Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 15
ГЛАВА 1. Современные принципы и средства фармакотерапии и фармакопрофилактики заболеваний мочеполовой системы 15
1.1. Современные представления об этиологии и патогенезе повреждений органов мочеполовой системы 16
1.2. Лекарственные растительные средства в профилактике и лечении заболеваний мочеполовой системы 24
1.3. Анализ номенклатуры, состава лекарственных средств растительного происхождения и биологически активных добавок к пище, применяемых при заболеваниях мочеполовой системы 29
1.3.1. Современные подходы к разработке лекарственных средств и биологически активных добавок к пище 29
1.3.2. Номенклатура, состав, показатели качества растительных лекарственных средств, применяемых при заболеваниях мочеполовой системы 33
1.3.3. Номенклатура, состав биологически активных добавок к пище, рекомендуемых для профилактики мочеполовой системы 38
1.4. Современные аспекты технологического процесса производства сухих экстрактов, гранул, таблеток 40
1.4.1. Сухие экстракты 40
1.4.2. Гранулы в фармацевтическом производстве 42
1.4.3. Таблетки 47
Выводы в главе 1 50
ЧАСТЬ II. Экспериментальная часть 51
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования глава 3. разработка способа получения и стандартизация биологически активной добавки к пище - чай «байкальский-6» 60
3.1. Обоснование состава растительной смеси 60
3.2. Выбор оптимального соотношения компонентов исходной растительной композиции 65
3.3. Разработка технологической схемы получения 68
3.4. Изучение внешних признаков 71
3.5. Микроскопическое исследование чая «Байкальский-6» 72
3.6. Товароведческий анализ растительной смеси 86
3.7. Фитохимическое изучение чая «Байкальский-6» 88
3.7.1. Идентификация основных биологически активных веществ 88
3.7.2. Идентификация веществ методом бумажной и тонкослойной хроматографии 89
3.7.3. Идентификация веществ фенольной природы методом ВЭЖХ 92
3.7.4. Идентификация аминокислот методом ВЭЖХ 93
3.8. Разработка методик количественного определения основных групп действующих веществ 97
3.8.1. Изучение УФ-спектров водного и водно-спиртовых извлечений чая 97
3.8.2. Подбор условий для разработки методики количественного
определения суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина 101
3.8.3. Количественное определение фенологликозидов методом УФ спектрофотометрии 107
3.8.4. Определение содержания рутина и арбутина методом ВЭЖХ 111
Выводы к главе 3 112
ГЛАВА 4. Разработка способа получения сухого экстракта и таблеток из чая «байкальский -6», и их стандартизация 113
4.1. Подбор оптимальных параметров экстрагирования 113
4.1.1. Корреляция размеров частиц составных компонентов сырья при их совместном экстрагировании 114
4.1.2. Определение параметров экстракции: соотношение сырья и экстрагента, температуры и кратности экстракции 117
4.2. Разработка способа получения сухого экстракта 119
4.2.1. Изложение технологического процесса получения сухого экстракта 119
4.3. Стандартизация сухого экстракта по биологически активным веществам 124
4.3.1. Изучение качественного состава экстракта 124
4.3.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в сухом экстракте 126
4.3.3. Разработка методики количественного определения по сумме фенологликозидов в сухом экстракте 127
4.4. Разработка технологии получения таблеток из сухого экстракта чая «Байкальский-6» 130
4.4.1. Выбор оптимального состава таблеток и способа получения готовой формы .". 130
4.4.2. Технологическая схема получения таблеток 132
4.4.3. Оценка качества таблеток и изучение сроков их годности 135
4.5. Оценка биологической активности чая «Байкальский-6», сухого экстракта и таблеток, получаемых на его основе при помощи ферментных биотест-систем 138
Выводы к главе 4 144
ГЛАВА 5. Разработка профилактического средства - гранул «нефрофит» и их стандартизация 145
5.1. Выбор оптимального соотношения компонентов исходной растительной композиции 145
5.2. Разработка способа получения сухих экстрактов 148
5.2.1 Подбор оптимальных параметров экстрагирования 148
5.2.2. Разработка технологической схемы получения сухих экстрактов 153
5.3. Фармакологическое изучение сухих экстрактов, входящих в состав комплексного средства «Нефрофит» 158
5.3.1. Влияние экстракта горца птичьего на течение постишемических нефропатий 158
5.3.2. Влияние экстракта ортосифона тычиночного на течение постишемических нефропатий 159
5.3.3. Влияние экстракта толокнянки на течение постишемических нефропатий 160
5.4. Выбор количества исходных ингредиентов для создания сухого экстракта «Нефрофит» 162
5.5. Фармакотерапевтическая активность «нефрофита» 163
5.5.1 Влияние экстракта «нефрофита» на течение постишемических нефропатий 163
5.5.2. Изучение антибактериальной активности «нефрофита» 164
5.5.3. Клинические исследования «нефрофита» 164
5.6. Стандартизация сухого экстракта по биологически активным веществам 165
5.6.1. Изучение качественного состава экстракта 165
5.6.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в сухом экстракте 170
5.6.3. Количественное определение суммы фенологликозидов методом УФ-спектрофотометрии 173
5.6.4. Количественное определение арбутина и лютеолина в сухом экстракте методом ВЭЖХ 176
5.6.5. Определение содержания аминокислот в сухом экстракте «нефрофит» 178
5.7. Создание готовой формы - гранул «Нефрофит» 179
5.7.1. Выбор оптимального состава вспомогательных веществ 179
5.7.2. Изложение технологического процесса получения гранул
«Нефрофит» 181
5.7.3. Оценка качества гранул «Нефрофит» 186
5.7.4. Изучение УФ-спектров водно-спиртовых извлечений из гранул
.7.5. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в гранулах «нефрофит» 191
5.7.6. Разработка методики количественного определения суммы фенологликозидов методом УФ-спектрофотометрии 194
5.7.7. Разработка методики количественного определения арбутина и лютеолина в гранулах «нефрофит» методом ВЭЖХ 196
5.8. Оценка биологической активности гранул «нефрофит» при помощи ферментных биотест-систем 197
Выводы к главе 5 198
ГЛАВА 6. Разработка биологически активной добавки к пище - гранул «фитопрост», и их стандартизация : 199
6.1. Обоснование состава растительной смеси 199
6.2. Выбор оптимального соотношения компонентов исходной растительной композиции 200
6.3. Изучение внешних признаков растительной смеси 201
6.4. Микроскопическое исследование растительной композиции 202
6.5. Изучение качественного состава растительной композиции 205
6.5.1. Идентификация основных групп БАВ 205
6.5.2.Идентификация веществ методом бумажной и тонкослойной - хроматографии 206
6.6. Товароведческий анализ сбора 207
6.7. Определение содержания основных групп БАВ в растительной смеси 208
6.8. Разработка способа получения сухого экстракта 209
6.8.1. Подбор оптимальных параметров экстрагирования 209
6.8.2. Корреляция размеров частиц составных компонентов растительной смеси 210
6.8.3. Определение соотношения сырье - экстрагент, температуры и кратности экстракции 212
6.9. Способ получения сухого экстракта 214
6.9.1. Изложение технологического процесса получения сухого экстракта 214
6.10. Стандартизация сухого экстракта по биологически активным веществам 217
6.10.1. Качественное изучение экстракта 217
6.10.2. Хроматографическое исследование экстракта 217
6.10.3. Идентификация фенольных соединений и глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ 218
6.10.4. Изучение УФ-спектров 220
6.11. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в сухом экстракте 223
6.12. Количественное определение суммы фенологликозидов методом УФ-спектрофотометрии 226
6.13- Количественное определение арбутина, апигенина и глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ 229
6.14. Определение аминокислот в сухом экстракте 232
6.15. Ускоренная гидрофобная хроматография в анализе полифенольной фракции сухого экстракта 233
6.16. Создание готовой формы-гранул «Фитопрост» 236
6.16.1. Выбор оптимального состава вспомогательных веществ 236
6.16.2. Изложение технологического процесса получения гранул «Фитопрост» 237
6.16.3. Оценка качества гранул 240
6.16.4. Изучение поглощений вУФ-области 241
6.16.5. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в гранулах «Фитопрост» 243
6.16.6. Разработка методики количественного определения суммы фенологликозидов в гранулах «Фитопрост» 245
6.16.7. Количественное определение арбутина, апигенина и глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ 247
6.17. Оценка биологической активности растительной смеси и гранул « фитопрост» при помощи ферментных биотест-систем 249
6.18. Фармакологическое изучение гранул «Фитопрост»
6.18.1. Изучение специфической активности 250
6.18.2. Клиническое изучение гранул 253
6.19. Экономические аспекты целесообразности производства БАД таблеток сухого экстракта «Байкальский-6», гранул «Фитопрост»,
«Нефрофит» 254
Выводы к главе 6 256
Заключение 257
Общие выводы 260
Список литературы
- Анализ номенклатуры, состава лекарственных средств растительного происхождения и биологически активных добавок к пище, применяемых при заболеваниях мочеполовой системы
- Выбор оптимального соотношения компонентов исходной растительной композиции
- Корреляция размеров частиц составных компонентов сырья при их совместном экстрагировании
- Влияние экстракта горца птичьего на течение постишемических нефропатий
Введение к работе
. Актуальность темы.
Заболевания мочеполовой системы занимают одно из ведущих мест в общей структуре болезней. В настоящее время до 90 % мужчин старше 60 лет страдают заболеваниями почек, мочевого пузыря и предстательной железы, а также около 70 % женщин в возрасте старше 50 лет страдают почечно-каменной болезнью, пиелонефритом, циститом. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), воспалительные заболевания мочевых путей у детей занимают второе место после острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Около 15% женщин в замужестве, во время беременности и родах страдают воспалительными заболеваниями мочеполовой системы. Медико-социальная значимость указанных нозологических форм, помимо их широкой распространенности, обусловлена тем, что они являются одной из ведущих причин инвалидизации и смертности. Синтетические препараты, используемые в базисной фармакотерапии и профилактике заболеваний почек, несмотря на их высокую эффективность, оказывают неблагоприятное воздействие на функциональное состояние мочеполовой сферы. Нередко наблюдается развитие лекарственной устойчивости патогенной микрофлоры к используемым средствам, развитие побочных эффектов, среди них наиболее значимой является нефротоксичность антибиотиков.
В настоящее время выбор средств, оказывающих комплексное нефропротекгорнос действие, весьма ограничен. Природные вещества растительного происхождения, как правило, отличаются широким спектром терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного их применения. Весьма эффективными при терапевтическом и профилактическом использовании являются многокомпонентные растительные препараты и биологически активные добавки к пище (БАД), содержащие биологически активные вещества, относящиеся к разным классам химических соединений и оказывающих комплексное фармакотерапевтическое воздействие на основные звенья патологического процесса. Особенно полезно применение БАД при их превентивном
ИСПОЛЬЗОВаНИИ у ЛИЦ С пгпяЯпгиищ ^nnpnpiff» ппспр ТЯЖСЛЫХ
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ|
ІИБЛЯОТЕКА j
, cncttrtpr Щ \
\ 3 09 H»0utth/ J^
заболеваний и лиц, проживающих в неблагоприятных климатогеографических условиях Сибири и Крайнего Севера. Кроме растительных сборов и чаев, широко используются суммарные сухие экстракты, выгодно отличающиеся рациональностью применения и сохраняющие все преимущества многокомпонентных лекарственных средств: соответствие наличествующих-ингредиентов поливалентности патогенеза заболевания, их синергизм в действии, влияние на организм как корригирующей системы. Получение сухих экстрактов - концентратов с применением современных технологических процессов, обеспечивающих максимальное извлечение всех действующих веществ из исходного растительного сырья, доведение их до удобной для употребления формы будет способствовать рациональному, экономичному использованию растительного сырья, позволит осуществить стандартизацию средств как на стадии изготовления, так и на стадии получения конечного продукта, повысит точность дозирования, удобство при хранении и применении.
Таким образом, научное обоснование разработки и стандартизации БАД, профилактическая эффективность которых обусловлена гармоничным сочетанием биологически активных веществ, содержащихся в растениях, и представляющих собой своеобразные корригирующие системы, является актуальной задачей фармацевтической науки и практического здравоохранения.
Целью настоящих исследований является теоретическое и экспериментальное обоснование разработки и стандартизации комплексных профилактических средств, рекомендуемых для использования при заболеваниях мочеполовой системы.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
разработать новый методический подход к составлению растительных смесей, рекомендуемых для профилактики и лечения заболеваний мочеполовой системы;
с учетом патогенеза заболеваний урогенитальной системы теоретически и экспериментально обосновать выбор оптимальных составов для разработки биологически активных добавок к пище;
изучить химический состав растительных смесей, являющихся объектами исследований, а также получаемых на их основе экстрактов, гранул и таблеток;
установить оптимальные параметры экстракции по выходу биологически активных веществ из сборов, разработать рациональную схему получения сухих экстрактов и готовых форм;
разработать методики количественного определения по сумме действующих веществ в чае «Байкальский - б», сухом экстракте и таблетках; в сухих экстрактах и гранулах «нефрофит» и «фитопрост», для проведения их «сквозной» стандартизации;
- разработать нормативную документацию на БАД: рецептуру, технические условия
(ТУ) и технологические инструкции (ТИ) для их внедрения.
Научная новизна.
Установлены общие закономерности, которые позволили теоретически и экспериментально обосновать новый подход к разработке составов, а также технологию получения биологически активных добавок к пище, рекомендуемых для профилактики заболеваний органов мочеполовой системы, заключающийся во включении в композицию не менее 3 видов лекарственного растительного сырья, с учетом многофакторного механизма развития заболеваний органов урогенитальной сферы и современных принципов регуляции их функций.
С учетом химического состава исходного растительного сырья подобраны оптимальные параметры технологических процессов по получению экстрактов и готовых форм, выявлены закономерности экстрагирования биологически активных веществ.
На основании фармакологических исследований предложены составы для гранул « нефрофит» и « фитопрост», а также для таблеток из чая « Байкальский-6».
Качественными реакциями, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографией, УФ-спектрофотометрией подтверждено наличие биологически активных веществ в чае «Байкальский -б» и получаемых из него форм, в экстрактах и гранулах «нефрофит» и «фитопрост».
В связи с доминированием в изучаемых объектах флавоноидов и фенологликозидов разработана «сквозная» методика их количественной оценки в пересчете на рутин- и арбутин-стандарты методом УФ-спектрофотометрии. Учитывая, что в состав гранул «фитопрост» входят корни солодки, предложена
методика, позволяющая контролировать их качество по содержанию глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ.
Приоритет проведенных исследований защищен патентом РФ на изобретение: «Средство «Чай Бакальский-б», обладающее диуретической активностью и способ его получения».
Практическая значимость:
На основании проведенных исследований получены регистрационные удостоверения в МЗ РФ:
- Биологически активная добавка к пище экстракт почечного чая - РУ №
004724.Р.643.08.2002.
Биологически активная добавка к пище чай «Байкальский - 6» - РУ № 005463.Р.643.06.2003.
Биологически активная добавка к пище гранулы «нефрофит» - РУ № 005449.Р.643.07.2003
- Биологически активная добавка к пище гранулы «фитопрост» - СЭЗ №
77.99.20.919.Б.000677.05.04,
Результаты, полученные в ходе работы, использовались при разработке учебных и учебно-методических пособий «Болеутоляющие (анальгезирующие) средства», Москва-Улан-Удэ, 2003; «Побочное действие препаратов из лекарственных растений», Улан-Удэ, 2002; «Фитотерапия и фитопрофилактика пиелонефрита», Улан-Удэ, 2002.
Связь задач исследования с проблемным планом
Работа выполнена в соответствии с планами научных исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по программе «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока», являющейся разделом (6.3) Государственной программы «Сибирь» на период 199б-2005гг. и Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (ВИЛА?) РАСХН (№ гос. регистрации 0186007445 5) на основании договора о научно-техническом сотрудничестве на период 1993-2010 гг.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на съездах, конгрессах, научно-практических конференциях (Москва - 2001, 2002, 2003, 2004гг.; Санкт-Петербург - 2001, 2004гг.; Пятигорск - 2004г.; Черноголовка, МО - 2002, 2003, 2004гг.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 50 научных работ: из них 1 монография, 1 патент РФ на изобретение, 45 статей и тезисов, 1 учебное и 2 учебно-методических пособий.
Основные положения, выносимые на защиту:
данные теоретических, экспериментальных, фармакологических и клинических исследований по обоснованию необходимости разработки составов, технологии получения сухих экстрактов и готовых форм, рекомендуемых для профилактики и лечения заболеваний органов мочеполовой системы;
результаты исследования химического состава в изучаемых объектах основных групп биологически активных веществ методами УФ - спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ;
результаты анализов по установлению характеристик подлинности и определению показателей качества в сырье, экстрактах, гранулах и таблетках.
Объем и структура диссертации.
Анализ номенклатуры, состава лекарственных средств растительного происхождения и биологически активных добавок к пище, применяемых при заболеваниях мочеполовой системы
Болезни мочеполовой сферы обычно делят на две большие группы: болезни инфекционно-воспалительного характера и болезни, имеющие иммуно-воспалительную основу [183,258,266,267,292]. К инфекционно-воспали-тельным болезням относят: простатит, уретрит, цистит, пиелонефрит, вызывающиеся различными микроорганизмами: стафилококками, стрептококками, кишечной палочкой, хламидиями, вирусами и др. [183,187,291,328]. Заражение может происходить как при непосредственном попадании микробов в мочеполовую систему, так и при заносе их кровью из очагов хронической инфекции (при заболеваниях зубов, хроническом тонзиллите, туберкулезе легких и других состояниях [183,266]. При заболеваниях почек тесно переплетаются как аллергические, так и инфекционные факторы, что усугубляет течение патологического процесса. Учитывая эти обстоятельства, основные моменты лечения больных можно сформулировать следующим образом: борьба с болевым синдромом, инфекцией и воспалением; восстановление физиологического обмена веществ; нормализация артериального давления; борьба с отеками; а также необходимые мероприятия по повышению иммунитета; снижению аллергизации организма [183,266,267,268,287]. Приведенная схема лечения не является правилом, рекомендуется дифференцированный подход, с учетом индивидуальности каждого больного.
Большое значение в профилактике и лечении хронических заболеваний, включая заболевания почек и мочеполовой системы, имеет соблюдение принципа этапности. Так, в начальной стадии заболевания, в период развертывания клинической картины болезни, растительные средства могут быть основными (ведущими), способными предотвратить дальнейшее развитие болезни; в периоде разгара заболевания первое место отводится современным синтетическим (химиотерапевтическим) средствам, а на заключительном этапе реконвалесценции, лекарственные препараты с антимикробным и противовоспалительным действием должны использоваться наряду с растительными средствами, причем по мере улучшения общего состояния все большее место должны занимать средства растительного происхождения [134,141,147,223,316,338,352]. Последние годы ознаменовались значительными успехами в лечении и профилактике заболеваний органов мочеполовой системы благодаря внедрению в медицинскую практику новых лекарственных средств [77,89,106,121, 196,231,235], широкого арсенала диагностических приемов и комбинированных консервативно-хирургических методов лечения, позволяющих добиться значительных результатов [59, 109, 115,161,187].
Наиболее манифестные нарушения морфофункционального состояния почек отмечаются при ситуациях, характеризующихся как острая и хроническая почечная недостаточность [18,209,284]. Причин, приводящих к подобным состояниям, подразделяют на 3 группы: преренальные (связанные со снижением перфузии крови через почки); ренальные (иммунные и неиммунные гломерулопатии, инфекционные и неинфекционные тубуло-интерстициальные заболевания); постренальные состояния (нарушения оттока мочи) [15,18,44,45,49,54,183].
Острая почечная недостаточность (ОПН) является клинико-анатомическим синдромом, развивающимся вследствие осложнения многих заболеваний и патологических состояний. Основным морфологическим признаком ОПН являются повреждения канальцевого аппарата нефрона, а патогенетической основой - острый тубулярный некроз, ведущий к механической обструкции канальцев слущенным эпителием, повышению внутритубулярно-го давления. В результате этого снижается почечный кровоток, развивается спазм афферентной артериолы, падение гидростатического давления и снижение скорости клубочковой фильтрации, вследствие чего возникают водно-электролитные нарушения и развивается ацидоз. Ведущим механизмом в патогенезе ОПН считают ишемию почечной ткани. В результате ишемии и гипоксии почечной ткани развиваются нарушения процессов энергообеспечения клеток, в частности процессов окислительного фосфорилирования. Лечение и предупреждение ОПН, являющееся результатом нарушения почечного кровообращения и действия нефротоксинов, основывается прежде всего на ликвидации причин ее развития: снижении действия нефротоксинов и предотвращении циркуляторных нарушений с одновременным снижением уремической аутоинтоксикации и нормализацией обменных процессов. Для этой цели используется комплекс консервативных мероприятий, включая средства патогенетического и симптоматического характера, направленных на восстановление водно-электролитного баланса, кислотно-щелочного равновесия, снижение белкового катаболизма, профилактику инфекций и сердечнососудистой недостаточности [187,189,254,248].
Тяжелейшим осложнением заболеваний почек является развитие хронической почечной недостаточности (ХПН). По мнению большинства исследователей, среди причин, приводящих к ХПН, является гломерулонефрит. В патогенезе гломерулонефрита ведущее значение придается иммунным нарушениям, приводящим к повреждениям ткани почек, активируя многочисленные системы медиаторов воспаления - гуморальные и клеточные. Развитие прогрессирующего гломерулонефрита, морфологическим эквивалентом которого является гломерулосклероз, включает несколько этапов: взаимодействие гломерулолярных и инфильтрующих клубочек клеток; изменение их с развитием пролиферации . и избыточного накопления матрикса [15,159,180,187,216]. Среди метаболических механизмов развития гломерулонефрита большое значение придается повреждающей роли протеинурии и липидным нарушениям. Основой повреждающего действия протеинурии считают токсическое повреждение мезангиальных клеток макромолекулами белков, профильтровавшимися через базальную мембрану капилляров и дисфункцию клеток проксимальных канальцев, развившуюся в результате перегрузки канальцев белками [12,259,338] .
Выбор оптимального соотношения компонентов исходной растительной композиции
Объектом исследования служило лекарственное растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации: -листья брусники обыкновенной - ГФ XI изд., вып.2, ст. 27 (Folia Vaccinii vitis-idaeae L.); -листья крапивы двудомной - ГФ XI изд., вып.2, ст. 25 (Folia Urticae dioicae L.); -листья ортосифона тычиночного - ГФ XI изд., вып.2, ст. 21 (Folia Orthosiphonis staminei); -листья толокнянки обыкновенной - ГФ XI изд., вып.2, ст. 26 (Folia Uvae ursi L.); -цветки ноготков лекарственных - ГФ XI изд., вып.2, ст. 5 (Flores Calendulae officinalis L.); -корни солодки голой и уральской - ГФ X изд., ст. 573 (Radices Glycyrrhizae glabrae, G.uralensis); -трава горца птичьего - ГФ XI изд., вып.2, ст. 56 (Herba Polygoni avicularis L.). На основе вышеперечисленного сырья созданы смеси, используемые для получения экстрактов и готовых форм в виде БАД, рекомендуемые для профилактики заболеваний мочевыделительной и половой системы. Измельчение воздушно-сухого сырья с содержанием влаги от 9,06 до 12,00% проводили согласно ГФ XI изд., вып.1. Отбор средней и аналитических проб проводили согласно - ГФ XI изд., вып.1, с.267; пробы для определения подлинности, измельченности и содержание примесей - 100 г, влажности - 10 г, действующих веществ и золы — 40 г. Изучение внешних признаков растительных смесей проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, с. 266-267. Микроскопические исследования сборов проводили по методике ГФ XI изд., вып.1.3 с. 277.
Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований проводили на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1.
Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили методом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки «Ленин-градская-М», FN-16, FN-13 (Германия) в системах растворителей: 1. н-бутанол-уксусная кислота- вода 4:1:2; 2. уксусная кислота 15%; Для тонкослойной хроматографии (ТСХ) использовали пластины «Kieselgel 60 F254» и следующие системы растворителей: 3. хлороформ-метанол 95:5; 4. хлороформ-метанол 9:1; 5. хлороформ-метанол 8:2; 6. гексан; 7. гексан-этилацетат 7:3; 8. этилацетат- уксуная кислота-вода 25:5:5; .9. этилацетат-метилэтилкетон-муравьиная кислота-вода 50:30:10:10; 10. изопропанол-муравьиная кислота-вода 70:6:24. Хроматографирование выполняли в соответствующей системе растворителей при температуре 19-23 С в герметически закрытых стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластины и бумажные полосы осуществляли при помощи капилляров. Обнаружение пятен у-пироновых веществ производили после высушивания хроматограмм просмотром в фильтрованном УФ-свете (фильтр А.тах = 254 нм) до и после обработки 2% этанольным раствором алюминия хлорида, а также 5% раствором фосфор-номолибденовой кислоты в абсолютном спирте. Флавоноиды дают желтое и синее окрашивание соответственно (до обработки коричневое). Фенолкарбо-новые кислоты обнаруживаются по их собственной флуоресценции голубого или фиолетового цвета. Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из пяти измерений. Растворители для хроматографии и реактивы для получения производных использовали марки ХЧ или ЧДА. Электронные спектры соединений в УФ- и видимой областях записывали на приборах СФ-46 (Россия), UV-VIS (Германия) и Hitachi (Япония), Gelios (США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Для регистрации УФ - спектров исследуемых веществ готовили 0,05-10% растворы в абсолютном метаноле и абсолютном спирте, а также в 70% спирте.
При разработке методик качественного и количественного определения биологически активных веществ были использованы хроматографически чистые вещества и стандарты: арбутин -Fluka, кат. №10960, СО ВИЛАР (ТУ 9363-133-048668-44-01), галловая кислота - Fluka, кат. №48630, кофейная кислота - Sigma, кат. № 0625, хлорогеновая кислота -Sigma, кат. №3378, феруловая кислота СО - ТУ 9369-143-0486244-01, апигенин- Fluka, кат. №10748, гесперидин- - Sigma, кат. № 04125, глицирризиновая кислота - Fluka, кат. №50531, ВИЛАР ТУ 9369-148-04868244-02, лютеолин ГСО - ФС 42-3130-95, лютеолин-7-гликозид ГСО - ФС 42-3130-95, кверцетин ГСО - ФС 42-290-79, ВИЛАР ТУ 9369-128-04868244-03, рутин ГСО - ФС 42 -2508-87, ВИЛАР ТУ 9369-141 -048668244-02, гиперозид ГСО - ФС 42-0106-03. ТУ разработаны ВИЛАРом.
Корреляция размеров частиц составных компонентов сырья при их совместном экстрагировании
При разработке методики подобраны оптимальные условия извлечения доминирующей группы БАВ. Исследовано влияние способа экстракции, соотношения сырья и экстрагента, концентрации спирта, показателя измель-ченности сбора на выход суммы экстрактивных веществ и флавоноидов.
Масса навески сбора - 3,0 г. Экстракцию проводили на кипящей водяной бане с обратным холодильником. В таблицах приведены средние значения из пяти определений.
Общеизвестно, что показатель измельченности растительного материала является важным фактором влияющим на выход действующих веществ и интенсификацию процесса экстрагирования.
Для изучения влияния измельченности на выход суммы флавоноидов, сырье подвергалось измельчению до размера частиц 0,5 мм; 1,0 мм; 2,0 мм; 3,0 мм; 4,0 мм и 5,0 мм. Результаты представлены в таблице 3.8.2.13 Таблица 3.8.2.13 Влияние показателя измельченности на выход суммы флавоноидов чая «Байкальский-6» Размер частиц, мм Содержание экстрактивных веществ, в % Содержание суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина, в %
Приведенные данные свидетельствуют, что оптимальный размер частиц сырья соответствует 1-2 мм. Соотношение сырье - экстрагент, также оказывает существенное влияние на процесс экстракции. Результаты исследований отражены в таблице 3.8.2.14
Влияние соотношения сырье-экстрагент на выход суммы флавоноидов чая «Байкальский-6» Соотношение сырье-экстрагент Содержание суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина, % Из представленных результатов следует, что соотношение сырье-экстрагент должно быть не менее 1:10. 104
Изучено влияние концентрации и количества раствора алюминия хлорида (А 1С Ь) на полноту протекания реакции комплексообразования. Результаты исследований приведены в таблицах 3.8.2.16 и 3.8.2.17
На основании полученных данных для проведения реакции в дальнейшем используют 2 % раствор алюминия хлорида.
Таким образом, исходя из результатов проведенных исследований, установили, что оптимальными являются следующие параметры: экстрагент -спирт 60 %, двукратная экстракция по 60 минут, размер частиц сырья - 2,0 мм, количество алюминия хлорида - 2 мл при концентрации 2 %.
Таблица 3.8.2.17 Влияние количества 2 % спиртового раствора алюминия хлорида на полноту протекания реакции комплесообразования с суммой флавоноидов сбора Количество А1С1Ъ, в мл Содержание суммы флавоноидов в чае, в пересчете на ГСО рутина и на абс. сухое сырье, в % Методика количественного определения суммы флавоноидов в чае методом УФ-спектрофотометрии Сырье измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм (ТУ 23.2.2068-89).
Около 3,0000 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл спирта 60 %. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем извлечение процеживают через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, избегая попадания частиц сырья на фильтр. Фильтр помещают в колбу для экстрагирования, прибавляют 30 мл спирта 60 % и экстрагируют на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Экстракцию повторяют в тех же условиях, процеживая извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводят спиртом 60 % до метки и перемешивают (раствор А). 2,0 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2 % раствора алюминия хлорида в 96% спирте, доводят объем раствора спиртом до метки и перемешивают (раствор Б).
Через 40 мин. измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 413 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2 мл раствора А; 1 капли 1% уксусной кислоты, доведенной спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: Как видно из данных таблицы, относительная ошибка единичного определения с 95 % вероятностью составляет ±4,35 %. Отсутствие систематической ошибки методики доказано при помощи опытов с добавками ГСО рутина в навеску сырья. Результаты анализа представлены в таблице 3.8.2.19
На основании «опытов с добавками» можно сделать вывод, что относительная ошибка опыта находится в пределах случайной ошибки предложенной методики, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки при определении суммы флавоноидов в чае в пересчете на ГСО рутина. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт в чае «Байкаль-ский-6» должно быть не менее 1,0 %.
В связи с тем, что в состав чая «Байкальский -6» входит сырье толокнянки и брусники, представляется целесообразным разработка методики количественного определения по сумме фенологликозидов в пересчете на арбутин-стандарт методом УФ-спектрофотометрии, позволяющей контролировать качество сбора, как на стадии производства, так и на стадии получения готового продукта.
Для этого, использована способность соединений данного класса, поглощать свет в УФ - области при определенной длине волны. Нами получены спиртовые извлечения чая и арбутина -стандарта в 60 % спирте и установлено, что оптическая плотность растворов при длине волны 254 нм подчиняется законам Бугера-Ламберта-Бера.
Влияние экстракта горца птичьего на течение постишемических нефропатий
Продукт после анализа на соответствие расфасовывают по 1,0 кг в банки оранжевого стекла типа БВ 2000-90-ОС-1 по ОСТ 64-2-77-80. Под крышку вкладывают уплотнительную прокладку из картона марки «А» по ГОСТ 9374-74 и пергамента по ГОСТ 1341-84, крышки обтягивают пергаментом, обвязывают нитками, концы которых заводят под этикетку и заливают парафином по ГОСТ 23689-89. Банки обвертывают бумагой оберточной по ГОСТ 8273-75. На банки наклеивают этикетки из бумаги этикеточной или писчей по ГОСТ 7625-86 или ГОСТ 18510-87.
Готовую продукцию передают на склад, откуда сухой экстракт поступает на участок ГЛС для приготовления лекарственной формы. Хранить экстракт необходимо в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 20С.
Превентивно-курсовое введение экстракта горца птичьего в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг животных на фоне пости 159 шемической нефропатии на 1 сутки не оказывает существенного влияния. На 3 сутки у животных, получавших испытуемый фитоэкстракт, содержание креатинина и мочевины снижалось соответственно на 30 и 26 % по сравнению с контролем. На 7 сутки наблюдали дальнейшее снижение концентрации креатинина и мочевины до значений физиологической нормы. Показано, что введение экстракта сопровождается увеличением диуреза на 1 сутки на 30% по сравнению с контролем.
Превентивно-курсовое введение экстракта ортосифона в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг животных на фоне постишемиче-ской нефропатии оказывает выраженное нефропротекторное действие. Об этом свидетельствует динамика изменений биохимических показателей, характеризующих функциональное состояние почек белых крыс. При этом, на 7 сутки у животных опытной группы концентрация азотистых метаболитов в сыворотке крови снижалась до значений физиологических, тогда как у крыс контрольной группы к указанному сроку была отмечена умеренная азотемия. Так, на 1 и 3 сутки у животных, получавших испытуемый фитоэкстракт, скорость клубочковой фильтрации (СКФ) повышалась соответственно в 2 и 1,5 раза по сравнению с контролем, испытуемый фитоэкстракт оказывает выраженное диуретическое и салуретическое действие, о чем свидетельствуют достоверное повышение концентрации катионов натрия и калия в моче, а также снижение показателей содержания белка в моче крыс опытной группы.
Превентивно-курсовое введение экстракта толокнянки в экспериментально-терапевтической дозе 25 мг/кг животных на фоне постишеми-ческой почечной недостаточности оказывает нефропротекторное действие, нормализуя функциональное состояние почек у белых крыс на более ранних сроках патологического процесса. Под влиянием испытуемого фи-тоэкстракта снижается азотемия, повышается экскреция азотистых метаболитов, увеличивается диурез и салурез, уменьшается протеинурия. Так, диурез у опытных животных на 1 сутки эксперимента был достоверно выше на 28,5 % по сравнению с данными контрольной группы. На 3 сутки отмечалось повышение диуреза, хотя объем выделенной мочи был достоверно ниже значений физиологической нормы. На 7 сутки диурез у животных как опытной, так и контрольной группы достигал значений физиологической нормы. Наряду с этим, курсовое введение экстракта толокнянки оказывало гипоазотемическое действие, снижая уровень креатини-на и мочевины в сыворотке крови на 1 сутки эксперимента на 19 и 33 % соответственно по сравнению с аналогичными показателями в контроле. Так, на 3 сутки у животных, получавших испытуемый фитоэкстракт, наблюдалась тенденция к снижению уровня азотистых метаболитов в сыворотке крови крыс контрольной и опытной групп. Исследования динамики накопления ПОЛ показало, что введение экстракта толокнянки оказывает выраженное ингибирующее влияние на процессы перекисного окисления липидов.
