Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время установлено, что нарушение функции иммунной системы организма зачастую приводит к возникновению широкого круга заболеваний. С целью профилактики таких патологий успешно используются иммуномодулирующие препараты, нередко полученные синтетическим путем. Однако, являясь чужеродными для живого организма, они могут провоцировать возникновение неблагоприятных побочных реакций (НПР). Альтернативой синтетическим средствам могут стать препараты, созданные на основе эндогенных иммуномодулирующих пептидов. В 70-х годах ХХ века из тимуса были получены экстракты, обладающие иммуномодулирующими свойствами (В.Г. Морозов и соавт., 2000). На основе этих экстрактов разработано несколько препаратов – тималин, тактивин и др., представляющих собой смесь большого количества пептидов, из которых были выделены индивидуальные пептиды и изучены их биологические свойства. При этом установлено, что некоторые триптофансодержащие дипептиды обладают иммуномодулирующими свойствами, в том числе H-Ile-Trp-OH и H-Glu-Trp-OH, на основе которого создан препарат тимоген (Яковлев Г.М. и соавт., 1990). В отличие от тимогена, дипептид H-Ile-Trp-OH оказывал влияние как на Т-хелперные (CD4+), так и на Т-супрессорные (CD8+) клетки, что позволило сделать предположение о том, что лекарственные средства, изготовленные на его основе должны обладать более широким спектром иммунологической активности. Преимущество таких препаратов состоит в том, что они не являются чужеродными организму, вследствие чего не обладают токсичностью и не оказывают НПР. Опыт применения тимогена, вилона, иммунофана и других препаратов, являющихся синтетическими пептидами, соответствующими по аминокислотной последовательности природным, подтвердил справедливость данного утверждения. Все вышеизложенное показывает актуальность разработки новых иммуномодулирующих препаратов на основе синтетических пептидов эндогенного происхождения, обладающих иммунотропной активностью.
Малое содержание этих пептидов в организме и сложность выделения их из тимуса в чистом виде обуславливает особую актуальность разработки оптимальных методов их химического синтеза.
Известно, что в функционировании иммунной системы важную роль играют некоторые микроэлементы, наиболее значимым из которых с этой точки зрения является цинк. Роль его в клеточном и гуморальном иммунитете уже ни у кого не вызывает сомнений (Кудрин А.В. и соавт., 2000, 2007; Takahashi K., 1999; Tran C.D., 1999; Segurado M., 1999).
Установлено, что при комплексообразовании ионов различных металлов с биологически активными соединениями, в том числе иммуноактивными, происходит увеличение специфической и расширение спектра биологической активности последних. Однако до настоящего времени не был разработан ни один лекарственный препарат на основе биокоординационных соединений иммунологически активных микроэлементов и низкомолекулярных пептидов. В связи с этим, представляется актуальным изучение путей комплексообразования низкомолекулярных иммуноактивных пептидов с ионами биологически активных металлов, таких как цинк; создание на их основе иммуномодулирующих препаратов; разработка методов стандартизации и технологических схем производства.
Цель и задачи исследования: разработка методов получения иммуноактивных дипептидов и их координационных соединений с ионом цинка и создание на их основе новых иммуномодулирующих препаратов.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Изучить технологичность и безопасность различных путей получения триптофансодержащих дипептидов с использованием различных активированных эфиров и методов их получения.
-
Определить параметры стандартизации и методики анализа субстанции, стандартного образца и препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан (тимогар) с использованием методов спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
-
Изучить взаимодействие триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка с использованием методов рН-метрического и окс-редметрического титрования.
-
Изучить влияние соле- и комплексообразования на хроматографическую подвижность триптофансодержащих дипептидов.
-
Разработать условия хроматографирования методом ВЭЖХ дипептида изолейцил-триптофан и его координационных соединений с ионом цинка.
-
Разработать технологические схемы производства препаратов тимогар и тимоцин, а также методы их стандартизации.
-
Изучить стабильность препаратов тимогар и тимоцин в условиях длительного хранения.
-
Разработать нормативную документацию на препараты тимогар и тимоцин.
-
Провести доклинические и клинические исследования препаратов тимогар и тимоцин.
Научная новизна работы. На основе дипептида H-Ile-Trp-OH и его координационных соединений с ионом цинка впервые разработаны технологические схемы производства и методы стандартизации иммуномодулирующих препаратов тимогар – 0,01% водный раствор дипептида и тимоцин – 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка; исходных фармацевтических субстанций и их стандартных образцов.
Впервые изучена возможность использования ПСА-метода для синтеза аналогов тимопентина и N-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида H-Ile-Trp-OH. Экспериментально подтверждено преимущество использования активированных (пентафторфениловых) эфиров при получении низкомолекулярных тимусных пептидов.
Получены координационные соединения дипептидов H-Gly-Trp-OH и H-Ile-Trp-OH с ионом Zn2+. Использование окислительной функции позволило установить состав координационных соединений Zn2+ и дипептида H-Ile-Trp-OH. Разработаны методы стандартизации триптофансодержащего дипептида и его координационных соединений с ионом цинка, основанные на использовании современных физико-химических методов анализа.
Установлено увеличение специфической и расширение спектра биологической активности исследуемых комплексных соединений триптофансодержащих дипептидов с биологически активным микроэлементом – цинком.
Отмечено сокращение срока и увеличение эффективности лечения заболеваний человека и животных, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний при совместном применении разработанных препаратов с химиотерапевтическими лекарственными средствами.
Показано значительное повышение уровня гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных и птиц при совместном применении вакцин и иммуномодулирующих препаратов на основе триптофансодержащих дипептидов и их координационных соединений с ионом цинка.
Практическая значимость результатов исследования. Разработаны схемы синтеза лекарственных препаратов на основе триптофансодержащих дипептидов и их координационных соединений с ионом цинка, использующиеся при производстве новых иммуномодулирующих препаратов тимогар, тимоцин. Разработаны методы их стандартизации, включенные в 5 Фармакопейных статей (ФСП 42 Tj-00001-08, 42 Tj-00002-08, ФСП 42-Tj-0001-08, ФС 42-Tj-0002-08, 42-Tj-0003-08), утвержденных Министерством Здравоохранения Республики Таджикистан, а также технические условия, наставления по изготовлению и контролю, наставления по применению, утвержденные Главным Управлением ветеринарии МСХ Республики Таджикистан. Разработанные препараты тимогар и тимоцин зарегистрированы в Республике Таджикистан (рег. № 000084Т и 000085Т). Препараты тимогар и тимоцин внедрены в медицинскую и ветеринарную практику.
Связь задач исследований с проблемным планом. Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора по теме: «Разработка принципов и методов контроля различных групп биотехнологических препаратов» и планами исследований кафедры органической и биологической химии Таджикского государственного педагогического университета имени С. Айни Республики Таджикистан по теме: «Исследование низкомолекулярных иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с биометаллами».
Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на: научно-практической конференции «Теоретические и практические исследования в медицине» (Душанбе, 1999), VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003), третьей республиканской научной конференции биохимиков РТ «Вклад биохимиков в развитие биологической науки» (Душанбе, 2003), научно-практической конференции с международным участием «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» (Душанбе, 2006), научно-практической конференции «Аналитик кимё ва экологиянинг долзарб муаммолари» (Самарканд, 2006), научной конференции «Проблемы клинической онкологии» (Душанбе, 2008), совместной республиканской научно-практической конференции «Перспективы развития фундаментальных медицинских наук в Таджикистане и 56-ой годичной конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино «Перспективы развития семейной медицины в Таджикистане» (Душанбе, 2008), международной конференции «Вакцинология-2008» (Москва, 2008), международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009), VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Душанбе, 2010), республиканской конференции «Проблемы современной координационной химии» (Душанбе, 2011), на совместном заседании секции №1 и секции №2 Ученого совета Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России.
Личный вклад автора. Автором осуществлен выбор научного направления, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах научно-практического исследования. Автором предложена схема синтеза изучаемых дипептидов, разработана технологическая схема их производства. Автором разработана технологическая схема производства препарата тимогар, методы контроля качества препарата, изучена стабильность тимоцина в процессе длительного хранения и установлен срок его годности. При личном участии автора проведены производственные испытания тимоцина и тимогара, подтвердившие его высокую эффективность.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 научных работ, в том числе одна монография и 5 патентов Республики Таджикистан. 29 статей опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Оптимальные методы синтеза аналогов тимопентина, триптофансодержащих пептидов, бурсина и его гибридного аналога.
-
Результаты исследований по разработке рациональной технологии получения триптофансодержащих дипептидов и координационных соединений дипептида H-Ile-Trp-OH с ионом цинка.
-
Результаты разработки методик анализа и стандартизация стандартных образцов, субстанций и лекарственных форм на основе дипептида H-Ile-Trp-OH и его координационного соединения с ионом цинка.
-
Результаты фармакологических и клинических испытаний синтезированных соединений и выбор наиболее перспективных из них для применения в медицине и ветеринарии (препараты тимогар и тимоцин).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 389 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, списка литературы, включающего 236 источников, в том числе 75 на иностранных языках, приложения. Работа включает 39 рисунков и 38 таблиц.
![Аналитические и технологические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной [Электронный ресурс]](/i/i/4601/192337.png "Аналитические и технологические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной [Электронный ресурс] Климова Инна Юрьевна")
