Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Характеристика рода Artemisia 12
1.2. Характеристика Барабинской лесостепи 13
1.3. Ботаническая характеристика, применение A. pontica в народной медицине, степень химической изученности 14
1.4. Локализация эфирных масел 17
1.5. Химическая характеристика, фармакологические свойства, природные источники азуленов 18
1.6. Биологическая активность компонентов, входящих в состав эфирного масла A. pontica 23
1.7. Рациональное использование растительного сырья 26
1.8. Характеристика биологически активных веществ полыней 28
Экспеиментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 35
2.1. Объекты исследования 35
2.2. Методы микроскопических исследований 36
2.3. Методы качественного обнаружения биологически активных веществ 37
2.4. Методы определения количественного содержания БАВ 40
2.5. Товароведческий анализ: методы установления показателей доброкачественности сырья
Глава 3. Сравнительный фармакогностический анализ A. pontica, собранной в естественных местах произрастания 44
3.1. Микроскопический анализ надземной части A. pontica 44
3.2. Исследование качественного состава комплекса БАВ A. pontica 60
3.3. Анализ содержания эфирного масла в надземной части A. pontica 69
Анализ количественного содержания БАВ в надземной части A. pontica 88
Выводы по главе 101
Глава 4. Фармакогностическое исследование шрота A.pontica 102
Микроскопическое исследование шрота 102
Исследование качественного состава комплекса БАВ шрота A. pontica
Количественное содержание БАВ в шроте A. pontica 109
Выводы по главе 115
Глава 5. Сравнительный фармакогностический анализ A.pontica, выращенной в условиях интродукции 116
Сравнительный микроскопический анализ A. pontica, выращенной в условиях интродукции 116
Исследование качественного состава комплекса БАВ A. pontica, выращенной в условиях интродукции 125
Анализ содержания эфирного масла в надземной части
A. pontica, выращенной в условиях интродукции 128
Анализ количественного содержания БАВ в надземной части
A. pontica, выращенной в условиях интродукции 136
Выводы по главе 141
Глава 6. Установление показателей доброкачественности сырья 142
Морфометрические показатели сырья A. pontica 142
Стандартизация сырья 146
Выводы по главе 152
Общие выводы 153
Список литературы 154
Приложения 174
- Ботаническая характеристика, применение A. pontica в народной медицине, степень химической изученности
- Методы качественного обнаружения биологически активных веществ
- Исследование качественного состава комплекса БАВ A. pontica
- Исследование качественного состава комплекса БАВ шрота A. pontica
Введение к работе
Актуальность проблемы. В основе многих заболеваний различной этиологии лежит воспаление, проявляющееся разнообразными реакциями — от классических до некробиотических и деструктивных.
В настоящее время используется большое количество синтетических противовоспалительных препаратов, однако для каждого них характерен ряд недостатков: нарушения функции органов желудочно-кишечного тракта (тошнота, рвота, ульцерогенный эффект), гематологические нарушения (геморрагии, агранулоцитоз, анемия, метгемоглобинемия), аллергические реакции [79,131,137,165].
Поэтому поиск новых нетоксичных соединений, обладающих противовоспалительным, бактерицидным, регенераторным действием, способствующих заживлению ран, является актуальным в настоящее время.
В этом плане представляют интерес растения, эфирное масло которых содержит хамазулен: ромашка аптечная, тысячелистник обыкновенный и некоторые виды полыней (Л. pontica, A. jacutica, A. sieversiana, А. macrocephald) [45,98,134]. Так, из Chamomilla recutita выделено эфирное масло в различных количествах - от следов до 1,90 % [47,134], в составе которого обнаруживается до 12 % хамазулена [47,140]. Из образцов Artemisia jacutica извлекается до 2 % эфирного масла, содержащего до 47 % хамазулена в его составе [75,156,158], однако данный вид является восточносибирским эндемиком с весьма ограниченным ареалом [152], для Achillea millefolium и A. asiatica характерно наличие бесхамазуленовых рас [55,133,161]. Из перечисленных выше растений привлекает внимание А. pontica, из которой выделено 0,90 % эфирного масла с содержанием хамазулена до 13 % [139]. Данный вид характеризуется устойчивостью состава эфирного масла, поэтому отнесен к группе перспективных видов [17,139,157] и широко культивируется в Европейских странах как пряно ароматическое растение [52,203]. До настоящего времени не было проведено
детального исследования A.pontica как перспективного источника эфирного масла, содержащего хамазулен.
Цель работы: Проведение фармакогностического исследования Artemisia pontica L.
Задачи исследования:
Проведение сравнительного морфолого-анатомического исследования надземной части A. pontica по фазам развития и местам сбора (для выявления диагностических признаков сырья);
Проведение сравнительного фитохимического анализа надземной части A. pontica, естественных мест произрастания и выращенной в условиях интродукции;
Проведение сравнительного анализа качественного состава и количественного содержания эфирного масла в надземной части A. pontica, собранной в различных местах произрастания, по фазам развития и отдельным органам растения, выявление оптимальных условий получения эфирного масла;
Проведение фитохимического анализа для выявления влияния эколого-ценотических факторов, фаз развития растения на динамику накопления БАВ в траве A. pontica;
Установление возможности комплексной переработки сырья и использования шрота A. pontica;
Определение товароведческих показателей сырья A. pontica;
7. Разработка проекта фармакопейной статьи «Artemisiae pontica
herba».
Научная новизна: Впервые проведен сравнительный
фармакогностический анализ A. pontica, собранной в естественных местах произрастания из разных точек ареала и выращенной в условиях интродукции, по фазам развития и органам.
Проведен сравнительный микроскопический анализ образцов сырья, собранных из разных точек ареала по фазам развития. Выявлены микродиагностические признаки надземной части A. pontica.
Проанализировано 55 образцов эфирных масел. Детально изучен химический состав эфирного масла в зависимости от места произрастания растения, фазы развития, типа органа, от времени хранения сырья (с целью установления его оптимального срока годности). Методом хромато-масс-спектрометрии в составе эфирного масла впервые идентифицированы такие компоненты как: Z-сальвен, сантолинатриен, трицикл єн, 2,3-дегидро-1,8-цинеол, 2-пентилфуран, а-фелландрен, Р-фелландрен, сантолиновый спирт, п-цименен, линалоол, дегидросабинакетон, г/мс-сабинол, сабинакетон, 8-терпинеол, туйеналь, м-цимен-8-ол, 5-изопропил-бицикло[3.1.0]-гекс-2-ен-2-метанол, г/г^с-пиперитол, транс-пипершоп, вербеной, транс-карвєол, борнилформиат, куминовый спирт, тимол, mpawc-сабинилацетат, бициклогермакрен, пресильфиперфолан-9-ол, изокариофиллен-оксид, Е-неролидол, вульгарен А, вульгарен В, кариофилла-3,8(13)-диен-5а-ол, гермакратриенол, эвдесмадиенол.
Впервые детально изучен качественный состав и количественное содержание групп биологически активных веществ (флавоноидов, оксикоричных кислот, кумаринов, кислоты аскорбиновой, полисахаридов, дубильных веществ) в зависимости от места произрастания растения и фазы его развития.
Изучен компонентный состав фенольных соединений травы A. pontica. Впервые в надземной части A. pontica установлено наличие флавоноидов: рутина, кверцетина, апигенина, лютеолина; оксикоричных кислот: хлорогеновой, кофейной, м-оксикоричной.
Впервые определено содержание в траве фракций полисахаридов (водорастворимых, пектиновых веществ, гемицеллюлозы А и В).
Впервые изучен химический состав шрота A. pontica. На основании полученных данных установлено, что после получения эфирного масла шрот
представляет собой ценный источник таких БАВ как флавоноиды, кумарины, оксикоричные кислоты, полисахариды, дубильные вещества и может быть использован для получения комплексных препаратов.
Практическая значимость. На основании проведенных фармакогностических исследований для медицинской практики предложено новое лекарственное растительное сырье.
Результаты микроскопических и химических исследований использованы для разработки методик диагностики и определения качества сырья A. pontica и включены в проект фармакопейной статьи «Полыни понтийской трава». Материалы диссертации использованы при составлении методического пособия «Микродиагностические признаки отдельных видов полыней, произрастающих на территории Новосибирской области {Artemisia absinthium L., A. sieversiana Willd., A. pontica L., A. vulgaris L.)».
По результатам полученных данных получен патент на способ получения эфирного масла.
Данные, полученные при химическом исследовании шрота A. pontica, обосновывают его перспективность как дополнительного источника БАВ. На защиту выносятся:
Результаты фитохимического исследования БАВ A. pontica,
Исследования по изучению микродиагностических признаков травы полыни понтийской,
Результаты фитохимического анализа шрота Л. pontica,
Данные по стандартизации травы полыни понтийской.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены на ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (г. Новосибирск, 2003, 2005, 2006), всероссийской 63-й итоговой студенческой конференции им. Н.И.Пирогова (г. Томск, 2004), 68-й всероссийской итоговой студенческой научно-практической конференции, посвященной 105-летию проф. Гливенко В.Ф. (г. Красноярск, 2004), 1-й студенческой научной конференции Сибирского
Федерального округа «Качество жизни как критерий санитарно-
эпидемиологического благополучия» (г. Омск, 2005), ежегодной
международной экологической студенческой конференции «Экология России
и сопредельных территорий. Экологический катализ» (г. Новосибирск, 2004,
2005), межвузовской научной студенческой конференции
«Интеллектуальный потенциал Сибири» (г. Новосибирск, 2006), всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2007), 11-м международном съезде «Фитофарм» (Лейден, 2007), II международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алматы, 2007), научной конференции студентов и молодых ученых (г.Пермь, 2008), V Всероссийской научной конференции (г. Уфа, 2008).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии и ботаники Новосибирского государственного медицинского университета (№ государственной регистрации 012000807420) и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Здоровье человека в Сибири» (№ государственной регистрации 01.9.2002479).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 29 научных работах.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнены на кафедре фармакогнозии и ботаники НГМУ, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: фотографии анатомической структуры A. pontica были выполнены под руководством старшего научного сотрудника Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) Т.Е.Алешиной, которой автор выражает искреннюю признательность и благодарность.
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность сотрудникам Лаборатории терпеновых соединений НИОХ СО РАН им.
Н.Н.Ворожцова, особенно аспиранту Д.В.Домрачеву за помощь в расшифровке хромато-масс-спектрограмм.
Интродукционные исследования проводились совместно со старшим научным сотрудником СибБС при ТГУ (г. Томск) к.б.н. В.П.Амельченко, за что автор выражает искреннюю признательность и благодарность.
Исследование качественного состава извлечений из надземной части А. pontica проводилось на базе ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова» под руководством к.х.н. Азаровой И.Н. Автор выражает искреннюю признательность и благодарность руководителю и сотрудникам института.
Ботаническая характеристика, применение A. pontica в народной медицине, степень химической изученности
A.pontica - многолетнее травянистое растение. Корневище ползучее, 1,5-3 мм толщиной, стебель 40-100 см высотой, травянистый, прямостоячий, за исключением нижней части - густо олиственный, коротковолосистый. Листья очередные, нижние стеблевые - черешковые, остальные - сидячие, 2-5 см длиной и 1-3 см шириной, сверху серовато-зеленые, негусто прижато волосистые, снизу беловато- или серовато-войлочные, пластинка в очертании овальная, дважды или трижды перисто-рассеченная, сегменты кверху нередко немного расширенные и затем заостренные, 2-6 мм длиной и 0,5-1 мм шириной. Главная ось листа в верхней части между первичными долями с небольшим числом мелких цельных долек, чаще без них. Нижние прицветные листы перисто-рассеченные, верхние цельные, линейные, не выставляющиеся из соцветия. Корзинки почти шаровидные, 2,5-4 мм шириной, поникающие, сильно сближенные в сложной метелке. Обертка беловатая, многорядная, тонковойлочная, наружные травянистые листочки обертки продолговато-овальные, внутренние эллиптические, с широким пленчатым краем. Краевые цветки пестичные, в числе 12, венчик узкотрубчатый, книзу расширенный, точечно-железистый, лопасти рыльца выдающиеся из трубки, линейные, усеченные, отогнутые. Цветки диска желтые, многочисленные (40-45), обоеполые, отчасти недоразвитые; венчик конический, голый, реже редко волосистый, точечно-железистый. Пыльники на коротких нитях, линейные, верхушечные придатки не выражены; лопасти рыльца короткие, не выставляются из трубки, короткореснитчатые, после цветения изогнутые.
A.pontica произрастает в лесостепной и степной зонах, среди степных кустарников, в негустых колках, на полянах, опушках, сухих солонцеватых и солончаковых лугах, склонах речных долин, по берегам рек. Распространена в Европейской части: Волжско-Камской, Волжско-Донской, Заволжской, Арало-Каспийской, Молдавской, Нижнее-Донской, Нижнее-Волжской, в Крыму, на Кавказе, Предкавказье, в Западной Сибири, Средней Азии, Прибалтике [49,65,103,152,168]. В связи с тем, что A. pontica широко распространена, она издавна стала привлекать внимание людей и на протяжении нескольких столетий применяется в народной и традиционной медицине для лечения различных заболеваний. Применение A. pontica в народной и традиционной медицине A. pontica известна с древнейших времен [134]. В средневековой медицине п. понтийскую применяли при орхите, опухолях селезенки, печени, матки в виде припарок, отваров, соков [193]. В народной медицине — при аменорее, как возбуждающее аппетит, улучшающее пищеварение, отхаркивающее, антигельминтное, тонизирующее средство [134,164].
В средневековой армянской медицине A. pontica применяли при аменорее, бронхиальной астме и одышке, как мочегонное, противоглистное (при поражении плоскими глистами) средство. В древности придавали большое значение изучению противоядий. Растительные средства, в том числе A. pontica, назначались при отравлении различными ядами (укусы змей, скорпиона, ранение ядовитыми стрелами, ядом белены), а также при заболеваниях, сопровождающихся явлениями экзогенной и аутогенной интоксикации (крапивница, опухоли, эпилепсия) [4,23].
Сок свежей травы применяется при опухолях, ранах. В Сибири порошок травы применяли как ранозаживляющее средство; настой — при лихорадке; в Казахстане настойка из п.понтийской применялась при нервных болезнях; припарки из соцветий - при опухолях мошонки [134]. A. pontica использовалась как заменитель хмеля в пивоварении; в ликерном производстве, в связи с чем введена в культуру как пряно -ароматическое растение в средней и южной Германии (с XVI в.), в Австрии, северной Италии, средней и южной Франции, Испании, Англии, южной Канаде, США [28,52,203]. Целый ряд полыней, в том числе и п. понтийская, являются нагульным кормом и поедаются практически всеми видами животных. В отличие от других кормовых растений полыни поедаются два раза в течение вегетационного периода: ранней весной и поздней осенью. Содержащиеся в растениях эфирное масло и горькие вещества способствуют очищению пищеварительного тракта животных от паразитов [63,94,95,134].
Эфирное масло A. pontica в эксперименте проявляет противовоспалительное, анальгезирующее действие, в зависимости от концентрации - бактериостатическую и фунгистатическую активность; рекомендуется в качестве источника азулена [134,143].
Применение A. pontica в народной медицине связано с тем, что данный вид полыни обладает широким спектром фармакологической активности, которая обусловлена наличием в составе растения различных групп БАВ.
Методы качественного обнаружения биологически активных веществ
Количественное содержание эфирных масел в исследуемых образцах надземной части A. pontica определялось методом перегонки с нагретым водяным паром и методом гидродистилляции на базе НИОХ СО РАН и на кафедре фармакогнозии и ботаники ГОУ ВПО НГМУ [36]. Время перегонки составляло 6 часов. Содержание эфирного масла рассчитывали на абсолютно сухое сырье. 2. Органолептическую оценку и установление физико-химических констант эфирных масел проводили по общепринятым методикам [33,36,197]. 3. Плотность эфирного масла определяли с помощью пикнометра. 4. Измерение показателя преломления (n d) проводили на рефрактометре при температуре воздуха 20 ± 0,3 С. 5. Выделение хамазулена из эфирного масла A. pontica проводили методом колоночной хроматографии (неподвижная фаза - силикагель), подвижная фаза - гексан. Чистоту полученного образца контролировали методом одномерной тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» в системе: эфир петролейный и методом хромато-масс-спектрометрии в сравнении со стандартным образцом. 6. Определение количественного содержания хамазулена в эфирном масле A. pontica проводили спектрофотометрическим методом. Около 10 мг (т.н.) эфирного масла помещали в мерную колбу на 10 мл и растворяли в небольшом количестве 96%-ного спирта этилового, затем этим же растворителем доводили до метки, раствор перемешивали и замеряли его оптическую плотность в кювете с толщиной слоя 10 мм на спектрофотометре при длине волны 603 нм.
В качестве раствора сравнения использовали 96%-ный спирт этиловый. 7. Анализ компонентов проводили методом хромато-масс-спектрометрии, который широко используется для разделения и идентификации различных химических веществ. Хромато-масс-спектрометрические данные получены на газовом хроматографе Agilent 5890/П с квадрупольным масс-спектрометром (Agilent MSD 5973N) в качестве детектора и системой автоматического ввода Agilent 7673. Использовалась 30 м кварцевая колонка HP-5ms (сополимер 5% дифенил-95%-диметилсилоксана) с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 JLLM, газ-носитель - гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Температура колонки: 2 мин при 50С (2 мин) - 200С (4С/мин) - 280С (20С/мин). Температура испарителя: 280С. Температура источника ионов: 150С. Температура интерфейса между ГХ и МС детектором: 280С. В инжектор вводился 1 дл 1%-ного ацетонового раствора эфирного масла с разделением потока 20:1. Ионизация молекул осуществлялась электронами (70 эв). Данные собирались со скоростью 1,2 скан./сек при массовой области 30-650 а.е.м. Процентный состав эфирных масел вычислялся по площадям газохроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Качественный анализ основан на сравнении индексов удерживания и полных масс-спектров анализируемых компонентов с данными специализированной библиотеки [145]. Методы исследования качественного состава фенольных соединений Для получения извлечения 20 г надземной части (травы), измельченной до частиц размером 1 мм, заливали 100 мл 40 % этанола и нагревали на водяной бане в течение 30 минут с прямым воздушным холодильником. Полученное извлечение отфильтровали, сырье повторно заливали 50 мл 40 % этанола и нагревали 30 минут на водяной бане. Полученные фильтраты объединяли и помещали в выпарительную чашку, нагревали на водяной бане до полного удаления спирта. Затем водное извлечение поместили в делительную воронку, добавили 50 мл хлороформа и экстрагировали в течение 5 минут. Отстоявшийся хлороформный слой слили; операцию повторяли 3 раза. Хлороформные извлечения объединили. К оставшемуся водному извлечению добавили 50 мл этилацетата, экстрагировали в течение 5 минут; операцию повторяли трижды. Полученные этилацетатные извлечения объединили.
С полученными водным, хлороформным и этилацетатным извлечениями проводили качественные реакции по общепринятым методикам [11,12,31,80,159]. Определение качественного состава ку мари нов Качественный состав кумаринов исследовали с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol», система растворителей: петролейный эфир - этилацетат (2:1) - система № 1; и методом нисходящей бумажной хроматографии на бумаге «Ленинградская средняя», импрегнированной формамид-ацетон (1:3), система - хлороформ -система № 2. Для идентификации кумаринов использовали: свечение в фильтрованном УФ-свете, характер свечения и окраски пятен веществ на хроматограмме до и после обработки ее 5 % раствором натрия гидроксида и диазотированной сульфаниловой кислотой, по величинам Rf в сравнении со стандартными веществами [68]. Определение качественного состава флавоноидов Качественный состав флавоноидов исследовали методами бумажной хроматографии на бумаге «FN-6» [11,29,159]: одномерной хроматографии, система растворителей: водный раствор кислоты уксусной 15 % (система № 3), одномерной хроматографии, система растворителей: кислота уксусная - кислота соляная - вода (30 : 3 : 10) - система № 4, одномерной хроматографии, система растворителей: н-бутанол -кислота уксусная - вода (4:1:5) - система № 5. двумерной хроматографии в следующих системах растворителей: 1) н-бутанол - кислота уксусная - вода (4:1:5) и 2) этилацетат - кислота муравьиная - вода (10:2:3) - система № 6. Для идентификации веществ использовали: свечение в фильтрованном УФ-свете, характер окраски пятен веществ на хроматограмме до и после обработки парами аммиака и 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида, по величинам Rf в сравнении со стандартными веществами [11]. Определение качественного состава оксикоричных кислот Качественный состав оксикоричных кислот исследовали с помощью восходящей бумажной хроматографии на бумаге «Ленинградская средняя», «FN-3», подвижная фаза - 2 % уксусная кислота (система № 7).
Для идентификации использовали: свечение в фильтрованном УФ-свете, характер свечения и окраски веществ на хроматограмме до и после обработки 10 % спиртовым раствором натрия гидроксида и диазотированной сульфаниловой кислотой, по величинам Rf в сравнении со стандартными веществами [12].
Исследование качественного состава комплекса БАВ A. pontica
По результатам проведенного общего фитохимического анализа в надземной части A. pontica были обнаружены следующие БАВ: эфирное масло, флавоноиды, кумарины, оксикоричные кислоты, дубильные вещества, полисахариды, аскорбиновая кислота .
При сравнении интенсивности окраски пятен веществ после обработки хроматограмм хромогенными реактивами установлено, что наиболее ярко окрашено вещество, идентифицированное как рутин, поэтому предполагаем, что оно будет преобладать в сумме флавоноидов в растении. Сравнительный хроматографический анализ качественного состава флавоноидов по органам растения A. pontica показал, что соцветия и листья обладают сходным составом, а в стеблях отмечено несколько меньшее количество веществ анализируемой группы соединений. Исследование качественного состава флавоноидов показало постоянство их состава в растениях независимо от места произрастания и фазы развития.
Хроматографический анализ показал наличие 12 оксикоричных кислот, из которых идентифицированы кофейная, хлорогеновая, м-оксикоричная кислоты (табл. 6, рис. 35). При сравнительном анализе интенсивности свечения пятен веществ на хроматограмме в УФ-свете выявлено, что наибольшей площадью пятна и наиболее ярким свечением характеризуется вещество, идентифицированное как хлорогеновая кислота, поэтому предполагаем, что она будет преобладать в сумме оксикоричных кислот. Таблица 6 (НСО, 38 км от г.
Сравнительный хроматографический анализ качественного состава оксикоричных кислот по органам растения Л. pontica показал, что соцветия, листья и стебли обладают сходным составом анализируемой группы соединений. С целью определения влияния фазы развития растения на качественный состав оксикоричных кислот были проанализированы растения, собранные в фазу вегетации, бутонизации и цветения. Проведенные исследования выявили постоянство состава оксикоричных кислот в растениях независимо от места их произрастания и фазы развития.
Анализ содержания эфирного масла в надземной части A. pontica A. pontica является перспективным растением, которое представляет интерес для использования в медицинской практике за счет содержания эфирного масла и хамазулена в его составе. 8 связи с тем, что фаза развития растения может оказывать существенное влияние на содержание эфирного масла и его качественный состав, необходимо проанализировать фазы вегетации, бутонизации и цветения, так как от этого зависит выбор оптимального времени сбора сырья. В различных органах содержание и состав компонентов эфирного масла также могут отличаться, поэтому исследования листьев, корзинок и стеблей позволяют установить часть растения, которая впоследствии будет являться сырьем. Полученные образцы эфирного масла A. pontica представляют собой легкие подвижные жидкости интенсивно синего цвета с характерным ароматным полынным запахом.
Установлено, что в зависимости от фазы развития растения из травы А. pontica извлекается от 0,63 до 1,77 % эфирного масла. Синтез компонентов эфирного масла начинается на самых ранних этапах развития растения, далее содержание эфирного масла постепенно повышается и достигает максимума в фазу цветения (до 1,77 %). Выявленная динамика в содержании эфирного масла сохраняется в растениях естественных мест обитания в течение ряда лет (табл. 5). Для лекарственного растительного сырья, содержащего эфирное масло, характерен определенный срок годности, который обусловлен летучестью эфирного масла [48]. Исследование количественного содержания эфирного масла в надземной части Л. pontica в зависимости от продолжительности хранения сырья выявило, что с увеличением срока хранения происходит постепенное снижение содержания эфирного масла, при этом наибольшее снижение наблюдается на четвертый год хранения (табл. 6).
Исследование качественного состава комплекса БАВ шрота A. pontica
При определении качественного состава оксикоричных кислот было выявлено, что наиболее яркое свечение в УФ-свете характерно для вещества, идентифицированного как хлорогеновая кислота. Для подтверждения этого был сравнен УФ-спектр извлечения из шрота A. pontica с УФ-спектром спиртового раствора стандартного образца кислоты хлорогеновой (рис. 50). Установлено сходство полученных УФ-спектров, поэтому анализ количественного содержания оксикоричных кислот в шроте A. pontica проведен спектрофотометрическим методом в пересчете на преобладающий компонент - кислоту хлорогеновую.
Для выявления оптимального экстрагента для извлечения суммы оксикоричных кислот были проанализированы извлечения, полученные с использованием воды, 20, 40 и 70 % спирта этилового. Установлено, что для извлечения суммы оксикоричных кислот из шрота A. pontica оптимальным экстрагентом является спирт этиловый 40 % (табл. 31). При этом содержание анализируемой группы веществ в шроте ниже, чем в исходном сырье.
С целью исключения влияния сопутствующих веществ определение количественного содержания оксикоричных кислот проведено хроматоспектрофотометрическим методом. При определении качественного состава флавоноидов хроматографическими методами были выявлено, что после обработки хроматограмм хромогенными реактивами, наиболее ярко было окрашено вещество, идентифицированное как рутин.
Для устранения влияния сопутствующих веществ определение количественного содержания флавоноидов проведено хроматоспектрофотометрическим методом. Хроматоспектрофотометрический метод выявил, что количественное содержание флавоноидов в шроте A. pontica выше, чем в исходном сырье .
Проведенный микроскопический анализ выявил, что у растений, выращенных в условиях интродукции (экспериментальные участки СибБС при ТГУ, экспериментальные участки НСО, окр. с. Репьево), как и у растений естественных мест произрастания, устьица аномоцитные, погруженные (рис. 53, 58). Эпидерма листа извилистостенная (рис. 52, 53), особенно на нижней стороне листа, клетки верхней эпидермы более прямостенные. Извилистость стенок эпидермальных клеток характерна для всех растений независимо от места произрастания и фазы развития.
Для растений, выращенных в условиях интродукции, характерно уменьшение толщины кутикулы, т.е. данный признак ксероморфной структуры характерен только при произрастании в сухих условиях. Строение устьичного аппарата не меняется.
Листья густо опушены Т-образными тонкостенными волосками, в совокупности образующими густую войлочную «подушку». Волоски состоят из многоклеточной (чаще 2-3 клетки) ножки и длинной поперечной клетки с зауженными, иногда закрученными концами (рис. 54, 60). Место прикрепления волоска погружено, клетки эпидермы образуют вокруг «розетку». Независимо от места произрастания растения Т-образные волоски сохраняют свою структуру.
Для A. pontica, выращенной в условиях интродукции, характерны три вида терпеноидсодержащих структур: эфирномасличные железки, схизогенные вместилища и неспециализированные паренхимные клетки. Основная часть масла накапливается в эндогенных структурах: схизогенных вместилищах и паренхимных клетках (рис. 55, 56, 59, 61).
Схизогенные вместилища сопровождают элементы проводящей системы растения, содержат желтоватое маслянистое содержимое (рис. 55). Наиболее крупные вместилища расположены вдоль главных жилок, по мере удаления к краям листовой пластинки происходит уменьшение размеров вместилищ. Интродукция на строение схизогенных вместилищ не влияет; по мере развития растения от фазы вегетации к фазе цветения происходит увеличение их размеров.
Эфирномасличные железки многочисленные, крупные. Состоят из 8 (реже 6) выделительных клеток, расположенных в 2 ряда и 4 (реже 3) яруса. Клетки эпидермы, окружающие место прикрепления железки, образуют «розетку». Сверху железки покрыты кутикулярным колпачком (рис. 57, 62).
Совокупность установленных микроскопических признаков позволяет диагностировать A. pontica от других видов полыней. Обоеполые цветки широко-трубчатые, с короткими прямыми зубцами, железистые. Эфирномасличные железки выступают над поверхностью эпидермы.
Таким образом, проведенные микроскопические исследования выявили, что для растений, выращенных в условиях интродукции, характерно наличие тех же микродиагностических признаков, что и для дикорастущих растений, изменениям подвержены только размеры клеток, толщина складчатой кутикулы, количество эфирного масла.
