Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологически активные добавки и растительное сырье в современной нутрициологии. современные аспекты профилактики и лечения мочевыделительнои системы 10
1.1. Биологически активные добавки к пище и их место в современной нутрициологии 10
1.2. Клинические аспекты применения БАД 14
1.3. Биологически активные добавки, снижающие риск заболеваний мочеполовой сферы 17
1.4. Лекарственные средства растительного происхождения, обладающие гипоазотемическим действием в Государственном реестре лекарственных средств РФ 22
1.5. Краткая характеристика некоторых представителей лекарственных растений, используемых в профилактике и лечении заболеваний мочевы-делительной системы 22
1.5.1. Толокнянка обыкновенная 22
1.5.2. Ортосифон тычиночный (почечный чай) 23
1.5.3. Леспедеца двуцветная 24
1.6. Методы определения некоторых БАВ растений 26
1.7. Стандартизация лекарственного растительного сырья 27
Выводы к главе 1 29
ГЛАВА 2. Разработка и стандартизация растительного средства «чай с леспедецей» 3034
2.1. Выбор оптимальной композиции из лекарственного растительного сырья 34
2.2. Установление диагностических признаков чая методом микроскопии 45
2.3. Товароведческий анализ чая 45
2.4. Фитохимическое изучение чая 47
2.4.1. Идентификация основных БАВ2.
4.1.1. Краткие сведения по химическому составу 47
2.4.1.2. Идентификация БАВ с помощью химических реакций 48
2.4.1.3. Идентификация БАВ методом спектрофотометрии 50
2.4.1.4. Идентификация фенольных соединений методом ТСХ 55
2.4.1.5.Идентификация БАВ методом ВЭЖХ 58
2.4.1.6. Идентификация органических кислот 60
2.4.1.7. Идентификация Сахаров 62
2.4.2. Разработка методик количественного определения основных групп действующих веществ в «Чае с леспедецей» 63
2.4.2.1 Определение суммы флавоноидов
2.4.2.2. Определение содержания арбутина 71
2.4.2.2.1. Определение по ГФ 71
2.4.2.2.2. Определение методом ВЭЖХ 72
2.4.3.Определение содержания полисахаридов 73
2.4.4. Определение содержания органических кислот 78
2.4.5. Определение дубильных веществ 79
Выводы к главе 2 80
ГЛАВА 3. Исследования по получению водных извлечений и разработка способа получения экстракта сухого 81
3.1. Разработка получения водных извлечений из чая 82
3.2. Изучение качественного состава настоя 82
3.3. Изучение показателей качества настоев 83
3.3.1. Определение сухого остатка 83
3.3.2. Определение содержания суммы флавоноидов извлечениях 84
3.3.3. Определение содержания органических кислот 84
3.3.4. Определение количественного содержания полисахаридов 85
3.3.5. Изучение влияния измельченности и технологического режима на качество водных извлечений 86
3.4. Разработка способа получения сухого экстракта
ГЛАВА 4. Стандартизация экстракта сухого
4.1. Определение показателей качества экстракта сухого 97
4.1.1. Идентификация БАВ с помощью качественных реакций 97
4.1.2. Идентификация БАВ методом спектрофотометрии 99
4.1.3. Идентификация синесетина 101
4.1.4. Идентификация флавоноидов 101
4.1.5. Идентификация фенольных соединений 102
4.1.6. Идентификация органических кислот 105
4.1.6. Идентификация органических кислот 105
4.1.7. Идентификация Сахаров 107
4.2. Разработка методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом 109
4.2.1. Определение суммы флавоноидов
4.2.2. Определение содержания арбутина 112
4.2.2.1. Определение арбутина методом ГФ 112
4.2.2.2. Определение арбутина методом ВЭЖХ 113
4.3.Определение содержания полисахаридов 115
4.4. Определение содержания органических кислот 116
4.5. Определение дубильных веществ 119
Выводы к главе 4 120
ГЛАВА 5. Установление показателей качества бад к пище «чай с леспедецеи» и экстракта сухого
5.1. Разработка показателей качества БАД «Чай с леспедецей» 121
5.2. Разработка показателей качества экстракта сухого 128
Выводы к главе 5 134
Общие выводы 133
Список использованной литературы 134
Приложения 154
- Биологически активные добавки, снижающие риск заболеваний мочеполовой сферы
- Разработка методик количественного определения основных групп действующих веществ в «Чае с леспедецей»
- Изучение влияния измельченности и технологического режима на качество водных извлечений
- Разработка методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом
Введение к работе
Актуальность темы
Актуальность разработки и стандартизации растительных средств, предназначенных для профилактики и лечения заболеваний мочевыделительной системы, обусловлена их широким распространением, приводящим к потере трудоспособности, что подчеркивает социально-экономическую значимость проблемы. В России частота заболеваний составляет от 26 до 36 млн. случаев ежегодно (Страчунский, 2004), из них до 90 % мужчин старше 50 лет страдают заболеваниями предстательной железы, почек и мочевого пузыря, а более чем у 70 % женщин пожилого возраста диагностируют пиелонефрит, цистит, мочекаменную болезнь и другие заболевания мочевыделительной системы (Ужегов, 1999). Основные методы лечения вышеуказанных расстройств - адекватная антибактериальная терапия. Прием больными антибиотиков нередко приводит к развитию различных побочных реакций: аллергии, подавление иммунной реактивности организма, развитие устойчивости к антибактериальным препаратам и др. Многие лекарственные препараты растительного происхождения лишены этих недостатков и их использование способствует значительному повышению эффективности базисной терапии. Проведенный анализ существующих лекарственных растительных средств выявил, что используется весьма ограниченный набор лекарственных растительных средств.
Известными фармакопейными растениями, широко используемыми в лечении и профилактике заболеваний мочевыделительной системы являются: ортосифон тычиночный (листья), толокнянка обыкновенная (листья) и леспедеца двуцветная (побеги). Использование этих растений в комплексе позволяет значительно повысить эффект базисной терапии. В ранее проведенных экспериментальных исследованиях был установлен широкий спектр их фармакологической активности: антибактериальный, диуретический, противовоспалительный, гипоазотемический и др.
В связи с вышеизложенным, разработка новых растительных средств является в настоящее время актуальной проблемой и направлена на профилактику хронических заболеваний мочевыделительной системы. Биологически активные вещества растений, преобразуясь в процессе метаболизма в структурные и функциональные элементы клеток, обеспечивают поддержание здоровья, физическую и умственную работоспособность и продолжительность жизни человека. Питание - адекватное возрасту, профессиональной деятельности и состоянию здоровья рассматривается как важнейший фактор профилактики большинства заболеваний человека, в том числе болезней мочевыделительной системы.
Кроме растительных сборов и чаев, широко применяемых в качестве биологически активных добавок (БАД) к пище при профилактике многих заболеваний, используются суммарные сухие экстракты, сохраняющие все преимущества многокомпонентных лекарственных средств. Применение БАД к пище для профилактики заболеваний и для комплексного лечения указанных состояний позволяет существенно сократить применение антибиотиков и других препаратов, избежать осложнений и получить клинический и экономический эффект.
Таким образом, актуальным является проведение информационно-аналитических, фитохимических, фармакогностических, фармакологических и технологических исследований по созданию растительных композиций, улучшающих функциональное состояние мочевыделительной системы.
Целью настоящей работы является разработка способа получения и стандартизация биологически активных добавок к пище в виде растительной композиции «Чай с леспедецей» и экстракта сухого на его основе, рекомендуемых для профилактики заболеваний мочевыделительной системы.
Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие основные задачи:
- обосновать состав и соотношение исходной растительной композиции, предназначенной для профилактики заболеваний мочевыделительной системы;
- провести фармакогностическое изучение исходной растительной композиции для идентификации входящих компонентов, определить критерии подлинности и его показатели качества;
- изучить содержание доминирующих веществ с использованием комплекса физико-химических методов исследования;
- разработать способ получения экстракта сухого из растительной композиции и исследовать влияние основных факторов, влияющих на процессы экстракции биологически активных веществ;
- разработать методики количественного анализа для оценки критериев подлинности и установления их норм для действующих веществ в чае и экстракте сухом;
- разработать нормативные документы на рекомендуемые БАД к пище: технические условия (ТУ), технологические инструкции (ТИ) и рецептуры, с целью внедрения их в производство.
Научная новизна работы
Обоснован рациональный состав и соотношение ингредиентов в многокомпонентной растительной композиции, на основе фармакологических исследований их эффективности и безопасности.
Макро- и микроскопическими методами исследований установлены основные диагностические признаки исходной композиции чая; определены числовые показатели.
С учетом вклада каждого компонента в растительной композиции разработаны методы качественного и количественного анализа, подтверждающие наличие основных групп веществ, характерных для каждого вида сырья.
Определены условия экстракции при получении экстракта сухого из растительной композиции с учетом степени измельчения сырья, типа экстрагента, соотношения сырья и экстрагента, гидродинамических условий, позволяющие разработать рациональный способ получения экстракта сухого со стабильными показателями качества.
Разработаны и предложены методики анализа для контроля качества чая и экстракта сухого. С учётом вклада входящих компонентов разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на лютеолин-7-гликозид; суммы полисахаридов в пересчёте на глюкозу - методом спектрофотометрии; арбутина - методом ВЭЖХ.
На основании полученных результатов составлены нормативные документы на БАД пище «Чай с леспедецей».
Практическая значимость работы
На основании проведенных исследований разработаны и представлены проекты нормативных документов указанных средств:
- Биологически активная добавка к пище «Чай с леспедецей» (Технические условия - ТУ 9370-21-03533369 - 08); Технологическая инструкция (ТИ) по производству БАД к пище «Чай с леспедецей» и Рецептура.
Апробация работы.
Основные положения и выводы диссертационной работы доложены и обсуждены на IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008); 3 international scientific conference «Traditional medicine: а current situation and persrectives of development» (Ulan-Ude, 2008).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 6 научных работах, из них 1 статья в периодическом издании, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
Связь задач исследований с проблемным планом НИР по фармакологии и фармации
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» по теме: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на базе достижений медико-биологических исследований» (регистрационный номер 01.2.006.06.352.)
Основные положения, выносимые на защиту:
- данные по обоснованию и разработке рационального состава и соотношения компонентов растительной композиции;
результаты фармакогностических исследований по установлению критериев подлинности и норм содержания биологически активных веществ в растительной композиции;
материалы по разработке и обоснованию рациональной технологии получения экстракта сухого;
- результаты исследований по стандартизации растительной композиции и экстракта сухого по основным группам действующих веществ.
Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на_153_ страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, который включает __193 источника, в том числе на иностранных языках__62. Работа иллюстрирована _61_ таблицами, ___30__рисунками.
В приложении приведены материалы по внедрению.
Во введении раскрыта актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.
В 1 главе, на основании данных литературы обсуждаются вопросы применения растительных композиций в лечебном питании и профилактике заболеваний мочевыделительной системы, влияния биологически активных веществ (БАВ) растений на течение заболеваний указанной системы; БАВ исследуемой растительной композиции; клинические аспекты применения БАД; группы БАД, представленные в Федеральном реестре; гипоазотемические средства растительного происхождения, внесённые в Государственный реестр.
В Материалах и методах приведены сведения об объектах исследований, используемых методах и приборах, а также другие данные методического характера.
Глава 3 посвящена разработке и стандартизации растительного средства, применяемого при патологии мочевыводящих путей. На основании данных литературы, с учётом опыта народной медицины, а также фитохимических и фармакологических исследований подобран состав и соотношение ингредиентов «Чая с леспедецей». Микро- и макроскопическими методами исследования идентифицированы основные растительные компоненты чая. Качественными реакциями, а также методом хроматографии в тонком слое сорбента подтверждены наличие в чае флавоноидов, сахаров, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, синенсетина, арбутина.
Методом ВЭЖХ идентифицированы флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, арбутин, органические кислоты, сахара. Разработаны и предложены для количественной оценки БАВ методики определения суммы флавоноидов - в пересчёте на лютеолин-7-гликозид; суммы полисахаридов в пересчёте на глюкозу, арбутина, суммы органических кислот, дубильных веществ.
В главе 4 представлены данные по разработке технологии получения экстракта сухого. Изучено влияние различных факторов на процессы одновременного экстрагирования биологически активных соединений из 3 видов лекарственного растительного сырья из «Чая с леспедецей». Подобраны оптимальные условия экстракции, разработан способ получения экстракта сухого, представлена технологическая схема его производства, которая апробирована в лабораторных условиях.
В главе 5 освещены вопросы стандартизации экстракта сухого, рекомендуемого при заболеваниях мочевыводящих путей. Разработаны и предложены для количественной оценки БАВ методики определения суммы флавоноидов - в пересчёте на лютеолин-7-гликозид, суммы полисахаридов - спектрофотометрическим методом; арбутина - методом ВЭЖХ; суммы органических кислот, дубильных веществ - титриметрическим методом.
Глава 6 содержит данные по разработке нормативных документов для БАД «Чай с леспедецей» и экстракта сухого на его основе. Разработаны показатели качества для включения в нормативный документ (ТУ) на БАД к пище «Чай с леспедецей». Методом ускоренного старения и в обычных условиях установлен срок годности в процессе хранения - 2 года. Составлен проект Технических условий на БАД к пище «Чай с леспедецей». Разработана технологическая инструкция на производство БАД к пище. Разработаны показатели качества, вошедшие в нормативный документ на экстракт сухой. Установлен срок годности в процессе хранения экстракта сухого - 2 года. Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы графиками и рисунками.
Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследования служило лекарственное растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации: -
- Побеги леспедецы двуцветной - ВФС 42-1942-89
Lespedezae bicolor Turcz.
- Листья ортосифона тычиночного - ГФ ХI изд., вып.2, ст. 21
(Folia Orthosiphon stameinus Benth.)
- Листья толокнянки обыкновенной - ГФ ХI изд., вып.2, ст. 26
(Folia Arctostaphylos uva ursi L.)
На основе вышеперечисленного сырья созданы смеси, используемые для получения экстрактов, обладающих противовоспалительной, антибактериальной, мочегонной, гипоазотемической активностью. Измельчение воздушно-сухое сырья с содержанием влаги от 6,86 до 10,56 % проводили согласно ГФ ХI изд., вып.1. Отбор средней и аналитических проб проводили согласно – ГФ ХI изд., вып.1, с.267; пробы для определения подлинности, измельченности и содержание примесей составляли – 100 г, влажности – 10 г, действующих веществ и золы – 40 г. Изучение внешних признаков растительных смесей проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, с. 266-267. Микроскопические исследования сборов проводили по методике ГФ ХI изд., вып.1., с. 277.
Сгущение полученных извлечений проводили на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1. Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием пластин «Сорбфил УФ-254» и следующих систем растворителей: 1) хлороформ-метанол 95:5; 2) хлороформ-метанол 9:1; 3) хлороформ-метанол 8:2; 4) гексан; 5) гексан-этилацетат 7:3; 6) этилацетат-уксусная кислота-вода 25:5:5; 7) этилацетат-метилэтилкетон-муравьиная кислота – вода 50:30:10:10; 8) изопропанол-муравьиная кислота-вода 70:6:24. Хроматографирование выполняли в соответствующих системах растворителей при температуре 19-23oС в герметически закрытых стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов осуществляли при помощи микрошприцов. Обнаружение пятен g-пироновых веществ производили после высушивания хроматограмм просмотром в фильтрованном УФ-свете (фильтр lmax = 254 нм) до и после обработки 2 % спиртовым раствором алюминия хлорида. Флавоноиды определяли по желтому окрашиванию (до обработки коричневое). Фенолкарбоновые кислоты обнаруживали по их собственной флуоресценции голубого или фиолетового цвета. Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из пяти измерений. Растворители для хроматографии и реактивы для получения производных использовали марки ХЧ или ЧДА.
Электронные спектры соединений в УФ - и видимой областях записывали на приборе Helios (США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Для регистрации УФ – спектров исследуемых веществ готовили 0,05-10 % растворы в абсолютном метаноле и абсолютном спирте этиловом, а также в 70 % спирте этиловом. При разработке методик качественного и количественного определения были использованы хроматографически чистые вещества и стандарты: арбутин – Fluka, кат. №10960, СО ВИЛАР (ТУ 9363-133-048668-44-01), галловая кислота – Fluka, кат. № 48630, кофейная кислота – Sigma, кат. № 0625, хлорогеновая кислота – Sigma, кат. №3378, феруловая кислота СО – ТУ* 9369-143-0486244-01, апигенин - Fluka, кат. №10748, гесперидин- - Sigma, кат. № 04125, лютеолин ГСО – ФС 42-3130-95, лютеолин-7-гликозид ГСО – ФС 42-3130-95, кверцетин ГСО – ФС 42-290-79, ВИЛАР ТУ 9369-128-04868244-03, рутин ГСО – ФС 42 –2508-87, ВИЛАР ТУ 9369-141 –048668244-02, гиперозид ГСО – ФС 42-0106-03, кемпферол- Fluka, кат. №60010.
ТУ*- разработаны ВИЛАРом.
Идентификация веществ методом ВЭЖХ
Исследования проводили на приборе фирмы «Gilson» с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром для Windows». В работе применяли обращено-фазный вариант метода, в качестве неподвижной фазы использовали металлические колонки «Kromasil» размером 4,6х250 мм; ALTECH OA-1000 Organic Acids, размером 6,5х300 мм: подвижная фаза – метанол- вода - фосфорная кислота (конц.) в соотношении 40:60:0,5; 0,01М и 0,005 М растворов серной кислоты. Анализ проводили при комнатной температуре, скорость подачи элюента – 1 мл/мин. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора при длине волны – 254 нм. Используемые реактивы: метанол - ХЧ, ГОСТ 6995-77; фосфорная кислота – ОСЧ, ТУ 261201400203677-97; ацетонитрил- ЧДА, ТУ 6095497-91; вода очищенная по ФС 42-2619-89.
Биологически активные добавки, снижающие риск заболеваний мочеполовой сферы
Нутрициология (наука о питании здорового и больного человека) основана на физиологии, биохимии и гигиене питания, микробиологии, патологической физиологии, эпидемиологии и других отраслях медицины, имеющих отношение к питанию. Она опирается на представления о причинах и механизмах развития, клиническом течении и профилактике различных заболеваний, особенностях пищеварения и обмена веществ у здорового и больного человека [80].
По мнению Тутельян В.А. [107], в основе современных представлений о здоровом питании должна лежать концепция оптимального питания, предусматривающая необходимость и обязательность полного обеспечения потребностей организма не только в энергии, эссенциальных макро - и микронутриен-тах, но и в целом ряде необходимых минорных пищевых биологически активных компонентов пищи.
Любое отклонение от так называемой концепции оптимального питания приводит к определённому нарушению функций организма, особенно если эти отклонения достаточно выражены во времени [12,79,107].
Проблема оптимизации питания может быть решена только путём дополнительного насыщения рационов питания биологически активными веществами, ведь согласно представлениям современной диетологии, человеческий организм должен получать с пищей более 600 необходимых пищевых веществ [15,16,27]. Одним из самых простых и доступных способов оптимизации питания является использование биологически активных добавок к пище (БАД) -природных или аналогичных природным комплексов, которые необходимы для и обеспечения физиологически оптимального функционирования человеческого организма и которые современный человек недополучает с пищей [12,28,80].
Практически БАД к пище представляют собой функциональные ингредиенты или выделенные из них биологически активные вещества (БАВ) в концентрированном виде — те же самые компоненты, которые вводятся в продукты для их обогащения или придания им функциональных свойств [12,34,48,52,104].
Тутельян В.А. с соавт. (1999) определяют БАД к пище как концентраты натуральных, или идентичные натуральным, комплекс биологически активных веществ, включая эссенциальные пищевые вещества, предназначенные для непосредственного приема или введения в состав пищевых продуктов [104,105,108].
БАД по своей природе могут быть продуктами растительного, животного, минерального, микробного происхождения или иметь комбинированный состав [80,106,110,113]. Они позволяют восполнить алиментарные дефициты современного человека и пополнить его рацион необходимыми организму витаминами, минеральными веществами, микроэлементами, растительными волокнами и другими ингредиентами [12,29,109]. Важной особенностью биологически активных добавок к пище является то, что они представляют собой эволюцион-но предопределенный сочетанный и комплементарный набор экзогенных биологически активных веществ, адекватно влияющий на метаболические системы организма в условиях реального пищевого и экологического статуса [104,109,154,155].
БАД к пище являются важным элементом оптимизации питания с целью укрепления здоровья, снижения риска развития заболеваний и их диетотерапии. Установлено, что применение БАД снижает риск развития диабета, атероскле роза, сердечно-сосудистых и других заболеваний, т.е. заболеваний, которые оп ределяют уровень смертности в большинстве развитых стран мира [12,29,34747,56,80]: В Японии, где Б АД применяются более 50 лет, самая высокая в мире продолжительность жизни. В США БАД применяются около 20 лет, и там продолжительность жизни постоянно растет. К сожалению, поливитаминные препараты ежедневно принимает не более 3 % населения России, в то время как в Европе - не менее 50%, в США - 80%. За последние несколько лет 100 млн. американцев стали использовать их регулярно [89].
БАД к пище имеют ряд преимуществ по сравнению с другими способами оптимизации питания: 1. Они позволяют быстро восполнить дефицит биологически активных веществ, содержание которых было понижено нерациональной диетой, не по вышая при этом калорийность питания [12,16,49,78]. 2. Индивидуализировать подбор оптимальных соотношений биологически активных веществ каждому конкретному человеку с учетом пола, возраста, физиологических потребностей, состояния здоровья, среды обитания независимо от места проживания, времени года и при адекватных материальных затратах [88,89,96]. 3. Проводить оптимизацию питания, в том числе и с лечебной и лечебно-профилактической направленностью, не только в стационарах, санаториях или в диспансерных условиях, но и в домашних условиях, не изменяя или незначительно изменяя при этом привычный рацион питания [97,100,107]. 4. Биологически активные вещества в БАД находятся в компактной форме (в виде капсул, таблеток, порошков, жидких концентратов), приспособлены для транспортировки, длительного хранения, имеют строго регламентированный состав, который контролируется [104,105,110]. В МУК 2.3.2.721-98 приводится деление БАД на нутрицевтики и пара-фармацевтики. Нутрицевтические средства рассматриваются как источники пищевых веществ. При этом содержание витаминов не должно превышать суточную по требность-болеечем в три раза для витаминов-А, Б, В„ В2, В6, В2,-Ниацина, фо 13 лиевой кислоты, пантотеновой кислоты, биотина и не более чем в 10 раз - для витаминов С и Е [11,27,56,79,97]. БАД - парафармацевтики в большинстве случаев являются источниками природных компонентов пищи, не обладающих питательной ценностью, однако относящихся к незаменимым факторам питания - органическим компонентам пищевых и лекарственных растений, продуктов моря и компонентов животных тканей [78,89,104,107]. Реже действующие начала БАД-парафармацевтиков могут быть получены биотехнологическими или химическими способами. Суточная доза парафармацевтических средств не должна превышать разовую терапевтическую дозу, определенную при применении этих веществ в качестве лекарственных средств, при условии приема БАД не менее двух раз в сутки (МУК 2.3.2.721-98).
Разработка методик количественного определения основных групп действующих веществ в «Чае с леспедецей»
По данным литературы, в растениях, входящих в исходную композицию «Чая с леспедецей», содержатся следующие БАВ: Побеги леспедецы содержат флавоноиды (до 2,5 %), из которых выделены ориентин, гомоориентин, кверцетин, биокверцетин, сапонаретин, витексин, кемпферол, леспедин. Помимо флавоноидов, найдены фенолкарбоновые кислоты, катехины, микроэлементы [3,35,36]. Листья почечного чая содержат гликозид ортосифонин (до 0,01%), алкалоиды, жирное масло (до 2,7%), винную кислоту (до 1,5%), лимонную кислоту, эфирное масло (0,2-0,66%), сапонины, после омыления которых выделены а-амирин, в-ситостерин и следы танина [3,99,101,183] . Листья толокнянки содержат арбутин, метил-арбутин, свободный гидрохинон (в сумме 8 — 16 %, иногда до 25 %), дубильные вещества пиро-галловой группы (30-35 %), галловую (6 %), эллаговую, хинную, урсоловую (0,4 - 0,8 %), муравьиную и другие кислоты, эллаготанин, галлотанин, эфирное масло (0,01 %), уваол, гиперозид, кверцетин, изокверцетин, мири-цитрин, мирицетин, витамин С (256 - 629 мг %)[56,67]. Анализ литературы показал, что отдельные компоненты, составляющие изучаемую растительную композицию, обладают широким набором БАВ различных химических групп. Опираясь на полученные результаты фармакологического скрининга и исходя из поставленных задач, из большого множества биологически активных веществ содержащихся в чае, основное внимание уделялось подробному анализу доминирующих активных соединений из группы: полифенольных соединений, органических кислот, Сахаров. Для подтверждения основных групп биологически активных веществ чая были проведены реакции с водным извлечением (соотношение сырье: экстрагент — 1:10) на основные группы биологически активных веществ, используя известные фармакопейные методики. На основании проведенных исследований для определения подлинности «Чая с леспедецей» предлагается включить следующие качественные реакции: - к 2 мл водного извлечения прибавляют несколько капель раствора железо-аммониевых квасцов, наблюдается черно-зеленое окрашивание (дубильные вещества); - к 1 мл водного извлечения прибавляют 1 мл 95 % спирта, 0.1 г порошка магния и 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты; постепенно появляется красное окрашивание (флавоноиды); - к 1 мл фильтрата прибавляют 2 мл реактива Феллинга и нагревают до кипения. Выпадает кирпично-красный осадок (сахара); - к 1 мл фильтрата прибавляют небольшой криталлик сульфата закисно го железа; появляется красно-фиолетовое, затем темно-фиолетовое окрашива ние и, наконец, тёмно-фиолетовый осадок (арбутин). Результаты качественных реакций на наличие основных БАВ в данной композиции предполагает наличие флавоноидов, Сахаров, дубильных веществ, арбутина. Результаты качественного анализа приведены в табл. 2.4.1.2.10. Для подтверждения подлинности «Чая с леспедецей» были использованы так же следующие методы идентификации БАВ: 1. Спектрофото-метрия фенольных соединений; 2. ТСХ фенольных соединений; 3. ТСХ си-несетина; 4. ВЭЖХ органических кислот; 5. ВЭЖХ Сахаров; 6. ВЭЖХ фенольных соединений. Спектрофотометрическое исследование «Чая с леспедецей» в УФ области спектра проводилось с использованием водно-спиртового извлечения. Методика эксперимента: 10,0 г чая, измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито 2 мм, помещали в колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 70 мл 70 % спирта этилового, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр и объём доводили соответствующим растворителем до метки (раствор А). 1,0 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 500 мл доводили соответствующим растворителем до метки и перемешивали. Спектр поглощения полученного раствора снимали в диапазоне длин волн 220-450 нм на саморегистрирующем спектрофотометре ГЕЛИОС (USU) в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм.
Параллельно снимались УФ спектры растворов РСО рутина, кверцетина, кофейной, галловой, хлорогеновои кислот, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, кемпферола, апигенина, гиперозида, галловой кислоты, глицирризиновой кислоты, ликвирозида, ликвиритогенина в 70 % этиловом спирте и водно-спиртовых извлечений составных компонентов чая.
Для приготовления рабочих стандартных образцов 0,05г (точные навески по массе) РСО рутина, кверцетина, кофейной, галловой, хлорогеновои кислот лютеолина, лютеолин-7-гликозида, кемпферола, апигенина, гиперозида, галловой кислоты, глицирризиновой кислоты, ликвирозида, ликвиритогенина помещали в мерные колбы объемом 100 мл, прибавляли по 50 мл 70 % спирта этилового перемешивали до растворения рутина, кверцетина, кофейной, галловой, хлорогеновои кислот, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, кемпферола, апигенина, гиперозида, галловой кислоты, глицирризиновой кислоты, ликвирозида, ликвиритогенина и доводили до метки тем же растворителем. 1,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу объёмом 100 мл прибавляли 50 мл 70 % спирта этилового, перемешивали и доводили тем же растворителем до метки. Для получения водно-спиртового извлечения составных компонентов чая - по 10,0 г листьев ортосифона тычиночного, листьев толокнянки, побегов лес педецы измельчённых до размера частиц, проходящих сквозь сито 2 мм, по мещали в колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 70 мл 70 %, спирта этило вого, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водя ной бане в течение 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр и объём доводили соответствующим растворителем до метки (раствор А). """.
Изучение влияния измельченности и технологического режима на качество водных извлечений
Для идентификации- синенсетина. БАВ ортосифона тычиночного: 0,5г сухого экстракта помещали в колбу вместимостыо 50 мл прибавляли 10 мл спирта метилового и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течении 60 минут. Полученное извлечение фильтровали, фильтрат упаривали на кипящей водяной бане до объёма 2 мл (исследуемый раствор).
Парралельно готовили раствор сравнения синенсетина в спирте метиловом; для этого 2 мг синенсетина растворяли в 2 мл спирта метилового. По 10 мкл исследуемого раствора и раствора сравнения наносили на линию старта хроматографической пластины кизельгеля (Kieselgel 40 F254; Е.Мегк, Darmstadt) на расстоянии 1,5 см от края (извлечение наносят полосой, растворы свидетелей - в точку). Пластинку подсушивали на воздухе в течение 2-3 минут и хроматографировали в системе растворителей: толуол-этил ацетат-метанол в соотношении 55:40:5. Длина пробега растворителей 10 см. Детектирование проводили при длине волны 365 нм. На уровне зоны свидетеля синенсетина и в исследуемом растворе была обнаружена зона голубого свечения с Rf около 0,35. В исследуемом растворе обнаружены неидентифицированные зоны, расположенные ниже и выше зон синенсетина.
Идентификация флавоноидов. 0,5 г экстракта сухого помещали в колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 10 мл спирта этилового 50 %. Колбу присое диняли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане 30 минут при периодическом перемешивании. Жидкость охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр. 5 мкл извлечения и 1% ных спиртовых растворов свидетелей: рутина, кемпферола и лютеолин-7 гликозида наносили на пластинку кизельгеля (Kieselgel 40 F254; Е.Мегк, Darm stadt) на расстоянии 1,5 см от края (извлечение наносят полосой, растворы сви детелей - в точку). Пластинку подсушивали на воздухе в течение 2-3 минут и хроматографировали в системе растворителей: этилацетат : уксусная кислота : вода (25 : 5 : 5) 1 час восходящим способом (предварительное насыщение каме ры 1 час). Длина пробега растворителей 15 см. Затем пластинку вынимали из камеры, высушивали lia воздухе и просматривали в УФ-свете при длине волны 360 нм. На хроматограмме спиртового извлечения из чая видны 4 пятна различного цвета, из них: - на уровне ГСО лютеолин-7-гликозида - коричневое (Rf 0,48); - на уровне. РСО кемпферола - желтоватое (Rf 0,98). После обработки пластинки 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревания ее в течение 2-3 минут в сушильном шкафу при температуре 100-105С пятна, соответствующие лютеолин-7-гликозиду и кемпферолу приобретают желтую окраску в видимом свете и ярко-желтую флуоресценцию в УФ-свете. Кроме выше идентифицированных пятен на хроматограмме в описанных условиях при детекции в УФ-свете при длине волны 254 нм обнаружены не-идентифицированные пятна с Rf около 0,10; 0,38; 0,5 5;0,76.(рис). В описанных условиях были получены хроматограммы водно-спиртовых вытяжек из «Чая с леспедецей». Для этого, навеску в 1, 0 г чая помещали в колбу вместимостью 50. мл, прибавляли 10 мл спирта этилового 50 %. Колбу подсоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане 30 минут при периодическом перемешивании. Жидкость охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр. С 5 мкл извлечения проводили исследование, как описано выше. Результаты проведенных исследований приведены в табл. Согласно данным, приведенным в таблице 4.1.4.44, в чае идентифицированы: лютеолин-7-гликозид, кемпферол. Обнаружены общие зоны в извлечении из экстракта и сбора (см. табл. 4.1.4.44). Исследование по изучению экстракта сухого проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе. В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка Kromasil С 18 размером 4,6x250 мм с размером частиц 5мкн. В качестве подвижной фазы метанол-вода-фосфорная кислота конц. в соотношении 40:60:0,5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 1 мл\мин. Продолжительность анализа 80,75 минут. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм. Для исследования 1,0 г экстракта помещали в колбу объёмом 200 мл, прибавляли по 70 мл 70 % спирта этилового, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр и объём доводили растворителем до метки (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,05 % растворов сравнения в спирте этиловом 70%: арбутина, рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолина-7-гликозида, кемпферола, гесперидина галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, апигенина, геспередина, гиперозида, дигидрокверцетина, цикориевой кислоты.
По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по выше приведенной методике. На основании проведенных исследований (данные таблицы и рисунка) можно сделать следующие выводы: в экстракте чая содержатся фенольные соединения: флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты. При идентификации фенольных соединений методом ВЭЖХ при наличиии доступных стандартов идентифицировано 10 веществ. Методом внутренней нормализации в выделенной смеси 30,99 % занимает арбутин, 11,71% кофейная кислота и 11,46 % лютеолин-7-гликозид.
Разработка методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом
Для характеристики БАД «Чай с леспедецей» были предложены следующие показатели качества: описание внешнего вида, органолептические показатели: цвет, аромат, вкус водного извлечения, физико-химические показатели: содержание общей золы, золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте, массовая доля влаги, степень измельчения, отклонение от средней массы, органические примеси, минеральные примеси, массовая доля металло-магнитной примеси, заражённость амбарными вредителями, плесень, затхлость, посторонние запахи и привкусы, показатели безопасности: содержание токсических элементов, содержание пестицидов, содержание радионуклидов, микробиологические показатели; показатели подлинности: микроскопия, качественные реакции на флавоноиды, сумма флавоноидов, в пересчёте на лютеолин-7-гликозид; упаковка, маркировка.
Внешний вид лекарственного растительного сырья и БАД к пище оценивают при дневном свете, либо при ярком исскуственном освещении. Их цвет интенсивность оттенки определяют визуально. 2. Цвет, аромат определяют визуально, вкус определяют в настое, отмечая полноту, степень выраженности, наличие дополнительных оттенков аромата и привкусов. 3. Отбор и подготовка проб для определения токсических элементов по ГОСТ 26929-94. 4. Отбор и подготовка проб для определения микробиологических показателей по ГОСТ 26668-85 и по ГОСТ 26669-85. 5. Микроскопия. Подлинность сырья подтверждается изучением анатомического строения компонентов сбора в соответствии с ГФ XI изд. Вып.1, с.266 со следующими дополнениями: для приготовления микропрепаратов. 6. Качественная реакция. Около 1 г БАД помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл и прибавляют 50 мл 70% спирта этилового. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане в течение 60 минут, охлаждают 10 минут и фильтруют через фильтровальную бумагу в мерную колбу вместимостью 100 мл. Извлечение повторяют ещё раз указанным выше способом и фильтруют в ту же мерную колбу. После охлаждения доводят объём раствора до метки 70% спиртом этиловым (раствор А). К 5 мл раствора А добавляют 0,05 мг порошка магния и 1 мл кислоты хлористоводородной концентрированной. При лёгком нагревании появляется коричневато-красное окрашивание (флавоноиды). 7. Количественное определение суммы флавоноидов. В пересчёте на лю-теолин-7-гликозид, проводят методом спектрофотометрии, основанным на реакции с алюминия хлоридом и спектрфотометрировании полученного комплекса при длине волны 402 нм. Содержание суммы флавоноидов, в пересчёте на лютеолин-7-гликозид не менее 0,2 %. 8. Упаковка. «Чай с леспедецей» фасуется по 21,0 г в пакеты бумажные, из бумаги мешочной по ГОСТ 2228-8IE с подвернутым несколько раз и заклеенным верхним краем или в пакеты полимерные из плёнки полиэтиленовой по ГОСТ 10354-82; или поливинилхлоридной по ГОСТ 25250-88, закрытые методом термосваривания; или в фильтр-пакеты по 1 г размером 5x6 см из термо-свариваемой пористой неразмокаемой бумаги по ТУ 13-7308001-770-88 или в пакеты из бумаги ламинированной по ТУ 13-7310005-20-87 с последующей укладкой по 10-2- штук в коробки картонные, мзготовленные из картона по ГОСТ 7933-89 или бумаги для упаковывания пищевых продуктов на автоматах по ГОСТ 7247-90. Транспортная упаковка в соответствии с ГОСТ 17768-90. В каждую упаковочную единицу с чаем вкладывают инструкцию по применению, либо инструкция по применению наносится непосредственно на упаковку. Транспортная упаковка по ГОСТ 17768-90. 9. Маркировка потребительской упаковки по ГОСТ Р 51074-97. На каждой упаковочной единице с чаем указывают: -наименование предприятия - изготовителя, его подчинённость, товарный знак, обзначение ТУ; - наименование продукции, ингредиентный состав; -номер серии; -массу нетто в граммах; -способ употребления; -дату выпуска; -срок годности; -показания и противопоказания к применению; -штрих-код продукта; -номер регистрационного удостоверения; -юридический адрес предприятия-изготовителя; -указания о способе реализации. -«Соответствует СанПиН 2.3.2.560-96». 10. Транспортная маркировка по ГОСТ 14192-77 с нанесением манипуля ционного знака «Боится сырости». На каждую упаковочную единицу транс портной тары наносят маркировку, характеризующую продукцию с указанием: -товарного знака и наименованием предприятия - изготовителя, его адреса; -наименование чая, массы нетто в упаковочной единице и количества упаковочных единиц в ящике; -массы брутто и нетто в ящике, в кг; -даты упаковки. В каждый упаковочный ящик с чаем вкладывают ярлык с указанием фамилии упаковщика. 11. Условия хранения. Чай должен храниться в сухом, чистом, хорошо проветриваемом помещении. Относительная влажность воздуха не более 70% при температуре +10до+30С. Чай при хранении необходимо перекладывать каждые 3(6) месяцев. Помещение и стеллажи ежегодно должны подвергаться дезинфекции. 12. Нормы числовых показателей для чая, установленные в процессе эксперимента приведены в таблице 5.1.59.
