Содержание к диссертации
Введение
Глава1. Обзор литературы 10
1.1. Ботанико-фармакогоностическое описание лекарственного растительного сырья туи и багульника болотного 10
1.1.1. Описание лекарственного растительного сырья туи 10
1.1.2. Описание лекарственного растительного сырья багульника болотного 11
1.1.3. Компонентный состав биологически активных веществ лекарственного растительного сырья туи и багульника болотного 13
1.1.4. Фармакологическое действие и применение лекарственного растительного сырья туи, багульника болотного и их препаратов в официальной и народной медицине 17
1.1.5. Применение туи, ледум и их препаратов в гомеопатии 21
1.2. Использование физико-химических методов для анализа биологически активных веществ
лекарственного растительного сырья и препаратов туи и багульника болотного 22
1.2.1. Анализ терпеноидов 22
1.2.1.1. Хроматографические методы 22
1.2.1.2. Спектральные методы 34
1.2.2. Анализ фенольных соединений 35
1.2.2.1. Хроматографические методы 35
1.2.2.2. Спектральные методы 40
1.2.2.3. Использование физико-химических методов для анализа гомеопатических лекарственных средств туи и ледум 42
Выводы к главе 1 45
Экспериментальная часть.
Пояснение к эксперименту 46
ГЛАВА 2. Изучение компонентного состава сырья и настоек матричных гомеопатических туи и ледум 51
2.1. Анализ БАВ настоек гомеопатических матричных туи и ледум методом ТСХ 51
2.2. Идентификация и количественное определение БАВ сырья и настоек гомеопатических матричных туи и ледум методом хромато-масс-спектроскопии 58
2.2.1. Изучение компонентного состава БАВ эфирных масел туи и ледум 61
2.2.2. Исследование спирторастворимой фракции эфирного масла туи 68
2.2.3. Изучение компонентного состава БАВ настоек туи и ледум 69
2.2.4. Разработка метода количественного определения сесвитерпеновых спиртов в настойке ледум гомеопатической матричной методом УФ-спектрофотометрии 79
2.2.5. Изучение компонентного состава разведений настойки туи гомеопатической матричной методом хромато-масс-спектрометрии 89
Выводы к главе 2 95
ГЛАВА 3. Исследование фенольных соединений настоек матричных гомеопатических туи и ледум 97
3.1. Анализ фенольных соединений настоек гомеопатических матричных туи и ледум хроматографическ*:ми методами 97
3.1.1. Метод ТСХ 97
3.1.2. Метод ВЭЖХ 104
3.2. Анализ фенольных соединений настоек гомеопатических матричных туи и ледум методом УФ-спектрофотометрии 109
Выводы к главе 3 117
ГЛАВА 4. Исследование аминокислотного состава настоек матричных гомеопатических туи и ледум 119
4.1 Изучение аминокислотного состава настоек туи и ледум методом ТСХ 119
4.2 Изучение аминокислотного состава настоек с помощью аминокислотного анализатора (метод ВЭЖХ) 125
Выводы к главе 4 131
Общие выводы 133
Литература 136
Список работ, опубликованных по
Теме диссертации 148
Приложения 151
- Описание лекарственного растительного сырья багульника болотного
- Хроматографические методы
- Изучение компонентного состава БАВ эфирных масел туи и ледум
- Метод ТСХ
Введение к работе
Актуальность темы. Гомеопатическая медицина С.Ганемана, созданная в начале прошлого века, продолжает успешное развитие в нашем столетии. Гомеопатия, как и аллопатия, является неотъемлемой частью медицины. В настоящее время открываются пути к их взаимному обогащению и комплексному лечению многих заболеваний. Природное происхождение гомеопатических лекарственных средств - одно из главных преимуществ гомеопатии, обуславливающее популярность этого метода.
Признание гомеопатии на государственном уровне в России способствовало развитию гомеопатического метода лечения и гомеопатической фармации. Наивысшим признанием гомеопатии является промышленный выпуск гомеопатических лекарственных средств по единой технологии, предложенной автором. Выпуск эффективных гомеопатических лекарственных средств невозможен без создания государственных стандартов в виде общих и частных фармакопейных статей.
Для изготовления гомеопатических лекарственных средств часто используют матричные настойки, содержащие сложные биологически активные вещества (БАВ), компонентный состав которых зависит от меняющихся факторов окружающей среды.
В последнее время повышаются требования к качеству гомеопатических лекарственных средств, и, соответственно, к качеству настоек гомеопатических матричных. Поэтому разработка объективных методов контроля качества БАВ гомеопатических настоек с использованием современных методов анализа, с последующим включением их в нормативную документацию, является актуальной проблемой.
Туя западная и багульник болотный издавна применяются в медицине, в том числе и в гомеопатии, для лечения различных заболеваний кожи, суставов и органов дыхания. Широкий спектр действия изучаемых лекарственных растений и их препаратов обусловлен комплексом БАВ: терпеноиды, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты. По данным литературы туя и багульник относятся к эфирномасличному сырью, основной группой БАВ которого являются терпеноиды. Что и позволило объединить исследования данных объектов.
Гомеопатические лекарственные средства туи и ледум в соответствии с требованиями зарубежных гомеопатических фармакопеи и отечественных НД изготавливают на основе матричных настоек из свежесобранных побегов туи и высушенных побегов ледум.
Однако, свежесобранные побеги туи - экзотическое сырье для наших широт, имеющее ограниченные сроки заготовки.
Данных по компонентному составу гомеопатических настоек туи, полученных из свежего и высушенного сырья, в доступной нам литературе не обнаружено. Кроме того, компонентный состав БАВ туи и багульника недостаточно изучен: в частности нет данных по содержанию фенолкарбоновых и жирных кислот, аминокислот, которые существенно влияют на фармакологическую активность гомеопатических препаратов.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящих исследований являлось: изучение компонентного состава гомеопатических настоек туи, изготовленных из свежесобранного (матричные) и высушенного растительного сырья, а также матричной настойки ледум, приготовляемой из высушенных побегов багульника болотного; - разработка методов контроля качества и стандартизации изучаемых настоек с использованием современных физико-химических методов: хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), хромато-масс-спектрометрии (ХМС), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), спектрофотометрии.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить в сравнительном аспекте компонентный состав БАВ (терпеноидов, флавоноидов, фенолкарбоновых и жирных кислот, аминокислот) в сырье различного физико-химического состояния (свежесобранного и высушенного), а также настоек туи и ледум. на основании полученных результатов исследований подготовить нормативные документы на исследуемые настойки гомеопатические матричные.
Научная новизна. Изучен компонентный состав БАВ гомеопатических препаратов туи и ледум с использованием современных физико-химических методов (ТСХ, ХМС, ВЭЖХ, спектрофотометрии). Выявлены характерные отличия матричных гомеопатических настоек туи и ледум от других гомеопатических настоек, полученных из этих же растений.
Установлено, что доминирующими БАВ матричной настойки туи являются: - из группы терпенов: моноциклические и бициклические монотерпены а-фенхон, а- и (3- туйон, камфора, а-терпиненил ацетат, 1,4 -терпинеол, а-пинен; впервые обнаружены моноциклический сесквитерпен кариофиллена оксид и дитерпеновый углеводород римуен; - из фенольных соединений идентифицированы: флавоноиды - рутин, кверцетин, лютеолин, а также фенолкарбоновые кислоты - галловая, хлорогеновая, кофейная; - впервые обнаружено 19 свободных аминокислот (в гомеопатической настойке туи из сухого сырья дополнительно обнаружен гидроксипролин).
В настойке туи гомеопатической матричной доминирующий компонент -глютаминовая кислота, а в настойке туи гомеопатической - пролин; из жирных кислот идентифицированы полиненасыщенная гексадекатриеновая и эфир пальмитиновой кислоты;
Установлен компонентный состав БАВ гомеопатической матричной настойки ледум: - из группы терпенов: моноциклические терпены (Р-фелландрен, терпинолен, цис-лимонен оксид, терпинеол, аскаридол), (ледол, палюстрол); - из фенольных соединений: флавоноиды - лютеолин, кверцетин, рутин, авикулярин, а также фенолкарбоновые галловая, хлорогеновая, кофейная кислоты; - впервые обнаружены 20 аминокислот, их них доминирующая - глютаминовая кислота; - этиловые эфиры жирных кислот (миристиновой, линолевой).
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены: - показатели качества и требования для настоек гомеопатических матричных. ВФС 42-3593-99 «Настойка багульника гомеопатическая (ледум 1Д)»; ВФС 42-3592-99 «Мазь Ледум гомеопатическая»; ВФС 42-3594-99 «Оподельдок Ледум гомеопатический»; ФС 42-0084-02 «Туя настойка гомеопатическая матричная». Связь задач исследования с проблемным планом развития фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Научно-исследовательского института фармации Минздрава России (номер государственной регистрации 0192.0017258), соответствует направлению Проблемной комиссии по фармации 36.08 РАМН, МЗ РФ; включена в отраслевую программу развития гомеопатического метода лечения и гомеопатической фармации, утвержденную МЗ РФ 20 января 1998 г.
Апробация работы. Результаты экспериментальных исследований доложены на научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов НИИФ «Современные проблемы фармации», посвященные памяти М.Т.Алюшина в 1998 и 1999 гг. на XI и XII Московских Международных гомеопатических конференциях «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» 2001, 2003 г.г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Положения выносимые на защиту: результаты исследований по изучению компонентного состава гомеопатических настоек туи, полученных из свежего (матричная) и высушенного сырья, а также высушенного сырья ледум; методики определения подлинности: терпеноиды, флавоноиды, фенолкарбоновые, жирные, аминокислоты с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, хромато-масс-спектрометрии, спектрофотометрии; методика количественного определения методом спектрофотометрии суммы флавоноидов в гомеопатических настойках туи; методика количественного определения методом спектрофотометрии суммы сесквитерпеновых спиртов в настойке и гомеопатической мази «Ледум»; методика определения подлинности гомеопатических гранул туи.
Описание лекарственного растительного сырья багульника болотного
Известно четыре вида багульника: багульник болотный (Ledum palustre L.), багульник крупнолистный (Ledum macrophyllum. Tolm.), багульник подбел (Ledum hypoleucum. Кот.), багульник стелющийся (Ledum decumbens (Ait.) Lodd.ex Steud.), сем. Вересковые (Ericaceae) /10/. Из них самым распространенным видом, нашедшим применение в гомеопатии, является багульник болотный.
Багульник болотный называют, такж болотной одурью, болотным розмарином и просто багном, что по-украински значит "болото". В датских и немецких травниках он упоминается со времен раннего средневековья. В трудах Линнея багульник назван лекарственным растением. Он описан во "Флоре России" академиком Петром Палласом, путешествовавшим по провинциям Российского государства в конце XYIII-XIX начале века /66/.
Лекарственное растительное сырье багульника представляет собой смесь облиственных побегов, листьев и небольшого количества плодов. Листья очередные, на коротких черешках, кожистые, линейно-продолговатые или продолговато-эллиптические, цельнокрайние, длиной 15 - 45 мм и шириной 1 - 5 мм, с завернутыми внутрь краями, с верхней стороны темно-зеленые или буровато-зеленые, блестящие, с нижней стороны покрыты густым ржаво-войлочным опушением. Стебли цилиндрические с оранжево-коричневым войлочным опушением. Плод - многосеменная продолговатая коробочка 3-8 мм длиной, железисто-опушенная, раскрывающаяся 5 створками. Запах резкий, специфический.
Багульник болотный широко распространен в хвойно-лесной и тундровой зонах европейской части, Сибири и Дальнего Востока, в горнолесном поясе Восточного Алтая и Саян. В Карелии образует кустарничковый ярус в заболоченных сосняках. Растет на болотах. Природные места обитания багульника характеризуются высокой влажностью почвы. Это светолюбивое и холодностойкое растение произрастает преимущественно на торфяных и торфянистых почвах/20,22,85/.
Лекарственное растительное сырье багульника можно заготавливать в течение всего периода вегетации. Хотя листья молодых побегов отличаются более высоким содержанием эфирного масла, предпочтительнее вести заготовку в августе-сентябре (при использовании в официнальной медицине), в фазе созревания плодов, когда полностью разовьются побеги текущего года. Причем заготавливать багульник можно в любое время суток. Для гомеопатических целей сбор побегов багульника проводят во время цветения в мае-июле. Сбору подлежат молодые (прироста текущего года) облиственные не одревесневшие и старые одревесневшие побеги с почками. Не разрешается вырывать побеги с корнями. Перерывы в заготовках багульника на одном и том же массиве должен быть не менее 8 лет, после полного восстановления его зарослей. В гомеопатической и в аллопатической практике используют высушенное лекарственное сырье. Сушат сырье на чердаках с хорошей вентиляцией под черепичной, шиферной или под железной крышей или под навесами, расстилая его тонким слоем (5-7 см) на ткани или бумаге и периодически переворачивая. Сушка под навесом обычно продолжается 10-14 дней. Можно сушить в сушилках при 40С, но не выше 60С. После сушки удаляют одревесневшие безлистные стебли. В связи с тем, что растение содержит сильно ядовитые вещества все работы по сбору и сушке сырья багульника рекомендуется проводить в респираторах или марлевых повязках не более чем по 2-3 часа в день /34,68,74/. Компонентный состав биологически активных веществ лекарственного растительного сырья туи и багульника болотного
Компонентный состав биологически активных веществ (БАВ) побегов Туи западной не достаточно изучен, за исключением состава эфирного масла. По данным литературы /110,111,115,148,155/ Туя западная содержит 0,4-1% эфирного масла, в состав которого входят монотерпены туйон (53,48%), изотуйон (15,48%), фенхон (10,89%), 1,8-цинеол, борнеол, а- и (3- пинен, сабинен, камфора, борнилацетат; сесквитерпеноиды: окциденталол, эудезмол. Содержание эфирных масел в молодых побегах туи западной варьирует от 0,58 (март) до 0,90 мл/100г (август). Кроме того, побеги Туи содержат минеральные вещества, свободные органические кислоты (1,67%), танин (1,3% ), витамин С (34,04 мг/ЮОг), а так же комплекс веществ смолобальзамического происхождения /165/.
Е. Lamer и T.Bodalski /133/ обнаружено в побегах туи комплекс из 10 флавоноидных соединений, относящихся к флавонам, флавонолам и катехолам. Из этого комплекса были выделены гликозиды кверцетола, кемпферола, пентагидроксифлавона, мирицетина, и идентифицированы 3,5,7,3/,4/,5/-гексагидроксифлавон, 3-рамнозид кемпферола (афзелин) и 3-рамнозид кверцетина (кверцетрин), мирицитрин (3-рамнозид мирицетина) и d-катехин; флавоновые агликоны - апигенин и лютеолин. Ряд авторов /106, 121/ обнаружили в туе бифлавоноиды группы хинокифлавонов.
В результате изучения сезонной динамики накопления флавоноидов Tamas М., Е. Fagarasan, C.Ionescu /155/ с помощью метода спектрофотометрии установили, что максимальное содержание флавоноидов в высушенном сырье наблюдается в январе (0,55% в пересчете на рутозид), и снижается к апрелю - маю, когда собирают сырье, применяемое в гомеопатии. В последнее время проводятся исследования древесины туи западной. Авторы /146/, используя методы капиллярной газовой хроматографии и хроматомасс - спектроскопии, исследовали БАВ эфирного масла, выделенного из древесины Туи методом перегонки с паром. В результате было идентифицировано 12 из выделенных 20 компонентов, в том числе сесквитерпены: окциденталол (20-50%), три изомера окцидола, окцидентол, а-, Р- и у - эудезмол; монотерпены: терпинен-4-ол, карвакрол, производное трополона а - туяплицин (5%).
Из древесины ветвей туи западной был выделен и изучен с помощью спектральных методов анализа лигнан (-)-2-(-3,5-диметокси-4-гидроксибензил)-3-(3,4-метилендиоксибензил)- бутиролактон [(-)-3,5-диметокси-4-гидрокси-3/,4/-метилендиоксилигнанолид], (-)-4-0-деметилат. С помощью метода колоночной хроматографии выделен танин /147/. Weyerstahl Р. с соавторами /169/ выделили из эфирного масла древесины туи западной новые производные кваядина: эфир 9а,11-эпокси-1рН,5аН,7рН-квая-3,10(14)-диен и спирт 1рН,5аН,7рН-квая-3,10(14)-диен-11 -ол, структура которых установлена с помощью ЯМР-спектроскопии.
В коре туи западной обнаружены афзелехин, (-)-эпиафзелехин, (+)-катехин, (-)-эпикатехин, (+)-галлокатехин, (-)-эпигаллокатехин /147/. Побеги багульника содержат БАВ, относящиеся к различным классам соединений: эфирное масло, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества группы катехинов, кумарины, урсоловую, аскорбиновую кислоты, фитостерины, марганец /46,57/. Компонентный состав багульника болотного значительно варьирует. Исследователи это связывают как с местом произрастания (экологический фактор), так и с существованием ботанических разновидностей багульника /51,52,71/. Эфирное масло содержится во всех частях растения, кроме корней. Стебли содержат около 0,17% эфирного масла, а листья примерно вдвое больше, чем трава. Максимальное содержание биологически активных веществ отмечается в первой половине фазы плодоношения (июль - начало августа), повышенное содержание ледола в эфирном масле отмечается во время бутонизации и в конце плодоношения (май и октябрь) /56/.
Содержание эфирного масла в сырье багульника значительно варьирует (от 0,2 до 2%), как и его состав. Особенно отличается сырье багульника болотного из разных районов произрастания по содержанию его основного действующего вещества - ледола. Так, в эфирном масле багульника, произрастающего в северных и центральных районах европейской части России, содержится 23% - 25% ледола, в эфирном масле багульника Томской области его лишь 4%, а в багульнике, произрастающем на острове Сахалин и Саянах, в эфирном масле ледола не содержится /79/. По другим источникам /18,61,81/ наибольшее количество эфирного масла (до 7%) накапливается в листьях текущего года, причем, консистенция его зависит от количества ледола. При содержании ледола менее 17% масло представляет собой подвижную жидкость или жидкость с небольшим количеством кристаллов, а при содержании ледола более 17% -пастообразную массу. Эфирное масло, как правило, густой консистенции, зеленого цвета, с сильным неприятным запахом. При стоянии на холоде из него выпадает стеароптен /71/.
Хроматографические методы
Исследуя химический состав эфирного масла багульника болотного, Белоусова Н.И. и Хан В.А. методом хроматографии на колонках выделили три карбонил содержащих терпеноида: лейбайкон; бицикло[3.1.0.]-гекс-2-ен-2формил-5-изопропил; бицикло[3.10.0.]-гекс-1 -метил-4-изопропил-2-он /10/. Методы БХ и ТСХ, сравнительно простые и доступные в исполнении, позволяют проводить идентификацию и полуколичественное определение многокомпонентных смесей БАВ, содержащихся в лекарственном растительном сырье /1,4/. Авторы /33/ использовали метод нисходящей БХ для изучения компонентного состава эфирных масел рода Ledum L. в подвижной фазе бутанол-1, насыщенный раствором аммиака. Зоны веществ на хроматограммах обнаруживали с помощью раствора бромтимолового синего. При сравнении величин Rf проявленных зон и зон РСО были идентифицированы муравьиная и н-валериановая кислоты. Хроматографические методы, в том числе метод хроматографии в тонком слое сорбента широко используется при анализе терпеноидов. Для разделения терпеноидов применяются растворители различной полярности. В качестве подвижных фаз служат мало полярные растворители, такие как толуол и дихлорметан, н-гексан, бензол, хлороформ или их смеси с этилацетатом, четыреххлористым углеродом, петролейным эфиром /149,154,166/. Кислородосодержащие монотерпены обычно хроматографируют, используя подвижную фазу гексан- этилацетат (15:85) /95,120/, если же анализируются монотерпеновые углеводороды, то в присутствии даже небольшого количества этилацетата все компоненты элюируются в виде одной зоны. Для разделения моноциклических терпенов /90/ в качестве неподвижной фазы использовали силикагель, импрегнированный нитратом серебра; а в качестве подвижной фазы - гексан или бензол. Таким образом, было достигнуто разделение сабинена и Р-пинена, а-туйона и а-пинена, а в подвижной фазе эфир - циклогексан (1:9) были разделены близкие по строению у-терпинен и а-терпинен, а-терпинен и лимонен. Обнаружение зон веществ на хроматограммах проводили в УФ свете при длине волны 365 нм или с помощью общих или селективных реактивов: серной кислоты концентрированной, растворов ванилина или анисового альдегида в серной кислоте, бромкрезолового зеленого, растворов хлоридов олова, лития, мышьяка, сурьмы /99,104,167/. В работе Kastelan-Macan, Cerjan-Stefanovic приведены пределы обнаружения и определения некоторых компонентов эфирных масел методом ТСХ /90/.
Tamas М.Е. с соавторами /155/ использовали метод ТСХ для исследования настойки туи. В качестве неподвижной фазы использовали силикагель марки G (Merk) и подвижную фазу: толуол-этилацетат (40:10). После обработки хроматограммы раствором ванилина в серной кислоте были идентифицированы 1,8-цинеол, бориеол, туйон. Используя метод ТСХ, а в качестве неподвижной фазы силикагель марки Н и подвижной фазы петролейный эфир - эфир (90:10) Banthorpe D.V. с соавторами /108/ выделили из извлечения свежих побегов туи туйон, изо-туйон, сабинен и сабинил-ацетат.
Паавер У.А. с соавторами /64/ разработали методику количественного определения ледола в эфирном масле багульника с помощью метода ТСХ с использованием раствора стандартного образца ледола путем сравнения площадей зон адсорбции. Содержание ледола в эфирном масле колебалось от 16 до 35%. ГЖХ наиболее широко используется при изучении сложных смесей терпеновых соединений /26,131,132,141,161,159/ для анализа терпеноидов успешно используют различные неподвижные жидкие фазы широкого диапазона полярности - от неполярных (SE-30, OV-101) до полярных (карбовакс 20М). Например, Tamas М., Fragasan Е., Ionescu С. /155/ использовали метод ГЖХ для изучения компонентного состава и сезонной динамики накопления эфирного масла в свежих побегах туи. Из 23 компонентов эфирного масла авторами были идентифицированы 12, основные из них туйон, изотуйон и фенхон. Также установлено, что содержание эфирного масла в свежем растительном материале изменяется от 0,58 (в марте) до 0,90 мг (в августе) в 100г.
Используя препаративную ГЖХ Banthorpe D.V. с соавторами /108/ выделили из свежих побегов туи западной туйон, изо-туйон, сабинен и сабинил-ацетат. Ряд авторов успешно использовали метод ГЖХ при исследовании компонентного состава терпеноидов багульника. Например, Клоковой М.В. с соавторами /33/ с помощью метода ГЖХ были идентифицированы а-, (3-пинен, Д-карен, лимонен, цинеол, п-цимол и установлено, что преобладающим компонетом является лимонен. Кабанов B.C. и Евстратова Р.И. /29/ разработали метод количественного определения ледола в эфирном масле багульника болотного, основанный на газохроматографическом разделении компонентов эфирного масла в режиме программирования температуры. При использовании в качестве внутреннего стандарта метилового эфира миристиновой кислоты было достигнуто достаточно полное разделение и обнаружено около 32 компонентов. Изучены образцы эфирного масла, полученные из листьев растения разных фаз вегетации и с различных мест произрастания. Установлено, что на хроматограммах высоколедольных образцов эфирного масла наибольшую величину имеет пик палюстрола, пик ледола значительно меньше, а пики остальных компонетов, как правило, на порядок ниже /101/.
Сложный многокомпонентный состав лекарственного растительного сырья и препаратов растительного происхождения с успехом изучается таким чувствительным и селективным методом как метод ВЭЖХ. Метод ВЭЖХ позволяет исследовать термолабильные соединения без ограничений по молекулярной массе. Поэтому ВЭЖХ используется для анализа терпеновых соединений. Полупрепаративная ВЭЖХ позволяет разделить сложные смеси терпеноидов на фракции, что значительно упрощает их последующее исследование с помощью ГЖХ /42,80/.
В зависимости от разрешающей способности различные спектральные методы широко используются при анализе лекарственного растительного сырья и препаратов растительного происхождения. Если фотоколориметрические и УФ-спектрофотометрические методы используются для определения подлинности, установления чистоты и количественного содержания БАВ, то такие методы как ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия, хромато-масс-спектроскопия и ЯМР являются незаменимыми при установлении структуры соединений, а также количественного определения отдельных компонентов и установления сопутствующих веществ /83/.
Авторы /82/ разработали экономичный и точный фотометрический метод определения фенолов в эфирном масле лекарственного растительного сырья, основанный на способности фенолов образовывать с п-хинонхлоримидом в щелочной среде окрашенные соединения. Поскольку основными фенольными компонентами эфирных масел являются тимол и его изомер карвакрол, очень близкие между собой по химическим, физическим свойствам и фармакологическому действию, методику разрабатывали с использованием в качестве стандартного образца тимола.
Применение Н и 13С-ЯМР-спектроскопии для анализа эфирных масел весьма ограничено, поскольку связано с необходимостью выделения в чистом виде индивидуальных компонентов. Преимуществом метода ЯМР является возможность определения стереохимии молекул (изомеров, конформаций) компонентов эфирных масел на основе данных изучения корреляций ЯМР-спектров со структурой соединений /81/. Например, с помощью данного метода была установлена структура производных кваядина, выделенных из эфирного масла древесины туи западной /169/.
ИК-спектроскопия широко используется для установления и подтверждения предполагаемого строения веществ. С помощью ИК-спектров можно установить наличие любой функциональной группы, можно различить изомеры. ИК-спектроскопия позволяет решить вопрос конфигурации или конформаций молекул /130/.
Метод ИК-спектроскопии также использован в работе /174/ для установления структуры выделенного из древесины туи сесквитерпенового спирта оцидола. Структура сесквитерпенового спирта окциденталола была подтверждена Rudolff Е., Erdtman Н. методом РЖ-спектроскопии /146/. С помощью методов ЯМР- и ИК-спектроскопии авторами /17/ была установлена структура сесквитерпенового кетона циклокоренона, выделенного из эфирного масла багульника болотного.
Изучение компонентного состава БАВ эфирных масел туи и ледум
Объектами исследований служили: эфирные масла туи, полученные из свежесобранного и высушенного сырья, а также эфирное масло ледум, полученное из высушенных побегов багульника. Эфирные масла получали методом перегонки с водяным паром, описанным в ГФ XI. Исследования проводили на хромато-масс-спектрометре НР-6890 фирмы HEWLETT PACKARD, США с масс селективным детектором (MSD) 5973. Для исследований применяли колонку с сорбентом средней полярности (состава 95% диметилполисилоксана, 5% дифенилполисилоксана) HP-5-MS длиной 30 м. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1 мл/мин. Градиент температур составил от 35С (выдержка 5 мин) до 290 С. Скорость подъема 3С/мин. Объем вводимой пробы - 1 мкл. Идентификация исследуемых образцов проводилась по масс-спектрам электронного удара, ионным масс- хроматограммам и библиотекам масс- спектров. Для количественного определения компонентов смеси терпеноидов использовали метод абсолютной калибровки по камфоре, как компоненту, содержащемуся в эфирных маслах туи и ледум. Результаты исследований эфирного масла туи представлены в таблице 2.3. и на рис.2.6. и 2.7.
Как видно из приведенных данных, в составе эфирного масла туи обнаружены: бициклические монотерпены (о и Р- пенен, сабинен, а- и J3-туйон, камфора), что согласуется с данными литературы /155/. Кроме того, нами были впервые обнаружены в эфирном масле туи моноциклический терпен лимонен, бициклические монотерпены а- и у- терпинен, п-цимен, моноциклический сесквитерпен кариофиллен оксид, дитерпеновый углеводород римуен, бициклический терпен, продукт окисления а-пинена -вербеной.
Количественное содержание терпеноидов в эфирном масле из свежесобранных побегов туи приблизительно в 4 раза больше, чем содержание в эфирном масле из высушенных побегов, что можно объяснить потерей БАВ при сушке сырья. Однако, в высушенных побегах наблюдается некоторое увеличение содержания камфоры, что по все л вероятности, связано с рядом химических превращений пинена. В эфирном масле из высушенных побегов обнаружен а-терпинолен, что объясняется изомеризацией пинена в процессе сушки сырья. Доминирующими компонентами в эфирном масле туи из свежесобранного сырья являются ос-и Р- туйон, а в эфирном масле из высушенного сырья - Р- туйон и цис-сабинен.
Результаты анализа эфирного масла ледум представлены в табл. 2.4. и на рис.2.8. Полученные данные о компонентном составе эфирного масла ледум соответствуют данным литературы /10,12/. Как видно из таблицы 2.2, в эфирном масле ледум доминирующими компонентами являются ледол (0,12%), палюстрол (0,16%) и геранилацетат (0,11%). Количественное содержание терпеноидов в эфирном масле ледум в пересчете на камфору составляет около 0,65%. Таблица 2.3. Результаты определения компонентного состава и количественного содержания терпеноидов в эфирном масле побегов туи
Исследование спирторастворимой фракции эфирного масла туи Так как свежесобранное сырье туи практически не исследовано представляло интерес изучить спирторастворимую фракцию эфирного масла свежесобранных побегов туи, являющегося компонентом матричной настойки, методом хроматомасс-спектрометрии.
Для этого были получены извлечения из эфирного масла следующим образом: в делительную воронку вместимостью 25 мл помещают 2,0 г эфирного масла, полученного перегонкой с водяным паром, прибавляют 2 мл спирта этилового 95%, встряхивают в течение 2-3 мин. Спиртовое извлечение переносят в круглодонную колбу. Проводят повторную экстракцию таким же количеством спирта. Извлечения объединяют и отгоняют на вакуум-выпарном ротационном аппарате на водяной бане при температуре не выше около 40С досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл гексана.
Исследования проводили на хромато-масс-спектрометре HP с хроматографом HP 6890 и масс - селективным детектором HP 5973. Колонка хроматографа кварцевая, капиллярная (30 м х 0,25 мм х 0,25 цм) на метилфенилсиликоне. Начальная температура колонки - 70С. Время выдержки при начальной температуре - 4,5 мин. Подъем температуры в диапазоне 70 С - 170 С 30 С/ мин, в диапазоне 170 С - 280 С 10 С/мин. Выдержка при конечной температуре - 10 мин. Скорость газа-носителя (гелий) -1 мл/мин. Температура инжектора, интерфейса, масс-селективного детектора и фильтра масс - 280 С, 290 С, 230 С и 150С соответственно. Объем вводимой пробы - 1 мкл.
Результаты анализа представлены в таблице 2.5. и на рис. 2.9. Впервые в спирторастворимой фракции эфирного масла туи были обнаружены жирные кислоты: насыщенная (пальмитиновая) и ее эфир, мононенасыщенная (олеиновая) и ее эфир; эфир полиненасыщенной линолевой кислоты, тритерпен жирного ряда сквален, который по своему строению близок к каротиноидам, жирорастворимый витамин Е.
Изучение терпеноидов настоек туи и ледум Изучению терпеноидов в настойках туи и ледум методом ХМС предшествовало их извлечение по следующей методике: в делительную воронку вместимостью 25 мл помещают 2 мл настойки, прибавляют 2 мл дистиллированной воды, встряхивают, затем прибавляют 3 мл гексана, встряхивают в течение 2-3 мин. Гексановое извлечение переносят в круглодонную колбу. Проводят повторную экстракцию таким же количеством гексана. Извлечения объединяют и отгоняют на вакуум-выпарном ротационном аппарате на водяной бане при температуре не выше около 40 С досуха. Остаток растворяют в 1 мл гексана. Исследования проводили на хромато-масс -спектрометре НР-6890 фирмы HEWLETT PACKARD, США с масс-селективным детектором (MSD) 5973. Для исследований применяли колонку с сорбентом средней Хроматограмма спирговых извлечений из эфирного масла свежесобраииых побегов тун дифенилполисилоксана- HP-5-MS) длиной 30 м. В качестве газа-носителя использовали гелий, со скорость потока 1 мл/мин. Градиент температур составил от 35С (выдержка при начальной температуре 5 мин) до 290 С. Скорость нагрева 3С/мин. Объем вводимой пробы - 1 мкл.
Идентификацию исследуемых образцов проводили по масс- спектрам электронного удара, ионным масс- хроматограммам и библиотекам масс-спектров. Для количественного определения компонентов смеси терпеноидов использовали метод абсолютной калибровки по камфаре, как компоненту эфирного масла туи и ледум. Результаты определений представлены в табл.2.6. и нарис. 2.10, 2.11.
Компонентный состав терпеноидов в настойках гомеопатических туи, полученных из свежего и из сухого сырья идентичен. Изучаемые настойки содержат бициклические монотерпены: а-фенхон (производное фенхона), а-и (3- туйон (производные а- и Р-туйена), камфору (производное камфена), карен; оксид кариофиллена (моноциклический сесквитерпен); моноциклические монотерпены: а-терпиненил ацетат, 1,4 -терпинеол; продукт омыления хлорофилла - фитол; парафины - докозан, тетракозан, гексакозан (конечные продукты восстановления жирных кислот); эндоборнилацетат. Настойка изготовленная из свежего сырья дополнительно содержит цис-сабинен гидрат и а-терпинеол, терпинеол, римуен (дитерпеновый углеводород) борнеол, полиненасыщенную жирную гексадекатриеновую кислоту, этиловый эфир пальмитиновой кислоты.
Метод ТСХ
Для получения достоверных, воспроизводимых результатов, благодаря быстроте, четкому разделению, возможности открытия пятен агрессивными растворителями при повышенных температурах, простоте оборудования и малым затратам денежных средств, нами выбран метод ТСХ. В качестве неподвижной фазы были использованы пластинки с тонким слоем силикагеля типа "Сорбфил". Для хроматографического разделения настоек туи и ледум нами были апробированы подвижные фазы различной степени полярности: этилацетат - спирт этиловый - вода (100:17:13) (XII), бензол - спирт этиловый - кислота уксусная ледяная (45:8:3) (XIII), кислота уксусная ледяная - кислота муравьиная безводная - вода (100:20:30) (XIV), хлороформ - спирт этиловый (40:10) (IX), хлороформ - спирт этиловый (90:10) (X) /1,6,27,34,37/. Для настоек туи дополнительно: этилацетат -кислота муравьиная безводная - вода (80:10:10) (VI), толуол - этилацетат -кислота муравьиная безводная (40:40:20) (VII), этилацетат - вода - кислота уксусная ледяная (10:10:40) (VIII). Для обнаружения зон адсорбции использовали раствор алюминия хлорида, как наиболее дешевый и доступный реактив, стойко окрашивающий зоны. При идентификации флавоноидов на хроматограммах в качестве растворов сравнения использовали спиртовые растворы стандартных образцов веществ сравнения (СОВС) лютеолина, гиперозида, рутина, кверцетина, авикулярина. А для идентификации фенолкарбоновых кислот -растворы СОВС галловой, бензойной, хлорогеновой и кофейной кислот. Подвижные фазы отличаются по эффективности разделения исследуемых настоек, оценку которой проводили по методу предложенному А.С.Берляндом /13/, что описано ранее в пояснении к эксперименту.
При расчетах использовали величины Rf тех зон, которые можно соотнести с величинами Rf и окраской СОВС кверцетина, лютеолина (для настоек туи) и авикулярина и кофейной кислоты (для настойки ледум). На основании коэффициента Г были проанализированы подвижные фазы, разделяющие зоны исследуемых настоек. Результаты определений представлены в таблице 3.1 (для настоек туи) и 3.1 (для настойки ледум). При использовании подвижных фаз XIV, X не наблюдается разделение зон, поэтому л. равен нулю и не указан в таблице 3.1. Таблица 3.1 Как видно, из полученных данных, оптимальные условия разделения зон адсорбции, исследуемых настоек туи, достигнуты при использовании подвижной фазы хлороформ - спирт этиловый (40:10) (IX), а исследуемой настойки ледум - бензол - спирт этиловый - кислота уксусная ледяная (45:8:3) (XIII), обладающие максимальной эффективностью, т.е. наибольшими значениями г\. Методика хроматографического разделения исследуемых настоек сводилась к следующему. На стартовую линию хроматографической пластинки наносят раздельно полосами длиной 10 мм по 10 мкл (0,010 мл) настоек, по 3 мкл (0,003 мл) растворов сравнения (СОВС) лютеолина, рутина, кверцетина, авикулярина, галловой, бензойной, хлорогеновой и кофейной кислот. Хроматографируют восходящим способом в подвижней фазе хлороформ -спирт этиловый (40:10) (IX) (настойки туи) и бензол - спирт этиловый -кислота уксусная ледяная (45:8:3) (XIII) (настойка ледум) на высоту 10 см. Хроматограммы высушивают на воздухе при комнатной температуре до удаления запаха растворителей.
При рассматривании хроматограмм настоек туи в УФ-свете при длине волны 365 нм обнаруживается зона голубого цвета с Rf около 0,65. Затем хроматограммы обрабатывают раствором алюминия хлорида 2 % и нагревают при температуре 100-105С в течение 5 мин. В УФ свете при длине волны 365 нм на хроматограмме СОВС обнаруживаются зоны лютеолина (Rf около 0,58), рутина (Rf около 0,02), кверцетина (Rf около 0,39), галловой (Rf около 0,012), кофейной (Rf около 0,12) кислоты. Зоны бензойной и хлорогеновой кислот расположены на линии старта.
В УФ-свете при длине волны 365 нм на хроматограмме исследуемой настойки туи гомеопатической матричной обнаружены зоны: желто-зеленого цвета с Rf около 0,02, светло-желтого с Rf около 0,11, желтого с Rf около 0,24, желто-зеленого с Rf около 0,30, три зоны желтого цвета с Rf около 0,49, 0,56, 0,60 и слабо-окрашенная зона желтовато-зеленого цвета с Rf около 0,71.
В УФ свете при длине волны 365 нм на хроматограмме исследуемой настойки туи гомеопатической обнаружены зоны: слабо выраженные желто-зеленого цвета с Rf около 0,01 и 0,02, желто-зеленого с Rf около 0,06, желто 101 зеленого с Rf около 0,14 и 0,30, интенсивные желтого цвета с Rf около 0,39, 0,52,0,58 и 0,71. Таким образом, на хроматоіраммах исследуемых настоек туи было обнаружено по 9 зон адсорбции, сопоставимых по величинам Rf, но отличающихся по интенсивности. В исследуемых настойках идентифицированы зоны лютеолина и рутина, а в настойке туи гомеопатической - дополнительно зона кверцетина. Результаты представлены на рис.3.1. Фенолкарбоновые кислоты в настойках туи методом ТСХ не были обнаружены. При рассматривании хроматограммы настойки ледум в УФ- свете при длине волны 365 нм обнаруживают две зоны голубого цвета с Rf около 0,40 (кофейная кислота) и 0,47. Затем хроматограммы обрабатывают раствором алюминия хлорида 2 % и нагревают при температуре 100-105С в течение 5 мин. В УФ-свете при длине волны 365 нм на хроматограмме СОВС обнаруживают зоны рутина (Rf около 0,02), кверцетина (Rf около 0,30), авикулярина (Rf около 0,34), лютеолина (Rf около 0,44), хлорогеновой (Rf около 0,01), галловой (Rf около 0,21) и кофейной (Rf около 0,39) кислоты. Зона бензойной кислоты расположена на линии старта.
В УФ -свете при длине волны 365 нм на хроматограмме исследуемой настойки ледум обнаружено 10 зон адсорбции: голубого цвета с Rf около 0,03, желто-зеленого с Rf около 0,02 (рутин), две зоны зеленого цвета с Rf около 0,15 и 0,25, зона зеленовато-голубого цвета с Rf около 0,30, зеленовато-желтого цвета с Rf около 0,34 (авикулярин), две зоны желтого цвета с Rf около 0,52 и 0,55 и две слабо-выраженные зоны светло-желтого цвета с Rf около 0,64 и 0,70
