе трипсин-версен до полного сползания монослоя. Клетки суспендировали посредством пипетирования в ростовой среде и пересевали на 2-4 новых матраса. Дальнейшее культивирование клеток проводили аналогичным образом (в соответствии с рекомендуемыми методиками, см. Приложение).
Определение неспецифической цитотоксичности испытуемых соединений по отношению к клеткам AR-UAS-bla GripTite 293 методом флуоресцентной микроскопии Для проверки активности соединений на клетках культуры AR-UAS-bla GripTite 293 предварительно определяли неспецифическую цитотоксичность. Все вещества растворяли в ДМСО (Sigma). Растворимые вещества добавляли к клеткам в конечных концентрациях 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ. В контрольные лунки добавляли ДМСО в конечной концентрации 0,1% (максимальная концентрация растворителя, при концентрации веществ 10 мкМ). После инкубации клеток в присутствии испытуемых веществ в течение 18 часов в суспензию вносили раствор пропидия иодида в фосфатно-солевом буфере (PBS), инкубировали 5 минут для окраски ДНК мертвых клеток и регистрировали на флуоресцентном инвертированном микроскопе Biozero BZ-8100 (Keyence Corporation, USA) количество видимых клеток (общее число клеток в поле зрения и число мертвых клеток, светящихся красным цветом).
Исходя из соотношения погибших клеток и общего количества клеток, с помощью программы «ImageJ» рассчитывали жизнеспособность анализируемых клеток (в процентах живых клеток от общего числа).
Протокол эксперимента приведен в приложении 3. Исследования антагонистической активности испытуемых соединений Клетки суспендировали в среде OptiMEM с диализованной сывороткой (Invitrogen) до концентрации 3,125х105/мл. В 8-луночные ячейки Labek II с прозрачным стеклянным дном вносили по 160 мкл клеточной суспензии (5х104 клеток в ячейку). В лунки добавляли по 40 мкл испытуемых веществ в концентрации 1 мкМ, разведенных на среде OptiMEM сывороткой, содержащей 1% ДМСО. В контрольные лунки добавляли ципротерона ацетат в концентрации 1 мкМ. Инкубировали 8-луночные планшеты в СО2-инкубаторе (37 0С/5% СО2) в течение 16 ч, после чего к клеткам добавляли 40 мкл субстрата CCF4-AM, подготовленного согласно протоколу производителя (Invitrogen), закрывали планшет для защиты от света и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Протокол эксперимента приведен в приложении 4.
Для анализа клеточного ответа использовали конфокальный микроскоп «Leica» (возбуждающий фильтр 405 нм, эмиссионные фильтры 435±15 нм и 530±20 нм). Каждая экспериментальная проба регистрировалась в четырех повторностях. Для каждой пробы проводилась съемка 8 полей зрения (в течение этого времени жизнеспособность исследуемых клеток не изменялась). Интенсивность зеленой флуоресценции рассчитывали с помощью программы «ImageJ» и рассчитывали соотношение интенсивностей «зеленой» (520 нм) и «синей» (450 нм) флуоресценции (I) клеток для групп опыта и сравнивали данные соотношения с контрольными значениями интактных клеток. В качестве контрольного агониста использовали тестостерона пропионат, в качестве контрольного антагониста – ципротерона ацетат.
