Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Антиоксиданты и методы их оценки
1.1. Общая характеристика 10
1.2. Природные антиоксиданты 12
1.2.1. Флавоноиды 12
1.2.2. Аскорбиновая кислота 16
1.2.3. а-Токоферол 18
1.2.4. Глутатион 19
1.3. Оценка антпоксидантной (антирадикальной) активности 20
1.3.1. Эквивалент антпоксидантной активности по тролоксу (ТЕАС) 21
1.3.2. Методы оценки антиоксидантной активности 22
Глава 2 Исследование антирадикальной активности ряда флавоноидов и эндогенных антиоксидантов с использованием радикал-катионов ABTS + 32
2.1. Объекты исследования 33
2.1.1. Многокомпонентные фитопрепараты 33
2.1.2. Индивидуальные соединения 36
2.1.3. Композиционные составы 39
2.2. Способ оценки антирадикальной активности по отношению к предварительно генерированным радикал-катионам ABTS*+ (деколоризационный способ) 40
2.2.1. Физико-химические основы деколоризационного метода 40
2.2.2. Валидация методики, основанной на предварительном генерировании радикал-катионов ABTS*+ 44
2.2.3. Определение антирадикальной активности исследуемых объектов деколоризационным методом 47
2.2.3.1. Антирадикальная активность индивидуальных соединений 49
2.2.3.2. Антирадикальная активность диквертина и пикногенола 50
2.2.3.3. Антирадикальная активность композиций на основе диквертина и его компонентов 53
2.3. Способ оценки антирадикальной активности основанный на измерении индукционного периода (кинетический способ) 63
2.3.1. Физнко-химические основы кинетического метода 63
2.3.2. Валидация кинетической методики 71
2.3.3. Определение антирадикальной активности исследуемых объектов кинетическим методом 79
2.3.3.1. Антирадикальная активность индивидуальных соединений и диквертина 80
2.3.3.2. Антирадикальная активность композиций диквертина с некоторыми эндогенными антиоксидантами 81
2.4. Взаимосвязь «структура-антирадикальная активность» 88
2.5. Сравнительная характеристика двух способов определения антирадикальных свойств 105
Глава 3 Экспериментальная часть 115
3.1. Материалы и методы 115
3.2. Приготовление образцов 115
3.3. Экспериментальные процедуры 116
3.3.1. Деколоризационный метод 116
3.3.2. Кинетический метод 118
3.4. Методики количественных расчетов 120
3.4.1. Методика расчета степени отклонения от аддитивной суммы вкладов компонентов композиции (деколоризационный способ) 120
3.4.2. Методика расчета степени отклонения от аддитивной суммы вкладов компонентов композиции (кинетический способ) 121
3.4.3 Методика расчета количества восстанавливаемых антиоксидантом молекул радикал-катиона ABTS'+ 123
Выводы 125
Литература 128
- Флавоноиды
- Оценка антпоксидантной (антирадикальной) активности
- Способ оценки антирадикальной активности по отношению к предварительно генерированным радикал-катионам ABTS*+ (деколоризационный способ)
- Экспериментальные процедуры
Введение к работе
Избыточная продукция свободных радикалов в организме является центральным фактором риска сердечно-сосудистых, онкологических заболеваний, атеросклероза, гипертонии и других патологий. Необходимость коррекции заболеваний, в патогенезе которых ведущую роль играет свободнорадикальное окисление, определяет актуальность поиска перспективных средств антиоксидантной фармакотерапии. Среди экзогенных природных антиоксидантов (АО) ведущее место занимают флавоноиды, которые, как правило, обладают широким спектром биологического действия и антирадикальной активностью (АРА). На протяжении ряда лет на кафедре органической химии в содружестве с другими научными учреждениями ведутся работы по созданию флавоноидсодержащих фитопрепаратов. Одним из таких препаратов является диквертин - новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство, представляющее собой флавоноидный экстракт из древесины лиственницы сибирской с доминирующим содержанием дигидрокверцетина. В последние годы наметился интерес к созданию композиций природных АО с целью оптимизации их использования в лечении и профилактике патологий, вызванных оксидативным стрессом.
Проблема скрининга антиоксидантной активности природных соединений и оценки их эффективности является актуальной задачей для выявления механизмов их биологического действия и для создания препаратов на их основе. Одним из методологических подходов в рамках этой задачи является изучение АРА как одной из составляющих антиоксидантной активности потенциальных АО. В настоящее время разработаны разнообразные методы оценки АРА как индивидуальных соединений, так и композиционных смесей. Однако получаемые разными методами результаты не всегда сопоставимы и зависят от выбранного методологического подхода и способа оценки. Для эффективного поиска перспективных АО необходимо применение таких методов, которые позволяют не только проводить оценку
АРА индивидуальных соединений и многокомпонентных смесей, но и выявлять возможность проявления синергизма или антагонизма как компонентов, входящих в состав композиций, так и компонентов с эндогенными АО. В настоящей работе для решения этой проблемы развиты два методологических подхода, основанных на применении радикал-катионов 2,2/-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) диаммониевой соли (ABTS"+) для характеристики АРА в условиях in vitro.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в характеристике общей антирадикальной активности ряда флавоноидов, эндогенных АО и композиций диквертина и его компонентов с эндогенными АО на основании их ингибирующей способности по отношению к генерируемым в модельных условиях радикал-катионам ABTS'+.
В соответствии с поставленной целью разработаны две стратегии характеристики АРА: (1) способ, основанный на предварительном генерировании радикал-катионов ABTS'+ и последующем измерении восстанавливающей способности изучаемых объектов в фиксированной временной точке (деколоризационный способ), и (2) способ, основанный на генерировании радикал-катионов ABTS'+ в присутствии потенциальных АО (кинетический способ).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
Обосновать применимость каждого из двух способов для адекватной оценки АРА индивидуальных соединений и многокомпонентных составов.
Валидировать методики измерения ингибирующей способности потенциальных АО для каждого из двух способов.
Охарактеризовать АРА ряда флавоноидов и эндогенных АО (аскорбиновой кислоты, глутатиона, а-токоферола).
Выявить параметры, пригодные для скрининга АРА потенциальных АО, и параметры, отражающие взаимодействие компонентов композиционных составов.
Произвести оценку АРА композиций диквертина и его компонентов с эндогенными АО. Выявить возможный синергизм или антагонизм антирадикальных свойств компонентов композиций.
Выявить в ряду флавоноидов взаимосвязь «структура -антирадикальные свойства».
Научная новизна. Обоснована валидность двух спектрофотометрических методов характеристики АРА индивидуальных соединений, многокомпонентных смесей и композиционных составов, основанных на способности ингибировать генерируемые в модельных условиях радикал-катионы ABTS*+.
Дана оценка АРА ряда флавоноидов, эндогенных АО,
многокомпонентных смесей и композиционных составов,
охарактеризованная показателями ТЕАС, IC50 и удельной ингибирующей концентрации. Установлено, что АРА исследованных объектов изменяется в ряду: кверцетин > морин > апигенин > дигидрокверцетин > диквертин > нарингенин > пикногенол > рутин > аскорбиновая кислота > глутатион > а-токоферол. Охарактеризована взаимосвязь «структура - антирадикальные свойства» в ряду исследованных флавоноидов.
Получены кинетические кривые развития радикал-катионов ABTS'+b присутствии исследованных объектов, охарактеризована степень и скорость, с которой исследованные объекты восстанавливают данные радикал-катионы.
Обнаружен значительный синергизм композиции диквертин-глутатион, и незначительный антагонизм композиции диквертин—аскорбиновая кислота. Величина эффекта зависит от соотношения концентраций компонентов композиции.
Для композиции диквертин-а-токоферол установлено, что АРА композиции соответствует рассчитанной аддитивной сумме вкладов ее компонентов. Кинетические кривые свидетельствуют, что вначале расходуется быстрореагирующий а-токоферол, а затем компоненты диквертина.
Практическая и теоретическая значимость. Валидированная методика оценки АРА, основанная на предварительном генерировании радикал-катионов ABTS"+, позволяет осуществлять скрининг потенциальных АО и может служить как простой, надежный и воспроизводимый метод для исследования как индивидуальных веществ, так и многокомпонентных смесей, в том числе природного растительного сырья и фитопрепаратов.
Предложенная методика изучения кинетического поведения соединений с АРА, основанная на генерировании ABTS*+ в присутствии потенциальных АО и, дополняет арсенал методов исследования АРА и может использоваться для изучения особенностей взаимодействия компонентов сложных смесей и выявления механизма их действия.
Характеристика АРА ряда флавоноидов и эндогенных АО, полученная в настоящем исследовании, может использоваться при разработке новых препаратов антиоксидантного действия.
Основные положения, выносимые на защиту.
Обоснование применимости двух спектрофотометрических способов оценки АРА для характеристики антирадикальных свойств соединений и многокомпонентных составов.
Валидированные методики определения АРА, основанные на предварительном генерировании радикал-катионов ABTS'+ и последующем измерении восстанавливающей способности, и на генерировании радикал-катионов в присутствии потенциальных АО.
Способы расчета основных показателей АРА.
Характеристика общей АРА ряда флавоноидов и эндогенных АО в различных показателях.
Результаты изучения кинетических зависимостей проявления антирадикальных свойств исследованных объектов.
Результаты исследования взаимодействия компонентов композиций диквертина и флавоноидов с аскорбиновой кислотой, глутатионом и а-токоферолом.
Тенденции взаимозависимости «структура - антирадикальные свойства» в ряду флавоноидов.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры органической химии ММА им. И.М. Сеченова: «Физико-химические основы стандартизации и биотрансформации лекарственных средств и биологически активных добавок к пище». Номер госрегистрации 012006 06 352.
Флавоноиды
Среди экзогенных природных антиоксидантов важное место занимают флавоноиды, которые, как правило, обладают широким спектром биологического действия. Изучению антиоксидантных свойств флавоноидов посвящено громадное количество работ [69, 79, 103, 105, 120, 124, 126-129]. Природа антиоксидантных свойств флавоноидов сложна и многогранна и будет рассмотрена в сопоставлении с собственными данными в разделе 2.4.
В настоящее время насчитывается свыше 8000 флавоноидных соединений. Флавоноиды широко распространены в растительном мире. Особенно богаты флавоноидами высшие растения [151-153]. Находятся флавоноиды в различных органах, но чаще в надземных: цветках, листьях, плодах; значительно меньше их в стеблях и подземных органах (солодка, шлемник байкальский, стальник полевой). Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5%, иногда достигает 20% (в бутонах софоры японской). В растениях флавоноиды встречаются в виде гликозидов и в свободном виде [24].
В медицинской практике используют следующие виды лекарственного растительного сырья, содержащие флавоноиды: цветки и плоды боярышника, трава пустырника, цветки и плоды софоры японской, лист чая, цветки бессмертника, трава горца почечуйного, трава горца перечного, трава горца птичьего, цветки пижмы, корень стальника, трава хвоща полевого, цветки василька синего, трава череды трехраздельнои, корень солодки, трава астрагала шерстистоцветкового, трава сушеницы топяной, корень шлемника, цветки липы, плоды цитрусовых (лимон, мандарин), трава зверобоя [4, 24].
В нашей стране ведущим центром, занимающимся как проблемами лекарственного растениеводства, так и созданием лекарственных средств на основе растительного сырья, является Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР). Здесь разработано более 100 препаратов, большинство из которых относится к группе флавоноидсодержащих лекарственных средств [44].
Углеродный каркас флавоноидов включает два бензольных кольца А и В, соединенных пропаноидной цепью, которая может быть частью кислородсодержащих гетероциклов (кольцо С). В зависимости от степени окисления и гидроксилирования пропанового скелета Сб-Сз-Сб и положения фенильного радикала (В) флавоноиды делятся на несколько групп. Собственно флавоноиды (эуфлавоноиды) являются наиболее многочисленной группой в семействе флавоноидов. Изофлавоноиды являются структурными изомерами эуфлавоноидов по положению фенильного заместителя кольца В. Эуфлавоноиды Изофлавоноиды Многообразие, присущее флавоноидным соединениям, обусловливается большим числом способов замещения базовой структуры. Наиболее типичной функциональной группой является гидроксильная. Гидроксизамещение характерно как для бензольных колец А и В (причем наличие гидроксильных групп в положениях 5 и 7 кольца А обязательно, что обусловлено их биогенезом), так и для гетероциклического кольца С в положении 3. Также существует множество моно-, ди-, и полиметоксизамещенных флавоноидов. При участии гидроксильных групп, находящихся в положениях 3, 7 и 4 , может происходить гликозилирование флавоноидных соединений-агликонов с образованием гликозидов. В качестве углеводной части выступают моно-, ди- и реже трисахариды. Моносахаридами являются углеводы, обычные для растений: D-глюкоза, D-галактоза, D-ксилоза, L-рамноза, L-арабиноза. Из биоз наиболее распространены рутиноза, софороза. Наряду с О-гликозидами, в последнее время изучено несколько сотен С-гликозидов флавоноидов [33, 40].
Флавоноиды систематизируются на группы в зависимости от строения кольца С, степени его окисленности (схема 1.1.). Классификационными признаками являются такие элементы структуры, как 3-гидроксигруппа, 4-оксогруппа и двойная связь в положении С-2 и С-3. Флавоны и флаваноны имеют в структуре 4-оксогруппу и отличаются связью между атомами С—2 и С-3. При введении в их структуру 3-гидроксигруппы образуются соответственно флавонолы и флаванонолы. З-Гидроксигруппа также характерна для антоцианов и катехинов, у которых 4-оксогруппа отсутствует.
Характер связывания атомов С-2 и С-3 в кольце С определяет пространственное строение флавоноидов. Наличие двойной связи обусловливает псевдоароматические свойства кольца С, образование единой сопряженной системы и, как следствие, плоскую конфигурацию всей молекулы [97]. Если связь между атомами С-2 и С-3 одинарная, копланарность молекулы нарушается и возникают несколько центров хиральности, что предопределяет существование стереоизомерных форм.
Кверцетин является одним из наиболее распространенных флавоноидов; он содержится в аронии черноплодной, боярышнике, солодке, почечуйном, птичьем и водяном горцах и других растениях. Высокое содержание рутина характерно для софоры японской, бутоны которой являются источниками выделения этого соединения для медицинского применения. Рутин содержится также в пустырнике, вахте, зверобое и т. д. Апигенин и нарингенин входят в состав бессмертника песчаного, цветки которого применяются при острых и хронических заболеваниях печени. Апигенин обусловливает желтую окраску цветков ромашки аптечной. Комплекс флавоноидов, включающий гликозиды кверцетина, нарингенин и ДГК, выделен из травы хвоща. Флавонол морин характерен для семейства тутовых (Могасеае).
Флавоноиды содержатся во многих лекарственных растениях и сборах, а также являются действующими компонентами галеновых и новогаленовых препаратов. Дигидрокверцетин является доминирующим компонентом препарата «Диквертин» [22], входит в состав БАД «Пикногенол» [131]. Рутин и кверцетин выпускаются в виде индивидуальных препаратов, применяемых для профилактики авитаминоза Р и при заболеваниях, сопровождающихся нарушением проницаемости сосудов. Рутин является действующим веществом препаратов «Венорутон», «Анавенол», «Аскорутин». Разработаны различные лекарственные формы кверцетина, такие как таблетки, порошок, липосомальная форма.
Оценка антпоксидантной (антирадикальной) активности
Одним из важнейших аспектов при создании и разработке средств антиоксидантнои терапии является оценка их антиоксидантнои активности. Для характеристики антиоксидантнои активности применяют различные методические приемы, включающие как чисто теоретические (квантово-химический расчет энергии отрыва атома водорода при образовании свободных радикалов) [15, 73], так и разнообразные экспериментальные методы. В подавляющем большинстве методов антиоксидантная активность определяется по отношению к генерируемым в модельных условиях свободным радикалам и, таким образом, отражает радикалулавливающую способность испытуемых соединений. При этом во многих работах не проводится разграничения между антиоксидантной и антирадикальной активностью, хотя, строго говоря, антиоксидантная активность должна оцениваться в биологических системах и не обязательно по отношению к свободным радикалам (влияние на ферменты, генерирующие или утилизирующие АФК). В настоящей работе используется термин «антирадикальная активность», так как используемые нами подходы позволяют характеризовать антиоксиданты по отношению к находящимся в среде радикалам. Далее при обсуждении методов будет приводиться та терминология, которую используют авторы исследований, а также латинская аббревиатура названий методов, которая на сегодняшний день является общепринятой в научной литературе.
Для ранжирования антиоксидантов между собой применяют как абсолютные (например, ІС50), так и относительные (по отношению к веществу стандарту) характеристики антиоксидантной активности. Выбор стандарта антиоксидантной активности имеет принципиальное значение, так как позволяет сопоставлять данные, полученные различными исследователями. В качестве стандартных антиоксидантов разными авторами использовались кверцетин [25], рутин [14], аскорбиновая кислота [47] и др. СНз соон
Наиболее распространенным стандартом является тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) - водорастворимый аналог а-токоферола, а одним из общепринятых показателей оценки антиоксидантной активности - ТЕАС (trolox equivalent antioxidant capacity).
К настоящему времени в литературе накоплен обширный объем информации об антиоксидантной активности соединений, выраженной в единицах ТЕАС, что позволяет значительно расширить возможности для сравнительного анализа данных, полученных разными методами.
Общая характеристика. В большинстве случаев антиоксидантная активность определяется по отношению к генерируемым в модельных условиях свободным радикалам и отражает радикалулавливающую способность испытуемых соединений [122, 125]. Различия методов будут заключаться в выборе модельных радикалов, способах их генерирования и подходах к регистрации взаимодействия радикала с антиоксидантом. К числу сравнительно простых, легко исполнимых и хорошо воспроизводимых относятся спектрофотометрические методы, основанные на способности соединений с АРА восстанавливать генерируемые в модельных условиях радикалы, уменьшая интенсивность их полос поглощения в УФ- или видимой областях спектра.
В настоящее время в литературе описано большое разнообразных подходов к оценке АРА. В литературном обзоре основное внимание уделено наиболее распространенным из них. Далее представлены некоторые модельные системы, используемые для определения антиоксидантной активности.
Спектрофотометрические методы. FRAP метод. Этот метод, первоначально был предложен как метод оценки железо (III) восстанавливающей способности плазмы [53], а затем железо (III) восстанавливающей антиоксидантной активности [52]. Он основан не на ингибирующей способности антиоксидантов по отношению к радикалам, а на восстанавливающей способности исследуемых компонентов. При низких значениях рН, в результате восстановления комплекса FemPTZ (FRAP реагента, полученного добавлением к раствору 2,4,6-три(2-пиридил)-1,3,5-триазина (TPTZ) хлорида железа (III), в фосфатном буфере рН 3,6), появляется интенсивное голубое окрашивание, обусловленное поглощением с максимумом при 593 нм [54, ПО]. Реакция неспецифична и любой восстановитель, имеющий более низкий редокс-потенциал, способен восстанавливать Fe PTZ до Fe PTZ. После добавления антиоксиданта инкубирование проводили в течение 8 мин при 37 С; измеряли интенсивность полосы поглощения при 593 нм. Полученное значение сопоставляли с таковым калибровочного раствора FeSC 4. Позже рекомендуемое время инкубирования сократили до 4 мин в виду того, что увеличение поглощения практически заканчивается через 4 минуты после добавления антиоксиданта [53]. К достоинствам метода следует отнести то, что он дает быстрые, воспроизводимые результаты как с плазмой, так и с индивидуальными антиокидантами, измерения проводятся в длинноволновой части спектра, а к недостаткам — невозможность измерения FRAP значений белков сыворотки крови и низкомолекулярных антиоксидантов, содержащих S-H группу, таких как дигидролипоевая кислота, цистеин и глутатион.
Субстратами окисления являлись вещества, содержащиеся в анализируемой плазме. Детектирование осуществляли на кислородном электроде. После добавления плазмы в насыщенный кислородом буферный раствор с кислородным электродом, реакцию окисления инициировали добавлением АВАР. После поглощения примерно 50% кислорода добавляли внутренний стандарт — тролокс — чтобы калибровать систему, после чего измеряли дальнейшее поглощение кислорода. Антиоксиданты, содержащиеся в плазме ингибируют окисление, вызывая задержку - лаг-фазу. Антиоксидантную активность оценивали, сравнивая продолжительность периода индукции исследуемого образца, с таковым тролокса. К недостаткам метода можно отнести длительность анализа одного образца (порядка двух часов), и зависимость получаемых результатов от степени разбавления образца (антиоксидантная активность плазмы росла пропорционально ее разбавлению) [159].
Способ оценки антирадикальной активности по отношению к предварительно генерированным радикал-катионам ABTS*+ (деколоризационный способ)
Спектрофотометрический метод оценки антирадикальной активности включает первоначальное генерирование радикал-катионов ABTS + и регистрацию процесса их ингибирования испытуемыми образцами, которая отражается уменьшением интенсивности поглощения в области 600-900 нм.
Химические превращения, происходящие с ABTS в ходе проведения анализа, представлены на схеме 2.1. Нейтральная молекула ABTS имеет в УФ спектре интенсивную полосу поглощения с максимумом при 345 нм и поглощает в более длинноволновой области. Радикал-катион ABTS"+ (если не учитывать отрицательный заряд сульфонатных групп) генерируется посредством инкубации ABTS с пероксидисульфатом калия. Структурные формулы ABTS +, приведенные в работе [116] свидетельствуют, что инициатор реакции - пероксидисульфат калия отщепляет электрон от непод ел енной пары электронов атома азота гетероцикла ABTS. Неспаренный электрон радикала ABTS + стабилизирован за счет участия в сопряженной системе всей молекулы. Наличие большой хромофорной сопряженной системы отражается в электронной спектроскопии наличием длинноволновых полос поглощения с максимумами при 412, 647, 734 и 812 нм (рис. 2.2., верхняя кривая). Во многих работах [46, 94, 123, 133, 137] приводится оценка молярного коэффициента поглощения для максимума 734 нм (молярной экстинкции, 8734)- Учитывая, что полного превращения ABTS в радикал-катион не происходит и содержание радикал-катиона изменяется во времени, возможна только косвенная оценка Є7з ь которая, по данным авторов, находится в интервале от 10000 до 16000 моль"1 л см"1.
Соединения, обладающие антирадикальными свойствами (например, тролокс), переносят атом водорода на атом азота молекулы ABTS"+. Протонированный атом азота ABTSH исключается из сопряженной системы, что результируется исчезновением поглощения в длинноволновой области. Многие исследователи полагают, что антиоксиданты восстанавливают радикал ABTS"+ в исходную структуру ABTS [11, 47, 93]. В последнее время появились сообщения, что окисление радикал-катиона полифенолами может приводить к образованию продуктов деградации ABTS и ковалентных аддуктов [116, 117].
Измерение АРА. Для сопоставления АРА исследуемых объектов применен общий стандартизованный подход, основанный на их способности ингибировать радикал-катионы ABTS +, что выражается в уменьшении интенсивности характерных полос поглощения в области 600-900 нм. Добавляемые в инкубационную среду анализируемые растворы веществ подавляют поглощение ABTS"+ в соответствии с их АРА (рис. 2.2., нижняя кривая). Экспериментальные условия реакции представлены в разделе 3.3.1.
Специфичность метода заключается в том, что все исследуемые объекты, обладающие антирадикальной активностью, уменьшают оптическую плотность полос поглощения, характерных для ABTS"+ . Эти полосы поглощения находятся в удобной длинноволновой области, где подавляющее большинство объектов и их радикалов не имеет собственного поглощения. Данное заключение подтверждает и то, что взятые в исследование для сравнения образцы окисленной липоевой кислоты и ацетилсалициловой кислоты, не способные восстанавливать ABTS + (не проявляющие АРА), не изменяли интенсивность поглощения ABTS +.
Пригодность метода для оценки антирадикальной активности индивидуальных соединений, многокомпонентных препаратов, сложных композиционных смесей вытекает из широкого круга объектов, используемых в работе. Линейная зависимость метода характеризует способность получения аналитических сигналов (величин оптической плотности) прямопропорциональных содержанию анализируемых веществ в исследуемом образце и их антирадикальной активности. Для каждого из исследуемых объектов получены линейные зависимости процента ингибирования ABTS + от концентрации образца в инкубационной среде. На рис. 2.3. такая зависимость представлена на примере стандарта антирадикальной активности - тролокса. Экспериментальные значения аппроксимированы уравнением у=ах+Ь. Статистическая обработка результатов линейной регрессии проведена в соответствии с рекомендуемыми ГФ XI [12]. Числовые значения величин наклона а и отрезка Ь, а также коэффициент корелляции, охарактеризованы величинами доверительного интервала (Р=0.95). Уравнение линейной регрессии для тролокса: у= 4,03(±0,10)х + 4,б8(±0,97), коэффициент корреляции г=0,990, п=32, где у - степень ингибирования, %, х - концентрация, мкмоль/л. Как видно из рис. 2.3. наблюдается хорошая пропорциональная зависимость между концентрацией тролокса и процентом ингибирования оптической плотности ABTS"+ в интервале 20-70%, который и был выбран нами в качестве аналитической области методики.
Измеряемый непосредственно из спектральных данных показатель -процент ингибирования - отражает степень уменьшения концентрации свободных радикалов ABTS + под воздействием веществ, обладающих АРА. Этот показатель зависит от концентрации вещества, условий проведения эксперимента (например, толщины кюветы) и не пригоден для сравнения результатов, полученных по разным методикам.
Для оценки АРА рассчитывали наиболее общепринятые показатели IC50 и ТЕАС на основании полученных уравнений линейной регрессии, используя интервал концентраций, приводящий к ингибированию ABTS + в диапазоне 20-60%. IC50 {inhibition concentration) - концентрация антиоксиданта, при которой нейтрализуется 50% свободных радикалов. Для расчета величин IC50 в полученные уравнения линейных зависимостей процента ингибирования ABTS + от концентрации объекта подставляли значение степени ингибирования 50%. Следует отметить, что данная характеристика отражает различия в АРА для выборки объектов, исследуемых в одинаковых стандартизованных условиях, но этот показатель сложно использовать для сравнения с результатами, полученными другими методами при разных концентрациях антиоксиданта и по отношению к другим радикалам.
Экспериментальные процедуры
Генерирование радикал-катионов ABTSf . К раствору ABTS в солевом фосфатном буфере (PBS) рН 7,4 с концентрацией 7 ммоль/л добавляли равный объем раствора пероксидисульфата калия в том же буфере с концентрацией 2,5 ммоль/л. Поскольку ABTS и пероксидисульфат калия взаимодействуют в соответствии со стехиометрическими коэффициентами 2:1, используемое соотношение концентраций приводит к полному расходованию инициатора (пероксидисульфата калия), и, наоборот, неполному превращению ABTS в ABTS +. Образование ABTS + начинается сразу, о чем свидетельствует появление зелено-голубой окраски раствора. Максимальная концентрация радикал-катионов ABTS достигается через 6 ч после смешивания [123]. Растворы ABTS"+ относительно стабильны в течение недели при хранении в темноте при комнатной температуре. Конечную концентрацию ABTS + в рабочей смеси готовили таким образом, чтобы поглощение в максимуме при 730 нм составляло 0,7±0,05 единиц оптической плотности (Ь 1 см).
Измерение анткрадикалъной активности. Рабочие растворы исследуемых объектов готовили, создавая такие конечные концентрации в PBS, добавление которых в объеме 5-25 мкл к 3,9 мл раствора ABTS вызывало подавление поглощения ABTS + в интервале от 20 до 60%. После добавления к раствору радикал-катионов раствора исследуемого объекта, емкость с инкубируемой смесью интенсивно встряхивали в течение 15 с, выдерживали в темноте при температуре 30 С в течение 4 мин и затем записывали спектр в интервале 600-900 нм. Конечная точка реакции (4 мин) была выбрана после серии экспериментов, показавших, что восстановление ABTS + антиоксидантами протекает быстро в течение 1-2 мин и практически заканчивается к 4 мин. АРА выражали как процент ингибирования ABTS + (доля, на которую снижается концентрация свободных радикалов в системе под действием соединения, обладающего АРА) по формуле: %ингибирования = 100 (1 — Аг/Аі), где Аі - оптическая плотность раствора ABTS + на длине волны 730 нм без добавления исследуемого образца, Аг - оптическая плотность раствора ABTS + через 4 мин после добавления исследуемого образца.
Для измерения АРА композиционного состава готовили индивидуальные растворы его компонентов с заданной концентрацией в подходящих растворителях. Затем их смешивали и разбавляли метанолом или этанолом, добиваясь нужного мольного соотношения. При этом концентрации компонентов рассчитывали таким образом, чтобы добавление полученного раствора композиции в инкубируемую смесь в объеме 5-25 мкл вызывало подавление оптической плотности полос поглощения радикал-катиона ABTS + на 20-60%.
Инкубационная смесь в растворе PBS. Инкубационную смесь в растворе PBS готовили, добавляя к 3,3 мл раствора ABTS с концентрацией 1,5 ммоль/л в PBS рН 7,4 рабочий раствор антиоксиданта в объеме 5-25 мкл. К полученному раствору добавляли 0,7 мл раствора пероксидисульфата калия в том же буфере с концентрацией 2,5 ммоль/л, взбалтывали в течение 15 сек и записывали кинетику образования ABTS + в максимуме 730 нм. Концентрации реагентов подбирали так, чтобы оптическая плотность инкубационной смеси без добавления раствора антиоксиданта к 15-й мин составляла 1,24±0,05 (Ь 1 см) (рис. 3.1,),
Инкубационная смесь в этаноле. Для возможности исследования соединений плохо растворимых в PBS, в частности а-токоферола, разработаны условия для анализа инкубационной смеси в этаноле. Спектр радикал-катиона ABTS + в этаноле представлен на рис. 3.2. К 3,5 мл раствора ABTS с концентрацией 4,75 ммоль/л в этаноле добавляли рабочий раствор антиоксиданта в объеме 5-25 мкл. К полученному раствору добавляли 0,5 мл раствора пероксисульфата калия в PBS с концентрацией 1,15 ммоль/л, взбалтывали в течение 15 сек и записывали кинетическую кривую при 747 нм (максимум поглощения ABTS + в инкубационной смеси в этаноле, рис. 2.6.). Концентрации реагентов подбирали так, чтобы оптическая плотность инкубационной смеси без добавления раствора антиоксиданта к 15-й мин составляла 0,43±0,03 (толщина кюветы 1 см) (рис. 3.3-.).
Все измерения проводили при температуре 22 С. Для приготовления рабочих растворов флавоноиды и а-токоферол растворяли в этаноле, аскорбиновую кислоту и глутатион - в воде деионизированной. Добивались таких концентраций рабочих растворов, добавление которых к инкубационной смеси в объеме 5—25 мкл вызывало задержку появления полос поглощения радикал-катионов ABTS + от 4 до 120 мин.
