Введение к работе
Актуальность проблемы. Перспективность исследований лекарственных растений народной медицины несомненна для современной отечественной фар-мации. При введении таких растений в медицинскую практику в первую оче-редь следует проводить целый комплекс исследований, устанавливающих их видовую принадлежность и очерченностъ границ вида.
Во многих родах, в том числе и лекарственных растений с богатым видовым составом,отмечено такое широко распространенное явление, как полиморфизм, который затрудняет видовую идентификацию растений при осуществлении за-готовки лекарственного растительного сырья и создает необходимость опреде-ления глубины этой изменчивости на уровне генома растения.
Многие лекарственные растения обладают аберратными формами размноже-ния (например, апомиксисом) или склонны к образованию межвидовых гибри-дов. Эти проблемы характерны для большого числа лекарственных растений семейств: розоцветные, бобовые, гречишные, кипрейные, сложноцветные и др. Некоторые виды из этих семейств применяются в научной медицине, а такие как представители рода манжетка, язвенник, ястребинка, кипрей и многие дру-гие являются перспективными для отечественной научной медицины. Разработка оптимальных методик изучения лекарственных растений будет спо-собствовать сохранению ценных сырьевых ресурсов (В.В.Алёхин, 1938).
В связи с этим вопросы совершенствования определения равноценности ви-дов при изучении лекарственных растений с использованием новейших дости-жений науки обоснованы и своевременны. Актуально введение в практику оте-чественного здравоохранения новых видов лекарственного растительного сы-рья и расширение ассортимента препаратов обладающих противовоспалитель-ным, противоопухолевым лимфотропным и др., действием.
Также актуальным является расширение арсенала методов определения под-линности. Это может быть сделано в настоящее время, в частности с привлече-нием наиболее современных и перспективных молекулярно-биологических ме-тодов.
Известно, что манжетки способны образовывать агамный комплекс (V.Grant, 1981), который находится на стадии поздней зрелости и его агамоспермная су-перструктура достигает полного развития.Такие популяции являются непрерыв ным источником возникновения агамоспермных микровидов.
В роде манжетка выделено четыре группы, одна из которых – Vulgares не яв-ляется монотипной и её границы до сих пор не ясны (S. Frhner, 1986),так как описано несколько амфимиктических видов и множество апомиктических ага-мных видов. Манжетки этой группы предложено трактовать, как агамный ком-плекс (V.Grant, 1981). Для некоторых из них в пределах Европейской части России установлен факультативный апомиксис (К.П.Глазунова, 1977,1987). У манжетки обыкновенной высокая изменчивость проявляется в наличии много-численных форм,групп особей или отдельных экземпляров,среди которых мно-гие агамные виды описаны по морфологическим признакам: опушение, разме-ры и геометрическая форма вегетативных, генеративных органов или их частей. Кроме того, отмечено наличие многочисленных переходных форм и значитель-ные колебания хромосомных чисел от 64 до 146. Только на территории Евро-пейской части нашей страны описано более 56 видов манжетки. Некоторые ис-следователи относят к манжетке обыкновенной пять-шесть агамных видов, та-ких как м. балтийская, м. изящная, м.остролопастная, м. близкая, м. горная и м. голостебельная (К.П. Глазунова, 1990). Другие исследователи к популяции ман-жетка обыкновенная относят до двенадцати видов (С.К. Черепанов,1981), также с дискретно различающимися морфологическими вариантами, при этом часто их принадлежность к группе манжетка обыкновенная не совпадает у раз-ных авторов.
Всё это затрудняет фармакогностическое изучение этих ценных лекарствен-ных растений, разработку рекомендаций по сбору сырья и его осуществление.
Недостаточность одних лишь морфологических признаков для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости в роде манжетка заста-вило прибегнуть к привлечению дополнительных молекулярно-биологических методов, в частности, для характеристики геномов.
Для многих других ценных лекарственных растений идентификация также не разработана на должном современном уровне, поэтому разработка методичес-ких подходов к изучению лекарственных растений с использованием молеку-лярно-биологических методов актуальна.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры фармакогнозии и является фрагментом разрабатываемой комплексной темы: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учётом антропогенных факторов», № 01.200.110546.
Молекулярно-биологическая часть эксперимента выполнена в отделе эволю-ционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, по теме: «Геносистематика и молекулярная фило-генетика про- и эукариот», № госрегистации: 0187.0095927
Цель и задачи исследования. Цель исследования – разработать методичес-кие подходы к изучению лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения, используя молекулярно-биологические и фармакогнос-тические методы, направленные на прогнозирование перспективных сырьевых источников получения отечественных лекарственных средств. Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Определить характер изменчивости в популяциях модельного рода манжетка – Alchemilla L., с помощью полимеразной цепной реакции со случайными прай- мерами (RAPD-метод)
2. Оценить внутривидовую и популяционную изменчивость на фоне отсутствия корреляции с внешними устойчивыми морфологическими признаками его видов.
3. Изучить возможность применения характеристик геномов в фармакогности-ческом анализе. Провести сравнительное изучение с использованием RAPD-анализа лекарственных растений различных семейств, родов и разных морфо-логических групп.
4. Показать возможность использования для изучения перспективных и лекар-ственных растений секвенирования ДНК с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petB-petD) и на примере рода Аnthylis L., Провести филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.
5. Провести изучение химического состава полифенолов и аминокислот ман-жетки, исследовать его взаимосвязь со строением геномов лекарственных рас-тений.
6. Изучить вопросы стандартизации сырья трава манжетки, разработать крите-рии идентификации (внешние и анатомические признаки, качественные харак-теристики), числовые показатели и установить их нормы.
7. Выявить природные запасы и определить урожайность травы манжетки.
8. Разработать алгоритм изучения перспективных лекарственных растений с аберратными формами размножения.
Научная новизна результатов исследования. Показана возможность при-менения молекулярно-биологических методов для фармакогностического ана-лиза. С использованием RAPD-анализа, на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.
Изучена взаимосвязь между особенностью строения геномов видов манжетки и химическим составом полифенольного и аминокислотного комплекса. Изуче-ние полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных про изводящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.
Показана перспективность применения молекулярно-биологических методов, RAPD-анализа и секвенирования для изучения лекарственных растений и для идентификации лекарственного растительного сырья на примере сырья расте-ний семейства розоцветные, бобовые, яснотковые, буковые, гречишные, кип-рейные, астровые.
Проведено изучение сырьевой базы травы манжетки, установлены границы полиморфизма Alchеmilla vulgaris L., что позволило определить урожайность, при ежегодных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий.
Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья – трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отечественной медицины.
Исследование безопасности настоя травы манжетки показало, что он может быть отнесен к группе практически нетоксических средств, так как однократ-ное введение в желудок максимально возможной дозы настоя травы манжетки не вызывало гибели животных в течение двух недель наблюдения, кроме того, выявлена его антиметастатическая активность.
Разработан алгоритм изучения лекарственных растений народной медицины, (в том числе и для - обладающих аберратными формами размножения).
Практическая значимость полученных результатов. Нами показана воз-можность применения молекулярно-биологических методов для идентифика-ции лекарственного растительного сырья.
Разработаны оптимальные методики для идентификации свежего и высу-шенного лекарственного растительного сырья с использованием RAPD-анали-за. С использованием молекулярно-биологических и традиционных фармако-пейных методов установлены характеристики подлинности и качества травы манжетки и разработаны проект Фармакопейной статьи «Трава манжетки», проект «Инструкции по сбору и сушке», а также проект Общей фармакопей-ной статьи «RAPD-анализ лекарственного растительного сырья».
Изучены сырьевая база и вопросы стандартизации сырья трава манжетки, в том числе подобрана методика количественного определения суммы флавоно-идов, определён и выделен ценный полифенол, обладающий противоопухоле-вой активностью – агримониин.
На основании изучения геномов и полифенольного комплекса для медицин-ского применения рекомендованы 12 видов рода Alchemilla L. Данные филоге-нетического анализа и ботанико-фармакогностического изучения легли в осно-ву проекта инструкции по заготовке сырья трава манжетки.
С помощью RAPD-анализа даны геномные характеристики 17-ти видам растительного сырья.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты оценки сравнительного изучения геномов различных видов рода манжетка – Alchemilla L., с использованием RAPD-анализа и определение характера изменчивости.
2. Данные применения RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья.
3. Результаты применения секвенирования ДНК лекарственных растений для их фармакогностического изучения.
4. Результаты изучения взаимосвязи строения геномов с содержанием полифе-нолов и аминокислот для изучаемых видов рода манжетка.
5. Результаты изучения запасов травы манжетки.
6. Данные по стандартизации травы манжетки.
7. Результаты разработки алгоритма изучения перспективных видов лекарст-венных растений с использованием молекулярно-биологических и фармако-гностических методов.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции «Формирование приорететов лекарст-венной политики (Москва, 28-29 июля 1995), на Первом международном сим-позиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 1-5 августа 1995), на научной конференции, посвя-щенной 50-летию ботанического сада ММА им.И.М. Сеченова (Москва, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва. 21-25 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции «Традиционные методы лечения – основные направления и перспективы развития» (Москва,14-16 мая 1998), на интернациональном симпозиуме «Plant Evolution in Man-made Habitats” (Vena, August 10-15, 1998), на заседании Московского общества фито-терапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соедине-ниям (Москва, 28-30 апреля 2004г),на научно-практической конференции «Со-временные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (1-3марта 2007г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах - 9.
Объем и структура диссертации
