Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Серпуха венценосная -перспективный источник биологически активных веществ 10
1.1.Систематическое положение, ареал, местообитание, сырьевые ресурсы серпухи венценосной 10
1.2. Сведения о химическом составе видов рода серпуха 14
1.3. Применение в народной медицине, экспериментальные исследования фармакологических свойств видов рода серпуха 19
Экспериментальная часть 26
Глава 2. Материал и методы исследования 26
2.1. Характеристика материала исследования 26
2.2. Методики исследования 26
2.2.1. Методики химического исследования 26
2.2.2. Методики морфологического и микроскопического исследования 45
2.2.3. Методики товароведческого исследования 45
2.2.4. Статистическая обработка результатов 45
Глава 3. Исследование химического состава надземной части серпухи венценосной 47
3.1. Качественное обнаружение основных групп биологически активных веществ 47
3.2. Количественное определение основных групп биологически активных веществ 53
3.3. Хроматографическое и спектральное исследование фенольних соединений 57
Глава 4. Разработка методов определения подлинности и доброкачественности сырья серпухи венценосной 71
4.1. Разработка методик качественного обнаружения и количественного определения биологически активных веществ 71
4.1.1. Методики качественного обнаружения биологически активных веществ 71
4.1.2. Методики количественного определения биологически активных веществ 73
4.2. Изучение динамики накопления флавоноидов и экдистероидов в надземной части серпухи венценосной 82
4.3. Определение числовых показателей сырья 86
4.4. Определение микробиологической чистоты 90
4.5. Исследование морфологических и анатомических признаков сырья 90
Глава 5. Получение водно-спиртового экстракта серпухи венценосной и оценка его гемореологических свойств 99
5.1. Выбор рационального метода получения экстракта и оценка его качества 99
5.2. Оценка гемореологических свойств сухого экстракта 104
Выводы 108
Список литературы 110
Приложение 127
- Сведения о химическом составе видов рода серпуха
- Качественное обнаружение основных групп биологически активных веществ
- Методики количественного определения биологически активных веществ
- Выбор рационального метода получения экстракта и оценка его качества
Сведения о химическом составе видов рода серпуха
Литературные данные о биологически активных веществах, обнаруженных в растениях рода Serratula систематизированы и приведены в таблице 2.
Фитохимические исследования, проведенные в СССР и за рубежом в 1960-1990-е годы, позволили установить, что наиболее важной группой БАВ растений рода серпуха являются экдистероиды. Оказалось, что экдистероиды, первоначально обнаруженные в ничтожно малом количестве у насекомых и ракообразных распространены и в растительном мире.
Первые сведения об обнаружении экдистероидов в растительном сырье относятся к 1966 году. Койи Наканиси и сотрудники университета в г. Тохоку (Япония) изучая компоненты экстракта листьев Podocarpus пакаІІ, выделили четыре родственных соединения - понастероны А, В, С и D [135]. Вслед за открытием Наканиси понастеронов из другого австралийского вида Podocarpus elatus был выделен 20-гидроэкдизон [128], который оказался идентичен гормону линьки, выделенному из ракообразных. В одном грамме высушенной коры этого дерева содержалось гормона больше, чем в одной тонне отходов после переработки раков. Эти события вызвали массовый скрининг растений на присутствие соединений, обладающих активностью гормона линьки насекомых.
В Советском Союзе изучение экдистероидов было начато в 70-х годах, когда Я.К. Яцюк и Г.М. Сегаль сообщили о выделении экдистерона из цветочных корзинок серпухи (Serratula inermis)[117].
На территории бывшего Советского Союза большой вклад в выявлении новых экдистероидсодержащих видов внесли научные школы академика Н.К. Абубакирова (Узбекистан) и профессора Ю.Д. Холодовой (Украина). В настоящее время скрининговые исследования активно проводятся в ботаническом саду Томского государственного университета, институте биологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) и других учреждениях.
Из таблицы 2 видно, что, несмотря на имеющуюся информацию о качественном составе БАВ, химическая характеристика для большинства видов неполная, а для некоторых отсутствует. Химический состав рода представлен в основном фитоэкдистероидами и фенольными соединениями.
Основными компонентами фитоэкдистероидов серпухи венценосной являются 20-гидроксиэкдизон (около 75% от общей суммы), 258-инокостерон, а-экдизон (редкостный пример обнаружения истинного гормона линьки в растениях) [1, 55, 78, 92, 129, 130, 143]. Кроме основных, растения со-держат набор минорных экдистероидов (аюгастерон С, дакрихайнанстерон, полиподин В, таксистерон макистероны А и С, витикостерон Е, интегристерон А, а также их эфиры и гликозиды) [21, 28, 87,130, 141,142].
Сотрудниками СибБС при ТГУ была изучена динамика накопления экдистерона в серпухе венценосной произрастающей на территории Томской области и в условиях культуры по фазам развития и органам [92].
Результаты исследований показали, что количественное содержание эк-дистероидов в одних и тех же органах на разных этапах развития растений характеризуется значительными колебаниями, а качественный состав и характер сезонной динамики накопления экдистероидов в условиях культуры и в естественных местах обитания одинаков [92, 109].
Установлено, что надземная часть серпухи накапливает максимальное количество экдистерона (2%) в вегетативной фазе. По мере роста и развития растения содержание экдистерона уменьшается (1,6-1,9%), а к окончанию вегетации резко падает (0,3%). Анализ данных о распределении экдистерона по органам показал, что максимальное количество экдистерона накапливается в листьях в фазу цветения (1,7%), а в процессе развития растений он транспортируется в генеративные органы [88, 109].
Несмотря на некоторое снижение содержания экдистерона в условиях культуры, валовое содержание его в одном растении в данную фазу увеличивается за счет прироста надземной массы [92, 109].
Исследования зеленой массы серпухи, проведенные в кормовом отделе Томской областной проектно-изыскательной станции химизации сельского хозяйства, показали, что по содержанию протеина, клетчатки и золы данное растение не уступает кормовым культурам - борщевику, люцерне и окопнику. В надземной части серпухи венценосной в фазе цветения содержание протеина составляет 20,1-20,6%, клетчатки - 23,3-28%, каротина- 130-173мг/кг [109].
В Институте биологии Коми Научного центра УрО РАН был изучен аминокислотный состав серпухи венценосной [4]. Результаты исследований показали, что серпуха венценосная характеризуется высоким содержанием аспара-гиновой и глутаминовой кислот и лейцина, низким содержанием метионина и гистидина, отсутствием цистина и цистеина в листьях. В листьях растений примерно 40% от суммы аминокислот составляют незаменимые, что свидетельствует об их высокой кормовой ценности. Для бутонов характерно высокое содержание пролина (превышающего его содержание в листьях примерно в три раза), более высокое содержание метионина, тирозина и присутствие в небольшом количестве цистина, цистеина, валина и фенилаланина.
В комплексе биологически активных веществ серпухи венценосной немаловажную роль играют фенольные соединения, в частности флавоноиды
В настоящее время имеется много достоверных данных о различном фармакологическом действии флавоноидов. Флавоноиды обладают антиоксидант-ными, спазмолитическими, противовирусными, противоопухолевыми, противоязвенными, противоаллергическими, противовоспалительными, гепатопро-текторными, капилляроукрепляющими, гемореологическими и другими свойствами [22,32,38,97,145,148].
Качественное обнаружение основных групп биологически активных веществ
Как уже отмечалось ранее (Гл. I), литературные данные по химическому составу серпухи венценосной недостаточны и показывают, что наиболее подробно изучены фитоэкдистероиды. В связи с этим, нами проведен химический анализ надземной части серпухи венценосной культивируемой в Сибири на содержание наиболее значимых групп БАВ (табл.3).
Качественные реакции на основные группы БАВ проводили с водным (1:10) и водно-этанольными извлечениями различной концентрации, используя общепринятые реакции, описанные в доступной литературе [47, 76].
Фенольные соединения. Общепринятыми реакциями с растворами солей железа (железо-аммонийными квасцами и железа хлоридом) получили интенсивное черно-синее окрашивание, свидетельствующее о присутствии в извлечении фенольных соединений. Данные реакции обычно описываются для обнаружения дубильных веществ в растительном сырье, но поскольку они являются общими и для других фенольных соединений, заключение о присутствии последних, как правило, бывает недостоверным.
Обнаружение дубильных веществ проводили с использованием раствора желатина [47]. При этом наблюдали образование белой мути. Положительный результат получили с растворами 10% средней соли ацетата свинца и железо-аммонийных квасцов. На основании этого сделали заключение о присутствии в исследуемом сырье дубильных веществ.
Присутствие флавоноидов доказывали с помощью известных реакций на данную группу веществ [47, 76]. При этом одни из них, такие как с железа хлоридом и щелочами, являются общими для всех фенольных соединений. Заключение о присутствии флавоноидов в сырье сделали на основании более специфичных реакций: цианидиновая проба с цинком в присутствии концентрированной кислоты хлороводородной показала розовое окрашивание испытуемого этанольного экстракта;реакция с этанольным раствором алюминия хлорида - желтое окрашивание.
Результаты реакций свидетельствуют о присутствии флавоноидов в серпухе венценосной.
Антоцианы. Обнаружение антоцианов проводили качественными реакциями с 10 % раствором ацетата свинца основного и 10% раствором гидроксида натрия. В первом случае наблюдали темно-синий аморфный осадок, во втором - появление темно-зеленого окрашивания [17].
Для обнаружения кумаринов использовали их лактонные свойства и способность давать окрашенные растворы с диазосоединениями [47]. Появление оранжево-красного окрашивания со свежеприготовленным раствором диазотированной сульфаниловой кислоты, а также появление мути при проведении лактонной пробы указывало на возможное присутствие кумаринов в сырье.
Качественное обнаружение гидроксикоричных кислот проводили хрома-тографическим методом на бумаге в 2% кислоте уксусной. В УФ-свете при длине волны 360 нм обнаружили ряд пятен голубой, голубовато-зеленой и голубовато-фиолетовой флуоресценции, одно из них, наиболее интенсивное, на уровне пятна достоверного образца кофейной кислоты.
Присутствие алкалоидов в исследуемом сырье доказывали с помощью общеосадительных реактивов [47]: Вагнера, Драгендорфа, раствора фосфорно-молибденовой кислоты, 10% раствора танина, пикриновой кислоты и других. В результате получали кристаллические осадки различной окраски и интенсивности. Однако данные реакции могут быть положительными в присутствии и других азотистых оснований, поэтому можно только предположить наличие алкалоидов в исследуемом сырье.
Присутствие витамина К в исследуемом сырье доказывали реакцией с 2,6-дихлорфенол индофенолом (2,6-ДХФИФ). При этом наблюдали появление изумрудно-зеленой окраски, что указывает на присутствие витамина К. Кроме того, витамин К исследовали методом ТСХ на пластинке «Силуфол-254» и детектировали в УФ-свете в виде белого пятна, которое после обработки концентрированной кислотой серной с последующим нагреванием пластинки в сушильном шкафу при температуре 105С приобретало в видимом свете желтую окраску [60].
Экдистероиды обнаруживали с помощью тонкослойной хроматографии на пластинке "Kieselgel 60 F254" с Государственным стандартным образцом (ГСО) экдистерона [ИЗ]. После просмотра пластинки в УФ-свете при длине волны 242 нм отмечали неразделяемые пятна экдистероидов, на уровне пятна ГСО экдистерона. После опрыскивания пластинки 1% раствором ванилина в серной кислоте пятна экдистероидов приобретали в видимом свете желто-зеленую окраску.
Полисахариды определяли по реакции осаждения 95% спиртом этиловым, в результате наблюдали появление хлопьевидных сгустков, выпадающих в осадок при стоянии [46]. Наличие Сахаров подтверждали реакцией с реактивом Фелинга, при этом появлялся кирпично-красный осадок и по реакции с а-нафтолом и концентрированной кислотой серной, наблюдали появление на границе раздела фаз красного кольца [81].
Антраценпроизводные Заключение об отсутствии данной группы соединений делают по результатам реакции с раствором натрия гидроксида. При кипячении анализируемого сырья со щелочью не наблюдали характерное красное или красно-бурое окрашивание раствора, что свидетельствует об отсутствии антрагликозидов в данном сырье [47].
Сапонины. Для обнаружения сапонинов использовали две известные реакции: пенообразования и реакция с раствором ацетата свинца. Водное извлечение при интенсивном встряхивании практически не образовывало пену; добавление растворов натрия гидроксида и кислоты хлороводородной также не приводило к образованию устойчивой пены, что свидетельствует об отсутствии сапонинов в извлечении. Данное заключение подтверждает отсутствие осадка в реакции с раствором ацетата свинца [47].
Качественное обнаружение аминокислот проводили 0,2% этанольным раствором нингидрина в водном извлечении. Подтверждение их присутствия, а также качественный состав определяли хроматографическим методом (рис.1). Хроматографическое определение аминокислот проводили в системе растворителей БУВ 4:1:1, используя водные извлечения [51,62].
На хроматографическую пластинку «Kieselge! 60 F254» размером 150x120 мм на расстоянии 1 см от нижнего края наносили по 0,2 мл извлечения и по 0,2 мл растворов стандартных образцов аминокислот. Пластинку с нанесенными образцами помещали в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную парами растворителей, и хроматографировали восходящим способом в системе растворителей БУВ 4:1:1. После прохождения фронтом растворителя расстояния 10 см, пластинку извлекали из камеры и просушивали. Затем пластинку равномерно обрабатывали 0.2% зтанольным раствором нингидрина и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105С в течение 2-3 минут. Аминокислоты в видимом свете проявлялись в виде розово-пурпурных пятен.
Аминокислоты серпухи представлены 10 веществами. Из них по хромато-графическому поведению в сравнении с достоверными образцами свидетелями идентифицированы лизин, цистеин, гистидин, аргинин, серии, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, пролин, фенилаланин и лейцин.
Методики количественного определения биологически активных веществ
Экдистероиды Определение содержания экдистероидов проводили хроматоспектрофотометрическим методом, разработанным Якубовой с соавторами [113]. Сущность метода заключается в выделении экдистерона из полученного экстракта и измерении оптической плотности элюата при длине волны 242 нм, соответствующей максимальному поглощению, которое совпадает с максимальным поглощением раствора стандартного образца экдистерона.
При этом отрабатывали условия максимального извлечения экдистерои-дов(табл.11).
Для экстрагирования экдистероидов 1,0 (т.н.) сырья измельчали до размера частиц 1мм. Этот размер частиц в данном случае является оптимальным. В качестве экстрагента можно использовать как 70%, так и 95% спирт этиловый, поскольку достоверной разницы в количестве извлекаемых экдистероидов не отмечено, мы использовали 70% спирт этиловый. Двукратное экстрагирование осуществляли на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч и 30 мин соответственно. Затем полученное извлечение сгущали на роторном испарителе до объема 5-7 мл. Для очистки экдистерона от сопутствующих веществ, содержащихся в извлечении, использовали хроматографию в тонком слое. Хроматографирование проводили в тонком слое на пластинках "Kieselgel 60 Fi54". Пластинку делили на четыре параллельные полосы. На две из них наносили полученное извлечение в количестве 0,15-0,20 мл, на третью - раствор ГСО экдистерона в количестве 0,02 мл, четвертая полоса является фоном (холостая проба). Хроматографирование проводили в системе растворителей хлороформ-этанол-ацетон (5:3:1). После высушивания пластинки элюирование зоны экдистероидов проводили 10 мл 95% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. После фильтрования элюата измеряли оптическую плотность. Максимум поглощения, обусловленный наличием в молекуле экдистерона сопряженной с двойной связью кетогруппы, фиксировали при 242 нм на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с толщиной слоя 10 мм на фоне элюата холостого опыта. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора ГСО экдистерона.
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито по ТУ 23.2.2068-89 с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 (т. н.) измельченного сырья помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 70% спирта, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2ч. Извлечение охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию указанным выше способом повторяли еще раз в течение 30 мин. Извлечение фильтровали в ту же колбу. Объединенный экстракт сгущали на роторном испарителе (при 40С) до 5-7 мл. Пластинку делили на четыре параллельные полосы. На две из них наносили по 0,15-0,20 мл полученного извлечения, на третью - 0,02 мл раствора ГСО экдистерона, а четвертая полоса служила фоном (холостая проба) при спектрофотометрировании. Хроматографировали в системе растворителей хлороформ-этанол-ацетон (5:3:1) восходящим способом. Пластинку вынимали из камеры, высушивали в вытяжном шкафу в течение 10 мин и просматривали в УФ-свете при длине волны 242 нм. Отмечали пятна экдистероидов испытуемого раствора на уровне пятна стандартного образца экдистерона и количественно переносили их в колбы с притертыми пробками. Элюировали экдистероиды и ГСО экдистерона с сорбента 10 мл спирта этилового при непрерывном встряхивании в течение 4 часов.
Измеряли оптическую плотность отфильтрованного через бумажный фильтр элюата на спектрофотометре при длине волны 242 нм в кюветах с тол-шиной слоя 10 мм на фоне элюата холостого опыта. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора ГСО экдистерона.
Примечание.
Приготовление раствора ГСО экдистерона. Около 0,0095 г (т. н.) ГСО экдистерона, высушенного при температуре 100-Ю5С до постоянной массы, растворяли в мерной колбе вместимостью 25 мл в небольшом количестве 95% спирта этилового и доводили объем раствора 95% спиртом этиловым до метки; 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора 95% спиртом этиловым до метки.
Содержание экдистероидов в пересчете на экдистерон и абсолютно сухое сырье в процентах составляет 1,85±0,08%.
Флаеоноиды. Количественное определение суммы флавоноидов проводили, используя дифференциальную спектрофотометрию в присутствии комплек-сообразующей добавки в виде 5% раствора алюминия хлорида в этаноле. Сущность метода заключается в том, что алюминия хлорид образует комплексные соединения с флавоноидами, что сопровождается батохромным смещением полос УФ-спектра.
Расчет содержания суммы флавоноидов серпухи венценосной проводили в пересчете на рутин, так как их дифференциальные спектры совпадают по положению с максимумом ГСО рутина (А 415 нм) (рис. 1 б).
При разработке методики анализа нами решались вопросы выбора экст-рагента, соотношения сырье-экстрагент, времени, температуры и кратности экстракции (табл. 14).
В результате исследований установлено, что наиболее полное извлечение флавоноидов достигается при соотношении сырья и экстрагента 1:30 (дальнейшее увеличение этого соотношения не приводит к существенному повышению выхода флавоноидов из сырья). Для экстракции использовали 70% этанол, так как гликозиды флавоноидов практически равнозначно извлекаются как 40%, так и 70% этанолом. Достаточно проводить двукратную экстракцию из сырья по 45 и 15 минут, так как увеличение количества экстракций также не приводит к повышению содержания флавоноидов в экстракте.
Для оптимизации методики анализа нами было изучено влияние концентрации алюминия хлорида и времени комплексообразования. Установлено, что наиболее стабильные результаты получаются при использовании 5% спиртового раствора алюминия хлорида в соотношении экстракта и раствора комплексо-образователя 1:1. Время прохождения комплексообразуюшей реакции составляло 20 мин. и устойчивость комплекса сохраняется в течение 40 мин (рис. 17).
Для выяснения подчиняемое растворов алюминиевых комплексов суммы флавоноидов серпухи венценосной закону Бугера-Ламберта-Бера из одного и того же экстракта была приготовлена серия разведений и было установлено, что в области рабочих плотностей (0,2-0,8) наблюдается линейная зависимость между концентрацией испытуемого раствора и величиной поглощения.
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц проходящих сквозь сито по ТУ 23.2.2068-89 с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 (т. н.) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 30 мл 70% спирта. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 45 минут, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. После охлаждения извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли еще раз указанным выше способом в течение 15 мин. Извлечение фильтровали через тот же фильтр в ту же мерную колбу, фильтр промывали 70% спиртом этиловым и доводили объем фильтрата спиртом этиловым до метки (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25мл помещали 1мл раствора А, добавляли 1 мл раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом, I каплю уксусной кислоты и доводили объем раствора 70% спиртом этиловым до метки (раствор В). Через 20 минут измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 1мл раствора А, 1 капли уксусной кислоты, который доводили 70% спиртом этиловым до 25 мл.
Выбор рационального метода получения экстракта и оценка его качества
Для выбора рационального метода получения экстракта из серпухи нами был проведен анализ влияния ряда факторов (природа экстрагента, его концентрация, степень измельченности сырья), на выход биологически активных веществ [59, 80, 85, 86, 89, 101].
При выборе экстрагента учитывали степень гидрофильности извлекаемых веществ. Экстрагент, действуя на активный компонент смеси, влияет на полноту, скорость и качество экстракции БАВ из растительного материала. Основные действующие вещества серпухи извлекаются полярными растворителями, поэтому для исследования нами был взят этанол в концентрациях, наиболее часто применяемых для промышленного получения препаратов - 40% и 70%
С использованием этих экстрагентов нами были получены извлечения в соотношении 1:10 из сырья со степенью измельчения 3-5 мм. Результаты исследования представлены в таблице 24.
Предварительными исследованиями установлено, что оптимальным экст-рагентом является 40% этанол, извлекающий максимальное количество экстрактивных веществ и при выборе экстрагента остановились на 40% этаноле.
При изучении влияния степени измельчения растительного сбора на выход флавоноидов и экстрактивных веществ использовали сырье, измельченное до следующих размеров частиц: 1, 3 и 5 мм. В ходе исследований использовали ту же методику, что и при выборе оптимального экстрагента, в качестве экстра-гента применяли 40 % этанол. Результаты показали, что с уменьшением размера частиц сбора увеличивается выход флавоноидов (ФЛ), экдистероидов (ЭС) и экстрактивных веществ (ЭВ). Также очевидно, что с увеличением степени измельчения сырья в растворе быстрее устанавливается концентрация ФЛ и ЭС, близкая равновесной и, следовательно, сокращается время экстрагирования. Наиболее полно (на 80,21 % по ФЛ и на 76,02 % по ЭВ) происходит истощение сырья, измельченного до 1 мм. Для сырья с размером частиц 3-5 мм эти показатели отличаются незначительно. Однако сырье с размером частиц 1мм мы не стали использовать в дальнейших исследованиях, так как слишком мелкое измельчение ухудшало дренажирующую способность слоя, загрязняло извлечение балластными веществами, что вызывало трудности при очистке экстракта. Основываясь на результатах проведенных исследований, можно сделать вывод, что при разработке технологии жидкого экстракта наиболее целесообразно использовать сырье, имеющее степень измельчения 3 мм.
Известно, что от технологических свойств растительного сырья зависят полнота и скорость экстрагирования действующих веществ, расходные нормы сырья и экстрагента, управление процессом экстрагирования [89]. Поэтому нами были определены: влажность сырья, содержание действующих и экстрактивных веществ, насыпная масса, коэффициенты наполнения сухого и набухшего сырья, коэффициент вытеснения, коэффициент образования внутреннего сока и коэффициент поглощения. Результаты исследования технологических свойств растительного сырья представлены в таблице 25.
С помощью полученных коэффициентов наполнения сухого и набухшего сырья осуществляли подбор рабочего объема диффузоров. Основываясь на данных литературы [86, 89] и используя коэффициенты вытеснения, образования внутреннего сока, поглощения сырья и насыпную массу, определяли количество экстрагента, необходимое для настаивания и перколяции.
В результате проведенных исследований нами была предложена стандартная технология получения жидкого экстракта методом реперколяции по Н.А. Чулкову. Сущность метода заключается в том, что чистый извлекатель всегда поступает на наиболее истощенный растительный материал и извлекает остатки ценных веществ, поддерживая градиент концентраций. Свежее сырье всегда обрабатывается наиболее концентрированным извлечением, которое обогащается в максимальной степени экстрактивными веществами. В течение всего процесса соблюдается принцип противотока, лежащий в основе этого метода.
Сырье измельчали до размера частиц 3 мм, просеивали через сито и освобождали от пыли (сито 0,25 мм). Извлечение проводили в пяти перколяторах цилиндрической формы с установленным ложным дном. В перколятор загружали по 25,0 сырья небольшими порциями при умеренном сжатии и уплотнении и заливали экстрагентом. Подачу экстрагента осуществляли снизу через сливной кран, чтобы обеспечить максимальное вытеснение воздуха из сырья и способствовать полному контакту фаз. Уровень экстрагента доводили до «зеркала».
Перколятор оставляли на 24 часа для настаивания. Через 24 часа открывали кран первого диффузора не полностью, а с расчетом, чтобы скорость пер-коляции составляла 25-30 капель в 1 минуту. В перколятор, по мере вытекания извлечения, добавляли свежий экстрагент, чтобы растительный материал оставался покрытым сплошным слоем жидкости. Постоянное добавление экстракта и поддержка «зеркала» исключает попадание воздуха и образование в перколя-торе воздушных пространств, препятствующих полноценному экстрагированию. Через сливной кран подавали извлечение из первого перколятора во второй и доводили уровень экстрагента до «зеркала». Краны обоих перколяторов закрывали и оставляли в покое на 24 часа. Таким же образом загружали третий и четвертый перколяторы. Для заполнения каждого последующего перколятора использовалось извлечение из предыдущего. На шестой интервал времени начинался рабочий период. Из пятого перколятора получали 20 мл готового продукта, который сливали в отдельный флакон и оставляли для отстаивания.
Так как в первом перколяторе сырье достаточно истощилось, его выгружали и отжимали. Новую порцию сырья помещали в перколятор и заливали оставшимся извлечением из пятого перколятора. Объем экстрагента во всех перколяторах доводили до зеркала по общему правилу, подавая чистый растворитель во второй перколятор.
Выгрузка истощенного сырья и загрузка новой порции продолжалась и в последующие дни. Полученные извлечения объединяли, отстаивали в течение трех суток при температуре 8-10С и готовый экстракт фильтровали через складчатый бумажный фильтр.
Стандартизацию готового экстракта проводили по внешнему виду, содержанию этанола, сухому остатку и содержанию флавоноидов и экдистерои-дов.
Методика определения флавоноидов в жидком экстракте серпухи венценосной. 1 мл жидкого экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем до метки 40% спиртом этиловым {раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл раствора А, добавляли 1 мл 5% эта-нольного раствора алюминия хлорида, 1 каплю уксусной кислоты и доводили объем раствора 40% спиртом этиловым до метки (раствор Б). Через 20 минут измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из I мл раствора А, 1 капли уксусной кислоты, который доводили 70% спиртом этиловым до 25 мл.
Содержание флавоноидов в экстракте в пересчете на рутин составляло 2,66±0,13%(табл.25).
