Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Сведения литературы по растениям рода Spiraea L.-спирея 10
1.1. Ботанико-географическая характеристика растений рода спирея -Spiraea L. семейства розоцветных - Rosaceae Juss 10
1.2. Современное состояние исследований химического состава растений рода Spiraea L 17
1.3. Сведения по использованию растений рода Spiraea L. в народной медицине и изучению фармакологического действия 25
Выводы к главе 1 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
Глава 3. Фитохимическое изучение Spiraea salicifolia L., произрастающей в Восточной Сибири 34
3.1 Анализ качественного состава биологически активных веществ 5. salicifolia 34
3.2. Исследование полисахаридов надземных органов S. salicifolia 40
3.3. Изучение фенольных соединений надземных органов S. salicifolia 45
3.3.1. Исследование состава флавоноидов и фенолкарбоновых кислот методом бумажной хроматографии 45
3.3.2. Выделение и идентификация флавоноидов и фенолкарбоновых кислот 47
3.4. Исследование состава фенольных соединений листьев и цветков 5. salicifolia методом ВЭЖХ 63
3.5. Исследование состава терпеноидов и высших жирных кислот S. salicifolia методом газовой хромато-масс-спектрометрии 68
3.5.1. Изучение состава терпеноидов S. salicifolia 68
3.5.2. Изучение состава высших жирных кислот 5. salicifolia 71
3.6. Изучение качественного состава и количественного содержания аминокислот в S. salicifolia 72
3.7. Элементный состав надземных органов S. salicifolia 74
3.8. Количественное определение БАВ в надземных органах S. salicifolia 77
3.8.1. Количественное определение органических кислот и аскорбиновой кислоты 77
3.8.2. Количественное определение тритерпеновых сапонинов 79
3.8.3 .Количественное определение дубильных веществ 80
3.8.4. Количественное определение флавоноидов и фенолкарбоновых кислот 83
3.8.5. Количественное определение катехинов, процианидинов и антоцианов 85
3.8.6. Сезонная зависимость накопления фенольных соединений в надземных органах S. salicifolia 85
Выводы к главе 3 88
Глава 4. Макро- и микроскопическое исследование представителей рода Spiraea L 91
4.1. Морфология S. salicifolia и других видов, произрастающих в Восточной Сибири 91
4.2. Микроскопия S. salicifolia и других видов, произрастающих в Восточной Сибири 94
Выводы к главе 4 108
Глава 5. Стандартизация и разработка нормативной документации на сырье «спиреи иволистнои побеги» 109
5.1. Разработка показателей подлинности сырья S. salicifolia 109
5.2. Стандартизация сырья S. salicifolia по содержанию флавоноидов и фенолкарбоновых кислот 111
5.3. Разработка числовых показателей и определение срока годности сырья S. salicifolia 122
Выводы к главе 5 128
Глава 6. Разработка способа получения и стандартизация Spiraea salicifolia экстракта сухого 129
6.1. Разработка технологии экстракта сухого из побегов S. salicifolia 129
6.2. Стандартизация экстракта сухого S. salicifolia 133
6.2.1. Исследование БАВ S. salicifolia экстракта сухого 133
6.2.2. Разработка показателей подлинности и методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом S. salicifolia 133
6.2.3. Установление показателей качества и срока годности экстракта сухого S. salicifolia 138
Выводы к главе 6 134
Общие выводы 143
Список литературы 145
Приложения 163
- Современное состояние исследований химического состава растений рода Spiraea L
- Выделение и идентификация флавоноидов и фенолкарбоновых кислот
- Микроскопия S. salicifolia и других видов, произрастающих в Восточной Сибири
- Разработка показателей подлинности и методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом S. salicifolia
Введение к работе
Актуальность. В последние годы во всем мире остается высоким интерес к лекарственным препаратам, созданным на основе природного сырья. Лекарственные растения содержат биологически активные вещества (БАВ), которые обладают широким спектром терапевтического действия, малотоксичны и характеризуются стабильным фармакологическим эффектом.
В терапии большинства заболеваний используются синтетические лекарственные средства (Государственный реестр лекарственных средств, 2012). Однако, при выраженном терапевтическом эффекте, они имеют побочные действия, противопоказания и ограничения к применению, не всегда предотвращают развитие рецидива после отмены препарата (Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., 2008). Для профилактики заболеваний, при их хроническом течении рекомендуется использование в комплексной терапии лекарственных растительных средств (Соколов С.Я., 2000).
Новыми источниками растительных средств могут быть представители рода спирея – Spiraea L. На территории СНГ произрастает 22 вида рода Spiraea, в Восточной Сибири встречается 13 видов (Черепанов С.К., 1995).
Растения рода Spiraea содержат фенольные соединения (катехины, танины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины), тритерпеноиды, эфирные масла и др. (Карпова Е.А., 2011; Костикова В.А., 2012; Mughal U. et al., 2012). Для отдельных видов рода Spiraea, произрастающих в Юго-Восточной Азии характерно накопление дитерпеновых алкалоидов атизинового и гетизинового типа (Горбунов В.Д. с соавт., 1976; Li L. et al., 2002).
В Восточной Сибири наибольшее распространение имеет спирея иволистная (Spiraea salicifolia L.) В народной медицине настои листьев, отвары коры и корней этого растения используют при желудочно-кишечных, гинекологических заболеваниях, как мочегонное, а также при респираторных заболеваниях, ревматизме и гельминтозах. В монгольской медицине настой листьев S. salicifolia применяют при укусах змей (Растительные ресурсы СССР, 1991).
Сведения по применению S. salicifolia в народной медицине, достаточные сырьевые ресурсы на территории Восточной Сибири определяют перспективность изучения этого растения для внедрения в медицинскую практику. В связи с этим проведение комплексного фармакогностического исследования S. salicifolia является актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось фитохимическое изучение Spiraea salicifoliaL., произрастающей в Восточной Сибири, получение экстракта сухого, установление показателей качества сырья и экстракта сухого.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучить состав фенольных соединений, полисахаридов, терпеноидов, аминокислот, микроэлементов, жирных кислот S. salicifolia.
-
Провести количественное определение основных групп соединений. Изучить закономерности распределения и накопления некоторых групп соединений по органам и фазам развития, обосновать рациональные сроки заготовки сырья.
-
Установить макро- и микроскопические признаки S. salicifolia и близких видов рода Spiraea, произрастающих в Восточной Сибири.
-
Провести исследования по установлению норм качества сырья S. salicifolia
для включения в проект нормативной документации (ФСП).
5. Разработать технологию получения экстракта сухого и методов его
стандартизации.
Научная новизна. В результате химического исследования в побегах S. salicifolia, произрастающей в Восточной Сибири, было идентифицировано более 20 соединений, в т.ч. впервые для вида спиреозид (кверцетин-4-О-глюкозид), феруловая, 3-О-, 4-О-кофеилхинные кислоты и 1-О-кофеил-глюкоза, дигидрокверцетин, (+)-катехин, (-)-эпигаллокатехин, (-)-эпикатехин, проциандин В1 и цианидин. Методом хромато-масс-спектрометрии и ТСХ в надземных органах S. salicifolia впервые идентифицированы терпеноиды: вербенон, E-оцименон, гексагидрофарнезилацетон, изопулегол, лонгипинан, дегидроабиетиновая кислота и ее метиловый эфир, глицирризиновая, урсоловая и олеаноловая кислоты. Показано, что для цветков S. salicifolia характерно накопление 3-О-кофеилхинной кислоты, астрагалина и гиперозида; для листьев – кофеил-1-О-глюкозида, рутина и изокверцитрина; для стеблей – изокверцитрина, 1-О-кофеил-глюкоза и 3-О-кофеилхинной кислоты. Изучены полисахаридные компоненты S. salicifolia, в т.ч. водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, гемицеллюлозы А и Б. Установлено, что в их состав входят арабиноза, рамноза, глюкоза, галактоза, ксилоза и галактуроновая кислота. Исследование аминокислотного состава показало, что для листьев S. salicifolia характерно накопление -аминомасляной кислоты, цистеина и цитруллина; для цветков – аспарагина, аланина и глутаминовой кислоты. Установлено содержание в надземных органах S. salicifolia 9 макро-, 54 микро- и ультрамикроэлементов. Определены микродиагностические признаки S. salicifolia и 6 видов рода Spiraea, произрастающих в Восточной Сибири.
Практическая значимость. Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов (в пересчете рутин) и фенолкарбоновых кислот (в пересчете на кофейную кислоту) в сырье и экстракте сухом. Установлено, что максимальное накопление флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ характерно для надземных органов S. salicifolia текущего года жизни в период цветения. Предложен новый вид лекарственного растительного сырья «Спиреи иволистной побеги – Spiraeae salicifoliae cormus», на который разработаны проект ФСП, Инструкция по сбору и сушке. Разработан способ получения экстракта сухого, обладающего
противовоспалительной, мочегонной и антиоксидантной активностью. На технологию экстракта сухого получено положительное решение по заявке на выдачу Патента РФ (заявка № 2013150048/15 (077894)).
Степень внедрения. Материалы диссертации вошли в методическое пособие «Растения рода Спирея – Spiraea L. флоры Центральной Сибири (географическое распространение, морфология, микроскопия)» (Иркутск, 2013.–27 с.), которое внедрено в учебный процесс на кафедре фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии, на факультете повышения квалификации провизоров ИГМУ. Результаты исследований по стандартизации сырья S. salicifolia внедрены в работу аналитической лаборатории ООО «Шалфей» (г. Иркутск).
На защиту выносятся:
- результаты фитохимического исследования надземных органов S.
salicifolia, исследования по изучению закономерностей накопления БАВ в
зависимости от некоторых экологических факторов;
результаты макро- и микроскопического исследования S. salicifolia и некоторых представителей рода Spiraea, произрастающих в Восточной Сибири;
результаты исследований по стандартизации сырья S. salicifolia;
- результаты по разработке технологии и показателей качества
экстракта сухого.
Личное участие автора. Автором проведен анализ сведений литературы по теме диссертационной работы, выполнены экспериментальные исследования, обработаны и проанализированы полученные результаты. Фрагменты работы по изучению состава фенольных соединений методом микроколоночной ВЭЖХ проведены совместно с д.ф.н. Оленниковым Д.Н. – старшим научным сотрудником ФГБУН «Института общей и экспериментальной биологии СО РАН». Соискателем подготовлены доклады, тезисы, статьи, оформлена диссертация и автореферат.
Апробация полученных результатов. Основные положения и результаты работы доложены и обсуждены на: межрегиональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011, 2012, 2013); международной конференции «Renewable Wood and Plant Resourse – Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина» (Санкт-Петербург, 2011); региональной конференции «Актуальные вопросы охраны населения регионов Сибири» (Красноярск, 2011); Всероссийской Байкальской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины» (Иркутск, 2011, 2012, 2013); I Всероссийской заочной научно-практической конференции «Новые технологии в промышленности и сельском хозяйстве» (Бийск, 2012); «VII международной конференции молодых ученых медиков» (Курск, 2013).
Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по комплексной теме «Изучение перспективных лекарственных растений Восточной Сибири» (номер государственной регистрации 01.2.00304320).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 5 статей - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МОиН РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, четырех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 46 таблицами и 32 рисунками. Библиографический указатель включает 186 источников, из них 31 - на иностранных языках.
Современное состояние исследований химического состава растений рода Spiraea L
Химический состав растений рода Spiraea начали изучать еще в XIX веке. В 1838 году итальянский химик Р. Пириа выделил из цветочных почек спиреи салициловый альдегид [64, 108].
В видах рода Spiraea разными авторами обнаружены алкалоиды [156, 178, 179]; кумарины; цианогенные гликозиды; флавоноиды, производные кверцетина, кемпферола, апигенина, лютеолина; фенолкарбоновые кислоты -сиреневая, ванилиновая, гентизиновая, коричная, п-кумаровая, феруловая, кофейная; лейкоантоцианидины; катехины; дубильные вещества; сапонины; полисахариды; каротиноиды [66, 123, 186].
В 1974-1976 гг Т.К. Чумбаловым с соавторами в S. hypericifolia, произрастающей в Казахстане, исследовался состав флавоноидов производных флавана. Из данного вида были выделены и идентифицированы (+)-катехин, (-)-эпикатехин и гликозиды катехина: 7-0-сс-1,-рамнопиранозид-(+)-катехина, 7-0-/?-Г -ксилопиранозид-(+)-катехина, 7-(9-а--арабинозид-(+)-катехина. Из производных флавона S. hypericifolia выделены апигенин, лютеолин и их 5-0 гликозиды: апигенин-5-0-/?- -глюкопиранозид, лютеолин- 5- O-fi-D глюкопиранозид (табл. 1) [147-150].
В S. vanhouttei (Briot) Zab. (спирея Вангутта) являющейся гибридом между S. cantoniensis и S. trilobata, произрастающей в районе Кавказских Минеральных Вод, найдены флавоноиды рутин (кверцетин-3-0-/?- -глюкорамнозид), кверцетин, лютеолин, апигенин. В ней также найдены кофейная и хлорогеновая кислоты, органические кислоты - яблочная, лимонная, янтарная, аскорбиновая. Качественными реакциями в надземных органах S. vanhouttei найдены дубильные вещества конденсированной группы, тритерпеновые сапонины [26].
В листьях S. vanhouttei было найдено суммы флавоноидов в пересчете на рутин 3,88±0,13%, дубильных веществ - 8,66±0,08%, полисахаридов - 10,16±0,10%, алкалоидов - 0,042±0,003% [4, 5].
В S. salicifolia, произрастающей в Корее, В.Т. Ahn с соавторами в 1996 году идентифицированы гиперозид, кверцетин-3-0-(6"-(9-сс-1, арабинопиранозил)-/?- -галактопиранозид, коричная кислота, п гидроксикоричная кислота, и-метоксикоричная кислота, 1-0-кумароил-/?-/ глюкопиранозид, 1-0-кофеил-/?-)-глюкопиранозид [176].
Присутствие кемпферола, кверцетина, астрагалина и рутина указывается зарубежными исследователями для листьев и соцветий S. salicifolia и S. media [169].
Пакистанскими учеными (U.R. Mughal с соавт.) в S. brahuica исследовался состав флавоноидов (табл.1, рис. 3).
В надземных органах S. brahuica были идентифицированы флавоноиды рамназин, цинарозид (табл. 1). Впервые для растений рода Spiraea из этого растения были выделены и идентифицированы новые бифлавоноиды: спарин А (рамнетин-4 - 9-4"-изорамнетин), спарин В (3-метилрамнетин-4 -04"-рамназин). Кроме того, из S, brahuica выделен флавоноид 3 -метилапигенин-7-/?-/)-глюкопиранозид, названный авторами спарин С [164].
В.А. Костиковой проводилось исследование фенольных соединений в 9 видах рода Spiraea, произрастающих в природных популяциях Дальнего Востока, а также в культивируемых видах, растущих в Амурском филиале Ботанического сада института ДВО РАН. Методом ВЭЖХ было установлено, что астрагалин, кверцетин и кемпферол присутствуют в спиртовых экстрактах всех изученных таксонов рода Spiraea. Гиперозид был обнаружен во всех видах, кроме подвидов S. ussuriensis. Рутин обнаружен у 6 видов рода Spiraea (S. betulifolia, S. beanverdiana, S. media, S. ussuriensis, S. pubescens, S. salicifolia). Все исследованные виды содержали и-кумаровую кислоту [75, 76].
Анализ содержания отдельных компонентов в видах Spiraea, произрастающих на Дальнем Востоке России из разных местообитаний, проведенный В.А. Костиковой и Г.И. Высочиной по данным ВЭЖХ, показал, что по содержанию фенольных соединений виды спиреи разделяются на три группы. Первую группу образуют S. flexuosa, S. ussuriensis subsp. ussuriensis и S. ussuriensis subsp. elegans, которые отличаются достаточно высоким содержанием коричной кислоты и кемпферола. Следующую группу образуют & media (var. media и var. sericed), S. dahurica, S. pubescens из секции Chamaedryon. В видах этой группы кверцетин превалирует над кемпферолом, причем эта группа отличается наибольшим содержанием кверцетина; п-кумаровая кислота у этих видов рода Spiraea содержится примерно в одинаковом количестве. Третью группу представляют S. betulifolia, S. beauverdiana, S. salicifolia, S. humilis, которые отличаются отсутствием коричной кислоты. В растениях этих видов гс-кумаровой кислоты содержится значительно больше, чем в других, а количество кверцетина преобладает над кемпферолом [74].
К. Yochida с соавторами в S. cantoniensis Lour, найдены флавоноловые 5-кофеилгликозиды: кверцетин-3-0-(6-0-кофеил)-/?-галактозид; кемпферол-3-О-(6-0-кофеил)-/?-галактозид; кемпферол-3-(6-(3-кофеил)-/?-глюкозид [165].
В ходе изучения сибирских и дальневосточных видов рода Spiraea L. {S. ussuriensis, S. flexuosa, S. elegans, S. humilis, S. betulifolia) E.K. Карповой и T.A. Поляковой хроматоспектрофотометрическим методом установлено содержание флавоноидов в надземных органах этих видов до 5%, суммы фенолкарбоновых кислот и кумаринов более 1%, оксикоричных кислот около 1%. В составе фенольных соединений этих видов были обнаружены гликозиды флавонов, флавонолов, а также коричная кислота, хлорогеновые кислоты и кумарины [64-66, 108].
Содержание сапонинов в соцветиях дальневосточных видов рода Spiraea колеблется от 0,7 до 5,5%. Более 5% сапонинов содержится в соцветиях S. betulifolia, S. media, S. ussuriensis, S. salicifolia [64, 108]. В S. vanhouttei проводилось количественное определение тритерпеновых сапонинов спектрофотометрическим методом в пересчете на кислоту урсоловую. В листьях было найдено суммы сапонинов 6,3±0,24% [26].
Виды S. hypericifolia, S. crenata флоры Северного Кавказа накапливают -макроэлементы: К, Са, Mg, Fe; микроэлементы: Cr, Mg, Mn, Mo, Zn, Al, Ва, Li, Se, Ni, Sr, Pb, I, Br; в значительном количестве накапливают: Ва, Sr, Se [25]. Листья S. vanhouttei содержат в достаточном количестве почти все незаменимые макро- и микроэлементы и накапливают К, Р, Ва, Fe, Al, Si, Mn. Исследования показали, что содержание макроэлементов в анализируемых образцах колеблется в зависимости от видовой специфичности, но характеризуется относительно близкими величинами [26].
Кроме того, в растениях рода Spiraea найдены дитерпеновые алкалоиды атизинового и гетизинового типа. В.Д. Горбуновым с соавторами в 1976 году были исследованы алкалоиды S. japonica. Авторами были выделены алкалоиды гетизинового типа: спирадин А и новый алкалоид, названный спиредином (рис. 4) [37].
Зарубежными авторами при изучении видов спирей, произрастающих в Китае, S. japonica var. acuta Yu и S. japonica var. ovalifolia были выделены и идентифицированы дитерпеновые алкалоиды атизинового и гетизинового типа (рис. 4) [162, 166, 180, 181, 185].
Выделение и идентификация флавоноидов и фенолкарбоновых кислот
Для установления структуры флавоноидов и фенолкарбоновых кислот S. salicifolia провели их разделение методом колоночной хроматографии в сочетании с препаративной бумажной хроматографией [59, 91].
Побеги S. salicifolia (300 г) экстрагировали 70%) спиртом этиловым в соотношении сырье экстрагент 1:10 в течение 2 ч при нагревании на водяной бане с обратным холодильником. Экстракцию повторяли дважды. Спирт отгоняли, водный экстракт отстаивали при температуре +5С в течение 2-х суток. Полученный осадок отфильтровывали и отбрасывали, водный остаток обрабатывали хлороформом по 100 мл три раза. Хлороформное извлечение отбрасывали (рис. 8). Для выделения агликонов флавоноидов в части очищенного водного извлечения S. salicifolia проводили кислотный гидролиз. Сумму флавоноидов гидролизовали 1% кислотой хлористоводородной, для этого к очищенному водному экстракту (100 мл) добавляли 28 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревали с обратным холодильником на водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения гидролизат фильтровали через фильтр «синяя лента», фильтр высушивали и обрабатывали 150 мл 95% спирта этилового, нагретого до 80С. Спиртовой раствор суммы агликонов концентрировали до 50 мл. Разделение суммы агликонов проводили методом восходящей хроматографии на бумаге марок «Filtrak FN-12, 16» в системе н-бутанол-кислота уксусная лед. - вода (4:1:2).
После высушивания хроматограммы просматривали в УФ-свете, зоны агликонов флавоноидов со значениями Rf 0,69 и 0,78 отмечали и вырезали. Агликоны элюировали 95% спиртом этиловым при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин.
Для очистки от сопутствующих веществ растворы агликонов флавоноидов пропускали через полиамидный сорбент на колонках диаметром 10 мм с высотой сорбента 15 см.
Очищенные растворы агликонов концентрировали, при добавлении воды очищенной получали осадки агликонов, которые отфильтровывали и высушивали. Было получено 2 агликона Аг-1 и Аг-2.
Идентификацию выделенных соединений проводили по хроматографическому поведению и данным спектрального анализа [69, 91].
Вещество Аг-1. Кристаллическое вещество желтого цвета состава С15Н10О7, растворимое в этаноле, нерастворимое в воде и хлороформе. Температура плавления из этанола 316-318С. Значения Rf в 15% уксусной кислоте 0,03; БУВ (4:1:2) - 0,69 (табл. 6).
В УФ-спектре (ЕЮН) имеется два максимума поглощения (258 нм и 370 нм), разница между ними составляет 112 нм, что характерно для флавонолов (рис. 9).
Наличие в электронном спектре плеча при 274 нм указывает на присутствие свободных гидроксильных групп в 3 , 4 положениях кольца В, что подтверждается также батохромным сдвигом на 22 нм при добавлении натрия ацетата и кислоты борной [11].
Под влиянием натрия ацетата первая полоса электронного спектра дает батохромный сдвиг на 5 нм, что указывает на свободную гидроксильную группу в 7 положении. При добавлении к раствору Аг-1 алюминия хлорида наблюдается батохромный сдвиг максимума перовой полосы на 66 нм, устойчивый при добавлении кислоты хлористоводородной, что свидетельствует о наличии свободных гидроксильных групп в 3 и 5 положениях.
Присутствие этилата натрия вызывает батохромный сдвиг на 34 нм, который постепенно снижает свою интенсивность, что подтверждает присутствие свободной гидроксильнои группы в 4 положении.
По результатам проведенного анализа в сравнении со стандартным образцом соединение Аг-1 идентифицировано как 5,7,3 ,4 -тетрагидроксифлавонол (кверцетин).
Вещество Аг-2. Кристаллы светло-желтого цвета состава С НюОб, растворимые в этаноле, эфире и нерастворимые в воде и хлороформе. Температура плавления из этанола 269-272С. Значения Rf в 15% уксусной кислоте 0,02 БУВ (4:1:2) - 0,78.
В УФ-спектре (ЕЮН) имеется два максимума поглощения (266 нм и 367 нм), разница между ними составляет 101 нм, что характерно для флавонолов (рис. 9). Присутствие одной свободной гидроксильнои группы в кольце В доказывается отсутствием в электронном спектре плеча II полосы (табл. 6) [141].
Батохромный сдвиг I полосы на 57 нм от прибавления алюминия хлорида, устойчивый в кислой среде, вызывает гидроксильная группа в положении 5.
Свободная гидроксильная группа в положении 7 подтверждается батохромным сдвигом I полосы на 20 нм при добавлении безводного натрия ацетата.
Добавление этилата натрия вызывает батохромный сдвиг на 49 нм, который снижает свою интенсивность, что характерно для гидроксильнои группы в 4 положении кольца В.
По результатам проведенного анализа в сравнении со стандартным образцом соединение Аг-2 идентифицировано как 5,7,4 -тригидроксифлавонол (кемпферол).
Проведенный анализ показал, что флавоноиды S. salicifolia являются в основном производными кверцетина и кемпферола. Далее из спиртового извлечения S. salicifolia провели выделение нативных флавоноидов. Для выделения индивидуальных соединений использовали колоночную хроматографию на полиамидном сорбенте. Элюирование проводили водой очищенной, спирто-водными смесями с возрастающей концентрацией этанола и 95% спиртом этиловым. Состав элюатов исследовали бумажной хроматографией в 15% кислоте уксусной (табл. 5).
Элюаты с близким составом объединяли и дополнительно очищали на небольших колонках с полиамидным сорбентом. Очищенные элюаты концентрировали, проводили кристаллизацию.
Вещество Ф-1. Кристаллы светло-желтого цвета состава С21Н20О12, хорошо растворимы в воде, этаноле низкой концентрации, не растворимые в хлороформе, эфире. Температура плавления из этанола 236-237 С. Значения Rf в системах 15% уксусная кислота - 0,32; БУВ (4:1:2) - 0,67 (табл. 4).
Микроскопия S. salicifolia и других видов, произрастающих в Восточной Сибири
Лист. В поперечном срезе лист спиреи иволистной дорзовентральный, т.е. клетки столбчатой паренхимы примыкают к верхнему эпидермису [98]. Столбчатая паренхима однорядная. Эпидермис сосочковидный, особенно на нижней стороне листа (рис. 16).
Проводящий пучок центральной жилки коллатеральный, с хорошо заметным камбием, окружен склеренхимой. Под эпидермисом располагается одно-, двурядная колленхима.
В поверхностных препаратах эпидермис верхней стороны листа с прямыми многоугольными стенками. Клетки, находящиеся у основания волоска, располагаясь радиально, образуют 5-6 лучевую розетку. Волоски простые одноклеточные, тонкостенные размером 170 - 200 мкм, они часто опадают, и тогда в центре розетки обнаруживается округлый валик. Крупные жилки покрыты многочисленными одноклеточными волосками. По краю листа располагаются крупные толстостенные одноклеточные волоски размером 740 - 890 мкм. Клетки нижнего эпидермиса мелкие и извилистые с многочисленными. Устьичный аппарат аномоцитного типа (рис. 17).
Черешок листа. В поперечном срезе черешок листа подковообразный с небольшими ушками, покрыт однослойным эпидермисом с редкими одноклеточными волосками. Под эпидермисом слой однорядной колленхимы, ушковидные выросты полностью заполнены колленхимой. Проводящий пучок находится в центре черешка. В основной паренхиме встречаются крупные друзы (рис. 18).
Венчик. Клетки эпидермиса наружной и внутренней стороны венчика многогранные, устьица редкие. Эпидермис по краям венчика сосочковидный. Клетки эпидермиса у основания лепестков имеют прозенхимную форму. Наружный эпидермис у основания лепестков венчика покрыт многочисленными одноклеточными волосками (рис.19).
Чашечка. Клетки эпидермиса наружной стороны чашечки многогранные, внутренней - извилистостенные, с редкими устьицами. Эпидермис на зубцах чашечки сосочковидный, с многочисленными одноклеточными волосками (рис. 20). На внутренней стороне чашечки располагается мелкогородчатый цветочный диск, у которого в основной паренхиме располагаются многочисленные мелкие друзы, образующие шлейфы между крупными жилками (рис. 19, В)
Стебель. Стебель спиреи иволистной в поперечном срезе имеет округлую форму. Однолетний стебель осенью покрыт двухрядной пробкой (рис. 21). Первичная кора с большими межклетниками. Во вторичной коре -2-3 ряда лубяного волокна, образующего сплошное кольцо. Флоэма хорошо заметна, в основной паренхиме встречаются редкие друзы. Клетки флоэмы тонкостенные, многогранной формы. Сосуды ксилемы крупные, округлые с одревесневшими стенками, располагаются радиальными рядами. В древесине между крупными сосудами имеется либриформ. Сердцевинные лучи одно- и двухрядные. Сердцевина объемная с одревесневшими стенками, с более крупными клетками в центре.
У трехлетнего стебля видны годичные кольца. Слой пробки утолщается до 3-4 рядов. Лубяные волокна лежат группами в виде прерывистого кольца. Над лубяными волокнами располагается двухрядная колленхима.
Стебли текущего года с прямостенным удлиненным эпидермисом с одноклеточными тонкостенными волосками, такими же, как на листьях и толстостенными одноклеточными волосками размером 550 - 680 мкм (такими же, как на листовых черешках) (рис. 22).
Микроскопия порошка побегов текущего года S. salicifoiia. Микропрепараты порошка под микроскопом представляют собой смесь из различных частиц:
- фрагменты листовой пластинки с многочисленными крупными друзами в мезофилле по всей поверхности листа. Видны клетки эпидермиса многоугольные или слабоизвилистые (рис 23, А).
- фрагменты чашечки с сосочковидным эпидермисом и многочисленными одноклеточными тонкостенными часто извилистыми волосками (рис. 23, Б-1).
- фрагменты цветочного диска с многочисленными мелкими друзами (рис. 23, В);
- клетки эпидермиса язычка венчика многогранные с сосочковидными выростами у основания с одноклеточными волосками (рис. 23, Г).
- фрагменты тычинок (тычиночные нити, пыльники) (рис. 23, Б-2, Д).
- фрагменты стебля с вытянутыми эпидермальными клетками со следами от прикрепления волосков (рис. 23, Е);
- фрагменты верхней части стебля обильно покрыты одноклеточными извилистыми волосками (рис. 23, Ж).
Для выявления отличительных микроскопических признаков спиреи иволистнои исследовали анатомическое строение листьев других видов спиреи, наиболее часто встречающихся в Восточной Сибири.
Spiraea media
На поперечном срезе черешок листа сглажено четырехгранный, проводящий пучок располагается в центре. Под однорядным эпидермисом расположена многорядная колленхима.
При рассматривании листа с поверхности обнаружили, что клетки верхней стороны эпидермиса слабо извилистые, а нижней - более извилистостенные. Устьичный аппарат аномоцитного типа. Волоски одноклеточные толстостенные размером 789 - 919 мкм. В мезофилле листа -многочисленные друзы (рис. 24).
Spiraea flexuosa
В поверхностных препаратах листа клетки верхнего эпидермиса многоугольные со складчатой кутикулой, клетки нижнего эпидермиса -слабо извилистые, с сосочковидными антиклинальными стенками. Устьица располагаются на нижнем эпидермисе. Устьичный аппарат аномоцитного типа. Волоски одноклеточные прямые или слабо извилистые, толстостенные размером 545 - 641 мкм. В мезофилле имеются друзы оксалата кальция (рис.
Spiraea pubescens
Эпидермис листьев S. pubescens верхней и нижней стороны прямостенныи многоугольный, устьица располагаются на нижней стороне листа, устьичный аппарат аномоцитный. Волоски тонкостенные, извилистые, одноклеточные размером 166-174 мкм, обильно располагаются на нижней стороне листа по ходу крупных жилок. Основания волосков расширяются в большой валик. В мезофилле редко встречаются крупные друзы (рис. 26).
Spiraea dahurica
Верхний эпидермис листьев S. dahurica прямостенный, многоугольный, нижний эпидермис со слабо извилистыми стенками, устьица только на нижней стороне листа, устьичный аппарат аномоцитный (рис. 27).
Волоски на листьях двух типов: тонкостенные одноклеточные размером 120-148 мкм, по краю листа и толстостенные одноклеточные размером 396-478 мкм по жилкам. Друзы крупные, располагаются по жилкам.
Spiraea alpine
В поверхностных препаратах клетки верхнего эпидермиса прямостенные, клетки нижнего эпидермиса мелкие прямостенные, вытянутые, с сосочковидными выростами. Устьичный аппарат нижней стороны листа аномоцитного типа. По краю листа и крупным жилкам встречаются одноклеточные толстостенные волоски размером 575-685 мкм и многочисленные одноклеточные тонкостенные волоски размером 177 -203 мкм. В мезофилле листа - редкие крупные друзы, по главным жилкам наблюдаются тяжи из мелких друз (рис. 28).
Spiraea aquilegifolia
Клетки эпидермиса на листьях прямостенные, многоугольные. Устьица располагаются только на нижней стороне листа. Клетки эпидермиса вокруг волосков образуют розетку. Листья обильно покрыты многочисленными тонкостенными одноклеточными волосками от 475 до 715 мкм. В мезофилле наблюдаются крупные друзы (рис. 29).
Разработка показателей подлинности и методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом S. salicifolia
Описание. Порошок коричневого цвета, со специфическим ароматным запахом. Гигроскопичен. Растворим в воде при нагревании и 40% спирте этиловом.
Для определения подлинности экстракта сухого предлагается качественная реакция: - 0,1 г экстракта сухого растворяют в 20 мл 40% спирта этилового при нагревании на водяной бане в течение 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр. К 2 мл фильтрата прибавляют 1 мл 1% аллюминия хлорида появляется желтое окрашивание (флавоноиды);
Хроматография. 0,1 г экстракта сухого растворяют в 10 мл 40% спирта этилового и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при температуре 65С в течение 10 мин. Охлаждают и фильтруют (далее поступают как при анализе сырья S. salicifolia (стр. 109)).
Стандартизацию экстракта сухого предлагается проводить по содержанию суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот. Для этого нами были использованы методики, которые рекомендованы для анализа сырья - побегов S. salicifolia.
Изучение дифференциального УФ-спектра спиртового раствора экстракта в присутствии алюминия хлорида показало, что максимум поглощения в длинноволновой области находится при 412 нм и совпадает с максимумом поглощения рутина в комплексе с алюминием хлоридом (рис. 32). На основании этого в качестве стандартного образца мы использовали ГСО рутина.
Для растворения экстракта сухого предлагается использовать 40% спирт этиловый. Максимальное значение оптической плотности в реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом достигается через 40 мин и комплекс остается стабильным до 60 мин, необходимое количество 1% спиртового раствора алюминия хлорида 2 мл.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в экстракте сухом. Около 0,25 г (точная навеска) экстракта сухого помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40% спирта этилового, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 15 мл фильтрата (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют 2 мл 1% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят раствор до метки 95% спиртом этиловым. Через 40 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А, 1 капли 10% раствора кислоты уксусной и доведенный 95% спиртом этиловым до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Для определения отсутствия систематической ошибки методики провели опыты с добавками ГСО рутина на 3-х уровнях концентрации. Относительная ошибка с добавками не превышает относительную ошибку методики, что указывает на отсутствие систематической ошибки (табл. 40).
Для количественного определения фенолкарбоновых кислот применяли спектро фотометрический метод с использованием в качестве стандартного образца кофейную кислоту, т. к. максимум поглощения спиртового раствора S. salicifolia экстракта сухого при 325 нм и совпадает с кофейной кислотой.
Методика количественного определения суммы фенолкарбоновых кислот в экстракте сухом. Около 0,25 г (точная навеска) экстракта сухого сырья, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40% спирта этилового, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения раствор фильтруют, отбрасывая первые 15 мл фильтрата (раствор А).
0,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объём раствора 95% спиртом этиловым до метки.
Оптическую плотность раствора определяют на спектрофотометре при длине волны 325 нм в кювете с длиной рабочего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют 95% спирт этиловый.
Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчёте на кофейную кислоту и воздушно-сухой экстракт в процентах (X) рассчитывают по формуле: -50-50-100 т-782-0,5-(Ю0-Г) где D - оптическая плотность испытуемого раствора; т — масса сырья, v;W-потеря в массе при высушивании сырья, %; 782 - удельный показатель поглощения кофейной кислоты при 325 нм.
Для проверки воспроизводимости разработанной методики количественного определения суммы фенолкарбоновых кислот проведено 9 независимых определений, ошибка составляла 2,56% (табл. 41).
Отсутствие систематической ошибки было доказано в опытах с добавками СО кофейной кислоты. Относительная ошибка среднего результата не превышала относительную ошибку методики (табл. 42).
Разработанные методики количественного определения суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот предложены для стандартизации S. salicifolia экстракта сухого.
