Введение к работе
Актуальность:
Согласно существующим международным требованиям, любое оригинальное и воспроизведенное лекарственное средство должно соответствовать следующим критериям: эффективность, безопасность, качество. Это в равной степени следует отнести и к БАД, требования к которым в современных условиях постоянно возрастают. Надлежащий уровень качества обеспечивается соответствующим нормативным документом, отражающим как общие подходы к контролю качества и стандартизации, так и показатели, которые определяются предполагаемым медицинским применением лекарственного средства или БАД.
Достижения молекулярной биологии и биохимии открывают новые возможности лечения заболеваний с учетом патофизиологических механизмов, протекающих на уровне клеточных и субклеточных структур. В основе ведущих метаболических процессов лежат окислительно-восстановительные реакции. Среди них особую роль играют свободнорадикальные реакции, ведущие к образованию перекисных соединений. Активация процессов свободнорадикального окисления вследствие дисбаланса в системе «прооксиданты-антиоксиданты» и последующие изменения в клетках, тканях и системах организма получили название окислительного стресса. Усиление деструктивных процессов при окислительном стрессе может являться патогенетическим фактором заболевания, даже не будучи основной причиной его развития.
Однако сегодня нет единого мнения о биологической роли окислительных реакций с участием свободных радикалов кислорода. Большинство исследователей считают активные формы кислорода важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Развитие патологических процессов связано с изменением клеточных программ, следовательно, развитие многих заболеваний определяется балансом прооксидантов и антиоксидантов. Отношение к последним в современной научной литературе варьирует от полного игнорирования и даже отрицания до ожиданий излечения от всех болезней и продления жизни [Е.Б. Меньшикова с соавт., 2008]. В таких случаях важнейшим критерием истины должна стать практика, но пока и она не дала однозначных ответов на многие вопросы.
Среди использующихся в медицинской практике наиболее перспективным антиоксидантом является убихинон (коэнзим Q10, CoQ10) – вещество эндогенной природы, обязательный компонент мембран митохондрий, лизосом, аппарата Гольджи, плазматических мембран.
Струкурная формула коэнзима Q10 (2,3-диметокси-5-метил-6-декапренил-1,4-бензохинон).
Коэнзим Q10 в митохондриях участвует в синтезе АТФ как переносчик электронов, сопрягающий процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования. В то же время, убихинон – единственный липидорастворимый антиоксидант, синтезирующийся в клетках животных и человека. Еще одно уникальное свойство CoQ10 – постоянная регенерация его окисленной формы с помощью ферментных систем организма и антиоксидантов неферментной природы - аскорбата, -токоферола (-TOC), возвращающая ему антиоксидантную активность (схема 1).
Схема 1. Взаимопревращения окисленной и восстановленной форм убихинона.
По результатам многих клинических исследований CoQ10 рекомендован в качестве дополнительной терапии при хронической сердечной недостаточности, кардиомиопатии, стенокардии, гипертонии, инфаркте миокарда, атеросклерозе; имеются данные о его эффективности при мигрени, болезни Паркинсона, латеральном амиотрофическом склерозе, астме, диабете, почечной недостаточности. Наибольшее число клинических исследований CoQ10 посвящено сердечной недостаточности, однако окончательный вывод о его эффективности при этом заболевании еще не сделан. Актуально проведение дальнейших исследований, направленных, с одной стороны, на выявление препаратов, обладающих максимальной биодоступностью и способных пополнить эндогенные уровни в крови и сердечной мышце, а с другой – на более глубокое понимание патогенетических механизмов (на уровне ткани и клетки) как потенциальных объектов фармакологического воздействия CoQ10.
На мировом фармацевтическом рынке CoQ10 повсеместно доступен в виде биологически активных добавок к пище и лишь в нескольких странах – как активное вещество в составе лекарственных препаратов. Российский современный фармацевтический рынок изобилует предложениями CoQ10-содержащих БАД зарубежного и отечественного производства. Широкая и навязчивая реклама БАД к пище, проводимая средствами массовой информации, приводит к росту их неконтролируемого потребления. Эта ситуация обязывает повышать уровень требований к безопасности и качеству биологически активных добавок, которые на сегодняшний день регламентируются техническими условиями в соответствии с требованиям «Руководства по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (Руководство Р 4.1.1672-03). На основании требований Руководства количественный анализ CoQ10 в БАД осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием по поглощению в ультрафиолетовой области спектра. Недостаточная чувствительность определения и условия пробоподготовки ограничивают применение этой методики образцами с высоким содержанием CoQ10, то есть лекарственными препаратами и БАД.
Безопасность БАД на основе CoQ10 контролируется по критериям, предъявляемым к продуктам питания: содержанию токсичных элементов (тяжелых металлов), пестицидов и радионуклидов. Между тем, содержащиеся в БАД активные компоненты могут вызывать терапевтические эффекты и иметь побочные; вещества эндогенной природы при длительном приеме могут оказывать влияние на уровень их синтеза в тканях организма, приводя к формированию небезопасного эффекта отмены. Кроме того, Руководство не предусматривает стандартизации БАД и не требует подтверждения их фармакологической эффективности, что имеет первостепенное значение в случае медицинского применения.
Целью данного исследования явилась комплексная оценка качества и эффективности БАД с CoQ10 для обоснования их применения в качестве кардиопротекторов.
Достижение поставленной цели осуществлялось последовательным решением следующих задач:
-
Разработать ВЭЖХ-методики определения CoQ10 в БАД на основе CoQ10 для оценки их качества и стандартизации.
-
Разработать ВЭЖХ-методики определения коэнзимов Q9, Q10 и -TOC в тканях крыс (плазме/сыворотке крови, миокарде, головном мозге) для изучения фармакокинетики БАД на основе CoQ10 при однократном и хроническом введении, а также тканевого содержания коэнзимов Q и -TOC при патологии миокарда.
-
Провести сравнительное изучение фармакокинетики CoQ10 у крыс после однократного введения внутрь порошка субстанции и различных БАД серии «Кудесан» (раствора и таблеток).
-
Изучить влияние хронического введения БАД «Кудесан» и его отмены на содержание коэнзимов Q и -TOC в плазме крови и миокарде крыс.
-
Разработать методику определения уровня гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием и микродиализа миокарда для оценки интенсивности окислительных процессов.
-
Определить уровень гидроксильных радикалов в ткани миокарда при патологических состояниях:
- в гипертрофированном миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией (линия SHRSP);
- в миокарде крыс (Wistar) при острой региональной ишемии и последующей реперфузии
для патогенетического обоснования антиоксидантной терапии.
-
Оценить уровни коэнзимов Q и -TOC в плазме и гипертрофированном миокарде:
- крыс различных возрастов с наследственной артериальной гипертензией;
- в постинфарктном ремоделированном миокарде нормотензивных крыс
для патогенетического обоснования применения CoQ10 в качестве кардиопротектора.
-
Оценить кардиопротекторные эффекты БАД «Кудесан» при хроническом введении крысам с наследственной артериальной гипертензией линии SHRSP и крыс Wistar с инфарктом миокарда.
Научная новизна
Разработаны методики определения CoQ10 в БАД: растворе солюбилизированной субстанции CoQ10, таблетках микрокапсулированного CoQ10, плазме крови, тканях мозга и миокарда с применением ВЭЖХ с электрохимическим детектированием, позволяющие одновременно проводить определение CoQ9 и -TOC.
Изучена фармакокинетика CoQ10 в порошке, растворе солюбилизированной субстанции и таблетках микрокапсулированной субстанции. Доказаны фармакокинетические преимущества модифицированных субстанций CoQ10. Для раствора солюбилизированного CoQ10 выявлена способность при хроническом введении внутрь повышать уровни в миокарде.
Обнаружен эффект отмены CoQ10: падение концентраций в миокарде через 2 недели после прекращения длительного введения внутрь.
Впервые проведена сравнительная оценка содержания коэнзимов Q9, Q10 и -TOC в плазме крови, гипертрофированном миокарде и головном мозге крыс с наследственной артериальной гипертензией различного возраста относительно тканей нормотензивных животных. Выявлена взаимосвязь плазменных и миокардиальных уровней CoQ10 со степенью гипертрофии левого желудочка.
Впервые выявлено снижение содержания коэнзимов Q9, Q10 и -TOC в гипертрофированном постинфарктном миокарде после хронической окклюзии коронарной артерии. Обнаружена сильная корреляционная зависимость между размером инфаркта и концентрациями коэнзимов Q в плазме крови.
Разработана ВЭЖХ-методика определения гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo, обладающая наибольшей чувствительностью из приведенных в литературе аналогов. На примере спонтанно гипертензивных крыс SHRSP впервые выявлены повышенные уровни гидроксильного радикала как одна из причин сниженной устойчивости гипертрофированного миокарда к ишемии и установлена их прямая взаимосвязь со степенью гипертрофии сердечной мышцы. Доказано усиление генерации гидроксильных радикалов во время эпизодов реперфузии ишемического прекондиционирования миокарда. Показано, что ишемическое прекондиционирование сокращает продолжительность реперфузионного выброса гидроксильных радикалов в миокарде крысы после региональной ишемии, что может являться одной из причин многократного сокращения размера зоны повреждения.
Показан кардиопротекторный эффект CoQ10 при длительном введении внутрь на различных экспериментальных моделях гипертрофии миокарда: при развитии первичной артериальной гипертензии у спонтанно гипертензивных крыс и у животных с хроническим инфарктом миокарда. Обнаружено, что выраженность эффекта взаимосвязана с концентрациями CoQ10 в плазме крови и миокарде.
Теоретическая и практическая значимость
Методики определения CoQ10 на основе ВЭЖХ могут использоваться для его количественного определения в различных композициях, применяемых в качестве БАД и лекарственных препаратов. Высокая чувствительность разработанной методики определения CoQ10 в биологических объектах позволяет применять ее для изучения фармакокинетики при проведении доклинических и клинических испытаний.
Методика определения уровня гидроксильных радикалов в ткани in vivo на основе микродиализа миокарда и ВЭЖХ предоставляет возможность экспериментальной прижизненной оценки окислительного статуса тканей. Возможность мониторинга тканевых уровней гидроксильного радикала позволяет в фармакологическом эксперименте оценивать on-line эффективность мер, направленных на ограничение генерации активных форм кислорода.
Доказана патогенетическая значимость усиленной генерации активных форм кислорода и сниженных миокардиальных уровней CoQ10 при острых и хронических патологических состояниях миокарда. Выявленный дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно дополняет представление о патогенетической роли окислительного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Доказана кардиопротекторная эффективность CoQ10 в составе БАД «Кудесан» раствор на различных моделях гипертрофии миокарда. Полученные результаты являются теоретическим основанием для проведения полного доклинического изучения CoQ10 и решения вопроса о создании лекарственных средств на его основе.
Впервые выявленный для CoQ10 эффект отмены требует пересмотра отношения к нему как абсолютно безопасному фармакологическому агенту. Возможность резкого снижения содержания CoQ10 в миокарде ниже нормальных значений после прекращения его приема обязывает с крайней осторожностью применять высокие дозы CoQ10 и диктует необходимость разработки фармакокинетически обоснованных безопасных режимов дозирования.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на 13 всероссийских (18 докладов) и 13 международных (23 доклада) съездах, конференциях, симпозиумах, конгрессах.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 15 статей, в том числе 13 – в ведущих рецензируемых отечественных журналах.
Объем и структура работы:
