Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Биофармацевтические исследования лекарственных веществ: фармакокинетика и биотранс формация 10
1.1 Фармакокинетические подходы к изучению генетически детерминированных биохимических процессов метаболизма лекарственных веществ 10
1.2 Методы биофармацевтичекого анализа в оценке активности ферментов метаболизма лекарственных веществ 26
1.3 Целенаправленная регуляция ферментативной активности ферментов 35
Глава2 Объекты и методы исследования 41
2.1 Постановка задач исследования 41
2.2 Аппаратура, объекты и техника эксперимента 44
Глава 3 Разработка методов определения тест-препаратов процессов ацетилирования и окисления в биологических жидкостях 49
3.1 Спектрофотометрическое определение гидразида изоникоти-новой кислоты в виде производного с метаванадатом аммония 51
3.2 Спектрофотометрическое определение антипирина в слюне в виде нитрозопроизводного 61
Глава 4 Методы биофармацевтического анализа в оценке генетически детерминированной ферментативной активности 66
4.1 Разработка неинвазивных методов оценки активности N-ацетил-трансферазы 67
4.2 Разработка неинвазивных методов определения активности микросомальных оксидаз печени человека на основе оценки содержания антипирина в слюне 73
4.3 Оценка активности холинэстеразы крови человека при использовании спектрофотометрического детектирования аналитических реакций 82
Глава 5 Биофармацевтические методы в целенаправленной регуляции ферментативной активности и ее оценка при различных патологических состояниях 85
5.1 Влияние различных лекарственных средств на фармакокинетику тест-препаратов процесса ацетилирования 86
5.2 Оценка активности генетически детерминированных ферментативных систем организма человека и их сопоставительный анализ 96
5.3 Фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при различных патологических состояниях 102
5.3.1 Генетически детерминированные процессы ацетилирования у больных с хирургическими инфекциями 102
5.3.2 Фармакокинетика ацетилирования и окисления у больных сахарным диабетом 2 типа 109
5.3.3 Оценка фенотипа ацетилирования у больных ангиной на фоне базисной терапии и приеме ксимедона 117
Заключение 122
Выводы 123
Литература 124
Приложения 155
- Методы биофармацевтичекого анализа в оценке активности ферментов метаболизма лекарственных веществ
- Аппаратура, объекты и техника эксперимента
- Спектрофотометрическое определение антипирина в слюне в виде нитрозопроизводного
- Разработка неинвазивных методов определения активности микросомальных оксидаз печени человека на основе оценки содержания антипирина в слюне
Введение к работе
Актуальность темы. Для осуществления эффективного и безопасного применения лекарственных средств (ЛС) необходимо всестороннее изучение механизма качественных и количественных изменений лекарственных веществ (ЛВ) в биологических жидкостях организма человека, а также оценка влияния различных факторов на фармакокинетику ЛВ при использовании современных методов биофармацевтического анализа.
Генетически детерминированные особенности организма могут существенно влиять на все этапы фармакокинетики и метаболизма лекарственного препарата. В связи с этим совершенствование применения лекарственных препаратов включает индивидуальную оптимизацию режимов их дозирования на основе комплексной оценки фармакокинетических параметров и особенностей биотрансформации, а также проведение терапевтического мониторинга лекарств. При этом для решения комплекса проблем, связанных с разработкой новых методов биофармацевтического анализа ЛВ, весьма перспективным является использование фармакокинетических подходов для оценки генетически детерминированных процессов метаболизма лекарственных препаратов в организме человека.
Большинство ЛС подвергается биотрансформации путем протекания окислительных процессов с участием генетически детерминированной ферментативной системы цитохромов Р450, а процессы метаболизма аминосо-держащих ЛВ в организме катализируются ферментом N-ацетилтрансфе-разой (NAT). В связи с этим особую значимость для биофармацевтических исследований приобретает изучение фармакокинетики ЛВ, являющихся тест-препаратами этих генетически детерминированных процессов. В тоже время биосубстраты являются сложными по составу матрицами, представляющими собой совокупность соединений различной природы.
Ряд факторов приводит к вариабельности фармакокинетических параметров ЛС. К ним можно отнести индукцию и репрессию ферментов биотрансформации, а также формирование определенных фенотипов под действием ряда патологических факторов. Эти факторы позволяют прогнозировать пути регулирования фенотипов ацетилирования и окисления для оптимизации дозирования ЛС на основе оценки индивидуальных фармакокинетических профилей, что существенно повысит эффективность и безопасность фармакотерапии различных заболеваний.
Цель работы состояла в разработке комплекса методов биофармацевтического анализа тест-препаратов генетически детерминированных ферментативных процессов ацетилирования и окисления в организме человека, а также оценке влияния различных факторов на фармакокинетику этих лекарственных веществ.
Диссертационная работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 03-03-96241) и Академии наук Республики Татарстан (проекты 09-9.2-112/2003, 09-9.2-112/2004, 09-9.2-275/2005).
Научная новизна:
- на основании систематического исследования аналитических реакций тест-препаратов ацетилирования и окисления выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека;
- обоснованы и установлены условия аналитических определений в биофармацевтическом анализе гидразида изоникотиновои кислоты и антипирина, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации этих соединений;
- разработаны методы косвенного определения активности N- ацетилтрансферазы и цитохромов Р450 путем изучения фармакокинетики гидразида изоникотиновои кислоты и антипирина в слюне и моче при
использовании спектрофотометрического детектирования их производных с аналитическими реагентами, также обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии и в предиктивной медицине;
- впервые изучена фармакокинетика гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном, при этом выявлено индукционное влияние ксимедона на активность фермента N- ацетилтрансферазы;
- впервые установлены доза-зависимые и временные схемы введения ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов ацетилирования;
- изучена фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами, при этом установлены пути целенаправленного регулирования активности ферментов при этих патологических состояниях для оптимизации терапии;
- изучены закономерности соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также установлено достоверное повышение активности сывороточной холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с другими типами ацетилирования.
Практическая значимость. Разработан комплекс методик установления фенотипа ацетилирования на основе спектрофотометрического определения содержания свободного гидразида изоникотиновой кислоты при экскреции с мочой из организма человека. Разработаны методики чувствительного и избирательного спектрофотометрического определения антипирина в слюне человека. Методы рекомендованы и апробированы в клинических условиях при оптимизации безопасной дозировки ЛВ, оценки риска интоксикации, побочных явлений при фармакотерапии.
Предложен новый индуктор NAT - отечественный иммуномодулятор ксимедон. Доза-зависимые и временные схемы введения ксимедона использованы в лечении сахарного диабета 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами с целью получения оптимального лечебного эффекта.
Результаты работы используются в фармакокинетических исследованиях (Казанский государственный медицинский университет), для обеспечения медицинской защиты личного состава (Министерство обороны РФ) и внедрены в лечебную практику Республиканской клинической больницы Татарстана (Казань), Казанской городской инфекционной клинической больницы, поликлиники Казанского Научного Центра Российской академии наук.
Экспериментальные результаты и выводы на их основе использованы в учебном процессе Казанского государственного технологического университета в дисциплине "Контроль качества лекарственных препаратов".
На защиту выносится:
• Результаты исследования и подбор оптимальных условий спектрофото-метрического определения тест-маркеров ацетилирования и окисления с аналитическими реагентами.
• Методики биофармацевтического анализа гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в биологических жидкостях организма человека.
• Данные по фармакокинетике гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина при их экскреции слюной и мочой в организме человека.
• Способы определения фенотипа ацетилирования и окисления при изучении фармакокинетики тест-препаратов гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в слюне и моче пациентов и результаты их применения в клинических условиях.
• Данные по фармакокинетике гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном и доза-зависимые и временные параметры индуцирующего эффекта ксимедона на активность N-ацетилтрансферазы.
• Данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами.
• Закономерности соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также активности сывороточной холинэстеразы у быстрых и медленных ацетиляторов.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), IV Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы химического анализа» (Саратов, 2004), II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2004), XII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), IV Терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2005), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), VI Республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2005).
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 6 статей, 8 тезисов докладов и подана заявка на патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав экспериментальной части, в которых описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения; списка используемой литературы. В приложении представлены акты использования результатов диссертационной работы.
Диссертация изложена на 154 страницах, содержит 27 рисунков, 35 таблиц, 6 схем, список использованной литературы включает 276 источников.
Выражаю благодарность к.м.н., доценту Погорелъцеву В.И. за консультации по клинико-фармакологическим вопросам.
Методы биофармацевтичекого анализа в оценке активности ферментов метаболизма лекарственных веществ
Наиболее перспективными способами оценки индивидуальных особенностей генетически детерминированных процессов являются неинвазивные методы с использованием тест-препаратов.
При использовании тест-маркеров открывается несколько положительных аспектов: во-первых, использование неинвазивных методов отбора проб биологических жидкостей, простота, возможность повседневного использования процедуры, чувствительность и специфичность методов биофармацевтического анализа для анализируемого компонента, который будет обнаружен, возможность стандартизации процедур биофармацевтического анализа [107]. Во-вторых, появляется возможность отличить группы с различными дозами экспозиции и оценить меж- и внутрииндивидуальную вариабельность [108].
Значительная вариабельность фармакокинетических параметров существует при попадании в организм человека ЛВ. При этом существует большое количество внешних и внутренних факторов, потенциально усиливающих восприимчивость организма к воздействию химических веществ. Чтобы исключить эти негативные влияния, тест-препараты могут быть применены с целью предсказания возможных последствий токсического воздействия. С другой стороны тест-препараты используются при разработке новых фармацевтических препаратов для комплексной оценки их безопасности последних [109-111].
С помощью тест-препаратов определяют индивидуальные особенности различных генетически детерминированных ферментных систем при использовании современных методов биофармацевтического анализа. В качестве тест-препарата могут быть использованы ЛВ, метаболизирующиеся с помощью определяемого фермента. Фенотипирование осуществляется как по количеству свободного вещества, так и по количеству его метаболитов. Использование биохимических фенотипов служит реальной возможностью прогноза при применении ЛС, поскольку на фактическую ферментативную активность влияет множество экзогенных и эндогенных факторов. Одним из наиболее широко известных примеров того, как по выведению тест-маркеров можно определить фенотип индивида, является метаболический полиморфизм окислительных ферментов и NAT [58-60,112,113].
Биофармацевтичекие методы оценки активности ферментативных систем окисления. В настоящее время активность микросомальных оксигеназ (МО) определяется прямыми и косвенными методами. Прямые методы включают в себя биофармацевтический анализ биопсийных проб ткани печени, косвенные же методы предполагают определение фармако-кинетических параметров выведения ЛВ из организма или оценку активности с помощью эндогенных маркеров биотрансформации [114,115]. При использовании прямых методов определения активности МО существуют технические трудности пробоподготовки, так как они включают в себя травматические процедуры отбора биоптата печени [114]. Аналитические определения осуществляются в основном хроматографическими методами с использованием методов разделения и концентрирования. Так, при определении активности ферментов CYP 450, в ходе которого в качестве тест-препарата использован варфарин, содержание самого препарата и его метаболитов (6-,7-,8-, 10-гидроксиварфина) контролируется методом ВЭЖХ с масс-спектральным детектором, а ПрО при этом ЛВ достигает 2 нмоль [116]. Также описано использование метода ВЭЖХ с флуоримесцентным детектированием аналита по оценке ингибирующего эффекта на метаболические системы тестостерон - его 6-гидрокси метаболита (CYP ЗА) [114], эстрадиол - 2-гидроксиэстрадиол (CYP ЗА4) [118], на биотрансформацию 4-аминометил-7-алкоксикумарина и эметина путем О-деалки-лирования (CYP 2D6, CYP ЗА4) [119,120].
Прямые методы определения активности МО могут проводиться с такими биологическими образцами, как кровь, в частности, с лимфоцитами и моноцитами крови, а также кожей и волосяными фолликулами [114]. Тем не менее удовлетворительные результаты были получены только при помощи ВЭЖХ и радиоиммунологических методов биофармацевтического анализа [27].
Массовые клинические исследования по определению активности МО направлены на выяснение фенотипических особенностей метаболизма ксенобиотиков конкретным человеком, поэтому весьма актуальным становится использование неинвазивных подходов биофармацевтического анализа. Они основаны на введении в организм обследуемого тест-препаратов и изучения параметров кинетики его выведения в биожидкостях, таких как моча, слюна, смывы с поверхности кожи и т.д. [114,121,122]. В литературе показаны характерные отличия в активности изоферментов системы цитохрома Р450 для различных этнических групп [123-125].
Для фенотипирования окислительного метаболизма широко используются соединения, подвергающиеся гидроксилированию, окислению по сере и азоту, деалкилированию [1,2].
Распространенными косвенными методами определения активности МО являются хроматографическое, спектрофотометрическое, спектрофлури-метрическое определения такого фармакокинетического параметра, как величина периода полувыведения ЛВ на основе определения их концентрации в крови [126,127]. Для определения скорости биотрансформации тест-маркеров часто применяется определение отношения количества введенного ЛВ к количеству экскретируемого за определенное время метаболита или чистого вещества. Для фенотипирования процессов окисления широкое практическое применение приобрел антипириновый тест [121]. Диапазон колебаний периода полувыведения антипирина у взрослого здорового человека колеблется от 5 до 22 часов [1]. В таблице 1.5 представлены средние значения периода полувыведения антипирина в группах здоровых людей с различными скоростями метаболизма препарата.
Аппаратура, объекты и техника эксперимента
В качестве аналитического реагента в работе использован метаванадат аммония, который имел квалификацию х.ч. Спектры поглощения соединений регистрировали на спектрофотометре СФ-26, оптическую плотность исследуемых растворов в УФ-области измеряли в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Кислотность растворов контролировали рН-милливольтметром MV-87S. В работе использована центрифуга К-23 (Janetszki). В работе были использованы лекарственные препараты в виде таблеток изониазид (по 0,3 г), ксимедон (по 0,25 г), пиридоксина гидрохлорид (витамин В6), пантетенат кальция (по 0,5 г) и ранитидин (по 0,15 г) фармакопейной чистоты.
Также использовался димефосфон в виде 15%-ного водного раствора. Фенотип ацетилирования и активность ХЭ определялись в группе контроля, включающей 120 вариабельно отобранных человек без патологии печени и почек, фенотип окисления - в группе контроля из 39 человек. Возрастная категория группы составила 18-25 лет, масса тела обследуемых составляла от 55 до 85 кг. С группой контроля сопоставлялись результаты, полученные для опытных групп. Рассматривалось одна группа из 30 человек с применением индукторов и репрессоров, а также три группы с различными патологиями. Первую группу составляли испытуемые с хирургической инфекцией гнойно-септического профиля из 62 человек. Возрастная категория группы составила 18-55 лет, масса тела обследуемых составляла от 55 до 90 кг. Вторую группу составили больные сахарным диабетом 2 типа в количестве человек. Третью группу набирали из больных с инфекционными ангинами. Были обследованы 85 больных ангиной (57 женщин и 28 мужчин) в возрасте от 17 до 35 лет. Фенотип ацетилирования определялся по количеству несвязанного тест-препарата, выведенного с мочой испытуемого, а фенотип окисления — со слюной. Моча у испытуемых собиралась в течение 6 часов после введения тест-препарата [143-145], слюна собиралась в течение 12 часов [121]. Забор крови производился в биохимических лабораториях на базе лечебных учреждений.
Активность ХЭ определялась методом Эллмана в сыворотке крови [100]. Анализ мочи производили в день сбора образцов, сыворотку крови и образцы слюны анализировали как в день пробоотбора, так и при допустимой заморозке проб на срок до семи дней. Для изучения индукции и репрессии генетически детерминированных процессов оценивалась фармакокинетика изониазида и антипирина до и после разового или курсового приема ЛС - регуляторов ферментативной активности. К ним относятся такие ЛВ, как ксимедон, пиридоксина гидрохлорид (витамин В6), пантетенат кальция, ранитидин. Химические соединения промышленного изготовления, использованные в работе, очищены перегонкой, перекристаллизацией по известным методикам. Контроль чистоты веществ проведен с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, по температурам плавления и рефрактометрически [211]. Экспериментальные результаты подвергались статистической обработке по известным методикам. При оценке результатов из п определений использовали среднее арифметическое значение, стандартное отклонение S и относительное стандартное отклонение Sr, которые находили по известным формулам [210,211]: Для выбора доверительного интервала среднего значения полагали Р = 0,95. Конечный результат выражали в виде X ± 6. Статистическая обработка проводилась с помощью компьютерных программ Origin 4.0 и Excel. Достоверность распределения фенотипических выборок пациентов оценивали по t-критерию Стьюдента [210,211]. Фармакокинетические параметры рассчитывались с помощью программ M-IND [212] и Mathcad 11. Расчеты мольных долей и константа устойчивости комплекса ванадия (V) с ГИНК проводились доктором химических наук, профессором Юсуповым Р.А посредством программ EQ-V(V) и Stinger [213,214]. С помощью программы EQ-V(V) оцениваются вероятность существования различных форм комплексных соединений, в которых в качестве комплексобразователя выступает ванадий (V), а в роли лиганда - ГИЬЖ. Существование различных форм рассчитывается в мольных долях. Затем посредством программы Stinger оценивались ступенчатые константы устойчивости.
Спектрофотометрическое определение антипирина в слюне в виде нитрозопроизводного
Для идентификации антипирина Государственная фармакопея РФ рекомендует реакцию его взаимодействия с нитритом натрия в сильнокислой среде [230]. Продуктом этого взаимодействия является окрашенный в изумрудно-зеленый цвет нитрозоантипирин:
Реакция взаимодействия антипирина с нитритом натрия в кислой среде широко используется при проведении антипиринового теста. Антипирин используется при этом в качестве тест-маркера процессов микросомального окисления. Основой фармакокинетических исследований является определение концентрации антипирина в крови или других биологических жидкостях. Антипирин обладает способностью хорошо всасываться и распределяться в организме [1]. Вследствие этого после введения антипирина его концентрация в плазме крови, слюне, плевральной и спинномозговой жидкости почти одинакова.
В течение долгого времени активность окислительных ферментов определяли по периоду полувыведения антипирина, который оценивался по исчезновению этого соединения из крови [121,128]. Однако забор крови представляет собой весьма травматичную и технически трудную процедуру в связи с необходимостью создания условий для забора и хранения крови.
В связи с этим впоследствии были разработаны неинвазивные методы определения периода полувыведения антипирина по концентрации этого препарата в слюне [129,130]. Нами была оценена возможность определения антипирина и модернизирован ранее применяемый метод оценки активности окислительных ферментов. Было изучено, что максимум поглощения 4-нитрозоантипирина наблюдается при длине волны 350 нм (рис. 3.9).
Оптимальную концентрацию нитрита натрия при проведении реакции нитрозирования определяли экспериментально. Для этого поддерживали постоянную концентрацию антипирина (10"4 моль/л) и условия проведения дереватизации, а ее изменяемым параметром являлась концентрация нитрита натрия. Как видно по рисунку 3.10, при содержании нитрита натрия 0,1 мл после 20 минут термостатирования и при 0,07 мл при часовом термостатировании происходило количественное завершение аналитической реакции. Следовательно, можно сделать заключение, что при определении антипирина оптимальной концентрацией нитрита натрия при данных условиях является его десятикратный избыток при двадцатиминутном термостатировании и семидесятикратный избыток при часовом термостатировании. Использование двадцатиминутного термостатирования является более оптимальным и удобным, как вследствие экономии времени, так и вследствие исключения погрешности при заборе слишком маленьких объемов реагента.
Возможность избирательного определения антипирина в слюне оценивали методом «введено - найдено» (таблица 3.4). В пробирку вводили разные концентрации антипирина, доводили слюной, отделенной от белков до 3 мл и после 5 мин термостатирования при 25С добавляли 0,05 мл 4н серной кислоты и 0,1 мл 0,2%-ного раствора нитрита натрия. После 20 мин инкубирования определяли количество антипирина спектрофотометрическим методом. Полученные данные показывают, что при выбранных условиях детектирования нитрозоантипирина компоненты слюны не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрическое определение ЛВ.
При этом количество выведенного антипирина определяют по градуировочному графику. Зависимости оптической плотности от концентрации линейны для области концентраций 5-Ю"5 - 10"3 М: Предел обнаружения антипирина при указанных условиях спектрофотометрического определения снижается до 1,88 мкг/мл.
Построение градуироеочного графика. На аналитических весах взвешивается навеска антипирина массой 0,018 г. Далее она количественно переносится в мерную колбу вместимостью 100 мл путем растворения в дистиллированной воде и доводится этим растворителем до метки. Концентрация полученного исходного раствора составляет 188 мкг/мл ГИНК (С=10 3 моль/л).
Для построения градуировочного графика в пробирки помещаются аликвоты исходного раствора антипирина (С=10"3 моль/л) объемом 0,3; 1,2; 2,4; 3,0; 6,0; 12,0 мл и доводятся дистиллированной водой до 30 мл. Полученная серия растворов соответствует концентрациям антипирина 1,88; 7,52; 15,04; 18,80; 37,60; 75,20 мкг/мл. Пробирка помещается в термостат на 5 мин при температуре 25С. Затем, не извлекая пробы из термостата, добавляются 0,5 мл 4н серной кислоты и 1,0 мл 0,2%-ного раствора нитрита натрия. Инкубация продолжается в течение 20 мин. Далее оптическая плотность измеряется на спектрофотометре при длине волны 350 нм и толщине кюветы 1 см. По полученным результатам строится градуи-ровочный график зависимости оптической плотности от концентрации антипирина, выдержанной в мкг/мл.
Разработка неинвазивных методов определения активности микросомальных оксидаз печени человека на основе оценки содержания антипирина в слюне
Как известно, скорость элиминации из организма ЛВ, подвергающихся биотрансформации, зависит от активности ферментных систем, отвечающих за данный вид метаболизма [1,2]. Одной из основных ферментных систем, расположенной в печени, является система ферментов цитохрома Р450. Она отвечает за процессы ферментативного окисления чужеродных для организма веществ, обеспечивая тем самым их детоксикацию. Для этой группы ферментов также характерен полиморфизм метаболизма. Индивидуумы по типу окисления были фенотипированы как «быстрые», «средние» и «медленные». Для фенотипирования окислительного метаболизма широко используются ЛВ, выступающие в роли тест-маркеров и подвергающиеся биотрансформации с помощью ферментов системы цитохрома Р450. В качестве тест-маркера для определения фенотипа окисления наиболее часто используется антипирин [121,128-130].
Весьма распространенным фармакокинетическим параметром для фенотипирования является определение величины периода полувыведения антипирина на основе определения его концентрации в крови или слюне. Как правило, эти определения осуществляются хроматографическими (ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ), реже спектрофотометрическими, спектрофлуориметрическими и радиоиммунными методами [121,126,127].
Однако на практике необходимо учитывать, что фармакокинетические параметры антипирина могут существенно меняться при воздействии различных факторов среды, курении, а также различных заболеваний, индивидуальных особенностей аналитика [121]. Для расчета времени полувыведения препарата обычно строят график зависимость логарифма концентрации от времени, которое прошло с момента принятия тест-маркера. Полученная прямая линия пересекается с осью ординат, определяя начальную концентрацию антипирина. Время, необходимое для уменьшения величины начальной концентрации наполовину, соответствует времени полуэлиминации антипирина [1,121]. Данный метод имеет ряд недостатков. Во-первых, экспериментально полученные результаты не всегда дают линейную зависимость, поэтому построение прямой всегда предполагает некоторое усреднение, что допускает погрешность в нахождении начальной концентрации, а также времени полувыведения антипирина. Во-вторых, построение кинетических кривых и расчет времени полувыведения представляет собой достаточно долгую и многостадийную процедуру.
В связи с этим нами был предложен метод для определения активности МО на основе количественной оценки антипирина в слюне. В основе этого метода лежит спектрофотометрическое определение антипирина в свободной от белков слюне, концентрация ЛВ в которой коррелирует с его концентрацией в плазме крови. При определении фенотипа окисления антипирин однократно перорально вводился пациенту в дозе 0,6 г. Слюну собирали каждые три часа в течение 12 часов после приема тест-препарата. Проводили пробоподготовку анализируемых биосубстратов. Для депротеинизации содержащихся в слюне белковых компоненты при анализе добавляли подкисленный 10%-ный раствор сульфата цинка и 4,2%-ной раствор гидроксида калия. Было установлено, что с изменением продолжительности центрифугирования до 10-15 минут также повышается и эффективность удаления белковой матрицы из анализируемых образцов.
Методика определения фенотипа окисления. Антипирин принимают однократно перорально в дозе 0,6 г утром натощак. Слюну собирают через каждые 3 часа в течение 12 часов. Для осаждения твердых частиц слюну центрифугируют в течение 10 минут. В пробирки вносят по 2 мл надосадоч-ной жидкости, 2 мл дистиллированной воды, 2 мл цинкового реактива (100 г ZnSCU растворяют в 1 л 1,2 %-ого раствора серной кислоты), 2 мл 0,75н гидроксида калия (по каплям). Встряхивают раствор в течение 30 с. Далее производят центрифугирование в течение 15 минут. По 3 мл чистого супернатанта каждого образца переносят в пробирки и помещают в термостат на 5 мин при температуре 25С. Затем, не извлекая пробы из термостата добавляют 0,05 мл 4н серной кислоты и 0,1мл 0,2%-ного раствора нитрита натрия. Инкубацию продолжают в течение 20 мин. Далее оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 350 нм. Количество выведенного антипирина определяют по градуировочному графику.
Фенотип окисления определяли по количеству выведенного со слюной антипирина суммарно за 12 часов. Критерии фенотипирования обследуемых на «быстрых», «средних» и «медленных» окислителей и степень достоверности разработанного метода представлены в таблице 4.3. Была оценена достоверность результатов для тримодального распределения фармако-кинетических параметров выведения антипирина. По параметрическому критерию Стьюдента нулевая гипотеза опровергалась в обоих случаях на 0,1%-ном уровне значимости (Р 0,001, tst=2,66). Это значит, что с уверенностью можно говорить о достоверности разработанного метода и возможности с помощью него фенотипировать инактиваторов антипирина на три группы: быструю, среднюю и медленную [229].
Данные о содержании антипирина в трехчасовых пробах в слюне пациентов после его перорального введения в дозе 0,6 г представлены в таблице 4.4. В литературе [20,243] указывается, что концентрация препаратов в слюне пропорциональна их концентрации в крови. Исходя из этого положения, а также, учитывая характер распределения концентрации препарата в слюне, для обработки данных предложена фармакокинетическая модель, представленная на рисунке 4.3. В схему распределения антипирина (рис. 4.3) включена «задержка по времени» (так называемый параметр time-lag - г). Этот параметр позволяет учесть «запаздывание» концентрации препарата, связанное с эффектом первичного прохождения через печень [20,114]. Предполагаем, что все процессы всасывания препарата в системный кровоток, распределения и элиминации следуют кинетике первого порядка. Рисунок 4.3 Фармакокинетическая модель распределения антипирина у пациентов после его перорального введения. Камера «0» - область введения антипирина (ЖКТ); камера «1» - тест-ткань; Dpo - доза (количество) препарата, введенное пациентам; кА - константа скорости накопления препарата в тест-ткани; ке1 - константа скорости элиминации препарата; т -задержка по времени (time-lag) С учетом этих предположений математическое описание распределения антипирина в слюне (в тест-ткани) можно представить в аналитической форме следующим эмпирическим уравнением: kA - константа скорости накопления препарата в тест-ткани (аналог константы скорости всасывания); kel - константа скорости элиминации препарата; т - задержка времени (time-lag); Fa - степень всасывания препарата в системный кровоток (биодоступность); Vx - наблюдаемый объем распределения препарата.
![Влияние флавоноидов на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных систем при токсическом поражении печени [Электронный ресурс]](/i/i/4303/205437.png "Влияние флавоноидов на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных систем при токсическом поражении печени [Электронный ресурс] Додонов Николай Сергеевич")
