Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о патогенности холерного вибриона (Обзор литературы) 14
1.1. Генетическая детерминированность маркеров эпидемической значимости холерного вибриона 14
1.1.1. Структура, функции и генетический контроль синтеза холерного энтеротоксина, факторов адгезии и колонизации холерного вибриона 14
1.1.2. Регуляция экспрессии основных детерминант вирулентности возбудителя холеры 30
1.1.3. Некоторые «дополнительные» факторы патогенности холерного вибриона и их роль в вирулентности микроорганизма 34
1.2. Экологические аспекты эпидемической значимости холерного вибриона 39
1.3. Методологические подходы к изучению вирулентности штаммов холерного вибриона 47
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 57
2.1. Штаммы холерного вибриона 57
2.2. Препараты 58
2.3. Экспериментальные животные 60
2.4. Методы исследования
2.4.1. Эпидемиологический анализ 61
2.4.2. Бактериологический и биологический методы 61
2.4.3. Молекулярно-генетический метод 62
2.4.4. Методы получения некультивируемых форм холерного вибриона..63
2.4.5. Методы изучения некультивируемых форм холерного вибриона 64
2.4.6. Методы реверсии некультивируемых форм холерного вибриона в вегетативное состояние 66
2.5. Статистическая обработка результатов 67
ГЛАВА 3. Характеристика эпидемиологической ситуации по холере в сибири и на дальнем востоке в период седьмой пандемии 68
ГЛАВА 4. Оценка эпидемической значимости штаммов холерного вибриона разного происхождения с использованием фенотипических и молекулярно генетических методов исследования 85
4.1. Определение эпидемической значимости Vibrio cholerae по чувствительности к диагностическим бактериофагам 85
4.2. Определение эпидемической значимости V. cholerae в мультиплексной ПЦР 92
4.3. Комплексный анализ эпидемической значимости V.cholerae по фенотипическим и генетическим признакам 104
4.4. Распространенность некоторых «дополнительных» генов вирулентности
в штаммах холерного вибриона различного происхождения 108
ГЛАВА 5. Адаптационные возможности штаммов v. cholerae разной эпидемической значимости (получение и характеристика некультивируемых форм холерного вибриона) 123
5.1. Биологические свойства и генетическая характеристика некультивируемых форм V. cholerae 123
5.2. Реверсия некультивируемых форм холерного вибриона в вегетативное состояние 136
Обсуждение результатов исследования 142
Выводы 158
Список использованной литературы 1
- Регуляция экспрессии основных детерминант вирулентности возбудителя холеры
- Бактериологический и биологический методы
- Определение эпидемической значимости Vibrio cholerae по чувствительности к диагностическим бактериофагам
- Реверсия некультивируемых форм холерного вибриона в вегетативное состояние
Введение к работе
Актуальность проблемы
Холера — тяжелое инфекционное заболевание диарейного характера, склонное к эпидемическому и пандемическому распространению. Описано шесть пандемий холеры (начиная с 1817 г.), вызванных классическим холерным вибрионом. Последняя (седьмая) пандемия, этиологическим агентом которой является холерный вибрион эльтор, по сравнению с шестью предыдущими характеризуется наибольшей продолжительностью, охватывает все континенты. За период седьмой пандемии в ВОЗ зарегистрировано 5 ПО 089 случаев заболевания в 146 странах мира (Ломов Ю.М. с соавт., 1997; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Москвитина Э.А. с соавт., 2003). Только за последнее десятилетие (1992—2001 гг.) 128 стран мира информировали ВОЗ о 2 583 742 больных (Москвитина Э.А. с соавт., 2002). Определенную опасность вызывает появление (в 1992 г.) возбудителя холеры новой серог-руппы — Vibrio cholerae 0139, который стал причиной крупных эпидемических вспышек в Бангладеш, Индии и отдельных заносов инфекции в Азию, Европу и Америку (Москвитина Э.А. с соавт., 2003; Albert M.J., 1996). В России же, на фоне снижения мировой заболеваемости, отмечена тенденция роста инфицированности холерой за счет вспышек в Приморском крае и на Сахалине (1999 г.), а также в Татарстане (2001г.) (Онищенко Г.Г., 2002). Эпидемиологическая ситуация в стране определяется как угрозой завоза холеры на любую территорию из эндемичных стран (Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Москвитина Э.А с соавт., 2002), так и широким распространением вибрионов эльтор в объектах окружающей среды (Кюрегян АА с соавт., 1988; Марамович А.С. с соавт., 1988; Онищенко Г.Г. с соавт., 1992; Ломов Ю.М. с соавт., 1995; Москвитина Э.А с соавт., 2002).
Экспериментально показанная возможность формирования токсиген-ных вариантов вибриона из авирулентных предшественников (Faruque S.M. et а!., 1998; KaraolisD.K.R. etal, 1999), а также зависимость объема профилактических и противоэпидемических мероприятий от эпидемической опасности И'йп'ос/го/егаетребуютпостоянногоконтролявизолируемыхкультурахмар-керов патогенности. При этом определение их бактериологическими методами трудоемко и не всегда достоверно. Ключевая роль в оценке вирулентных свойств холерного вибриона отводится современным молекулярно-биологи-ческим методам исследования, в частности, полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленным на прямую детекцию генетических детерминант вирулентности микроорганизма. Усовершенствование этих методов и определение с их помощью эпидемической значимости возбудителя является важным звеном в системе эпидемиологического надзора за холерой.
Длительная циркуляция вибрионов эльтор в поверхностных водоемах, несмотря на значительный диапазон колебаний природно-климатических условий, связана с возможным сохранением их жизнеспособности в объектах окружающей среды. Наиболее логичным объяснением такой персис-тенции микроба может быть его переход в некультивируемое состояние
POC. НАЦИОНАЛЬНА»!
БИБЛИОТЕКА 1 3
*2Й10м?1
(НС), что является крайним вариантом адаптационной изменчивости (До-марадский И.В., 1997; Литвин В.Ю. с соавт., 2000, 2001). Представляет интерес вопрос о возможности и длительности сохранения некультивиру-емыми формами (НФ) эпидемически значимых штаммов их патогенных свойств. Кроме того, неизвестно, существуют ли различия в способности к переходу в некультивируемое состояние и возможности реверсии в вегетативную форму холерных вибрионов разной эпидемической значимости.
Цель настоящего исследования — на основе комплексного использования генодиагностических и бактериологических методов определить эпидемическую значимость обнаруживаемых на территории Сибири и Дальнего Востока холерных вибрионов, а также выяснить адаптационные возможности штаммов разных генотипов.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать эпидемиологическую ситуацию по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в период седьмой пандемии.
-
Оценить вирулентность разных штаммов холерного вибриона по данным комплексного бактериологического метода (чувствительность к холерным диагностическим фагам СТХ+ СТХ и гемолитическая активность).
-
Разработать метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции трех основных генетических маркеров эпидемической опасности холерного вибриона — ctxAB, tcpA, toxR, ассоциированных с различными «блоками патогенности» на хромосоме возбудителя. Выявить присутствие указанных детерминант в геноме V. cholerae разных групп.
-
По комплексу генетических и фенотипических признаков определить эпидемическую значимость холерных вибрионов, изолируемых в разные годы на фоне возникновения вспышек холеры и при отсутствии эпидемических осложнений.
-
Установить распространенность некоторых «дополнительных» генов вирулентности - zot, rstC, nanH, отр U, xerC, xerD (локализованных на мобильных генетических элементах и консервативных участках хромосомы) в штаммах холерного вибриона разной эпидемической значимости.
-
Изучить адаптационные возможности штаммов холерного вибриона разных генотипов путем экспериментального получения некультивиру-емых форм микроорганизма. Охарактеризовать морфологию, жизнеспособность НФ, а также возможность сохранения ими исходных генетических детерминант вирулентности и реверсии в культивируемую форму.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
По данным молекулярно-генетических и фенотипических методов представлена комплексная эпидемиологическая оценка изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока штаммов холерного вибриона.
Разработан и многократно апробирован метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции трех основных детерминант патогенности возбудителя — ctxAB, tcpAH toxR.
Установлена распространенность «дополнительных» генов вирулентности (zot, rstC, nanH, ompU, xerC, xerD) среди штаммов холерного вибриона разной эпидемической значимости.
Выявлена однородность (по генетическим и фенотипическим признакам) популяции штаммов холерного вибриона периода эпидемических осложнений и их гетерогенность (в объектах окружающей среды) в период эпидблагополучия.
Экспериментально показан более быстрый переход в некультивируе-мое состояние токсигенных штаммов холерного вибриона по сравнению с нетоксигенными. При этом у токсигенного вибриона в некультивируемом состоянии наряду с антигенными детерминантами сохраняются связанные с патогенностью гены исходного штамма.
Установлена более длительная способность к реверсии в вегетативное состояние НФ эпидемически неопасных штаммов.
Предложенные методы комплексной оценки вирулентности холерного вибриона различного происхождения позволяют объективно оценить эпидемиологическую ситуацию и могут быть положены в основу дальнейшей оптимизации системы эпидемиологического надзора за холерой.
Практическая значимость работы
Разработан и внедрен в практику эпидемиологического надзора за холерой метод мультиплексной ПЦР, основанный на одновременной детекции в пробе трех основных генов вирулентности холерного вибриона, что позволяет оперативно определить эпидемическую опасность изолируемой культуры. Метод в течение ряда лет используется в системе экологического мониторинга и в рамках оперативного эпиднадзора за холерой (в том числе при расшифровке эпидосложнений, выявлении первых заносных случаев заболевания), а также в экспериментальных исследованиях. «Методические рекомендации по детекции детерминант вирулентности холерного вибриона с использованием мультиплексной ПЦР» одобрены Ученым Советом (протокол № 3 от 09.04.02) и утверждены директором Иркутского НИПЧИ.
Депонирован в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» штамм Vibrio cholerae eltor И-1362, спонтанно утративший ctxAB оперон гена холерного токсина при сохранении гена tcpA. Штамм может быть использован в качестве перспективного для генетических исследований.
Положения, выносимые на защиту:
-
Ситуация по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в период седьмой пандемии определяется регистрацией острых вспышек, отдельных случаев заболевания заносного характера, транзиторного вибрионо-носительства, а также длительной циркуляцией авирулентных вибрионов эльтор в поверхностных водоемах.
-
Предлагаемый вариант мультиплексной ПЦР для одновременной детекции ctxAB оперона гена токсинообразования, генов tcpA и toxR позволяет оперативно определить эпидемическую значимость возбудителя холеры.
-
При эпидемических осложнениях по холере (вспышки, заносные очаги) обнаруживаемые штаммы возбудителя характеризуются однородностью генотипа (ctxAB+tcpA+toxR+zofrstC+nanlTompJT) и по совокупности с результатами комплексного фенотипического теста соответствуют оценке как эпидемически опасные.
-
Популяция вибрионов эльтор от транзиторных носителей и из объектов окружающей среды на фоне эпидемиологического благополучия в регионе отличается гетерогенностью. Все выделяемые штаммы лишены генов ctxAB, tcpA, zot, rstC, при наличии у большинства из них гена-регуло-на toxR и генов nanH, ompU. Комплексная оценка генетических свойств и чувствительности к фагам СТХ+ и СТХ позволяет охарактеризовать изо-ляты как эпидемически неопасные.
-
Культивирование холерного вибриона в неблагоприятных условиях закономерно приводит к снижению популяции вегетативных особей микроба, наиболее четко выраженному у токсигенных штаммов, что, вместе с результатами комплексного (микроскопического, серологического, молекулярно-генетического, биохимического) исследования свидетельствует о более быстром их переходе в некультивируемое состояние.
-
Возможен обратный переход «молодых» некультивируемых форм холерного вибриона в вегетативное состояние с сохранением ревертанта-ми всех свойств исходного штамма, в том числе и вирулентного потенциала; при этом НФ нетоксигенных штаммов обладают более длительной (в сравнении с токсигенными) способностью к восстановлению первоначальных свойств.
Апробация работы
Исследования проводились в рамках плановых тем НИР: № ГР 01.9.60000200, Инв. № 02.99.0005736; № ГР 01.20.0013861.
Материалы исследований докладывались на: Проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2000-2004); 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003); конференции с международным участием, посвященной 80-летию кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета (Иркутск, 2003), а также на трех научных конференциях Иркутского НИПЧИ. В виде тезисов или стендовых сообщений материалы диссертации представлялись на: Международной конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции» (Санкт-Петербург, 2000); 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников» (Улан-Удэ, 2001); III конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2001); I
Международном Симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, 2002); юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002); 4th Asia pacific travel health conference (Shanghai, P.R. China, 2002); VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002).
Публикации
Результаты исследований отражены в одном заключительном отчете и 23 печатных работах, в том числе 2 в зарубежной печати.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (302 цитируемых работы, в том числе 153 отечественных и 149 зарубежных авторов). Общий объем работы — 197 страниц, включая 10 таблиц и 32 рисунка.
Регуляция экспрессии основных детерминант вирулентности возбудителя холеры
Роберт Кох полагал, что при холере этиологический агент инфекции обладает действующим на кишечный эпителий «специальным ядом» [28, 143, 225]. О природе и химической структуре указанного «особого специфического холерного яда» в то время существовали противоречивые суждения. Он рассматривался либо как «продукт выделения самих вибрионов», либо как «образующийся в содержимом кишечника и его стенках при жизнедеятельности холерного вибриона яд», либо как «входящая в состав возбудителя субстанция» [91]. Позднее Dutta N.K., Habbu М.К. [194] показали в эксперименте на новорожденных крольчатах, что внутрикишечное введение им культуральных фильтратов или лизатов холерного вибриона приводит к накоплению жидкости в просвете кишечника. Предполагалось, что этот феномен вызван комплексным действием на слизистую оболочку кишечника различных экзо - и эндотоксинов возбудителя [42, 194]. Данные на этот счет представляют определенный интерес. Рассматривалось [11, 165] существование трех типов холерных токсинов — эндотоксин, термолабильные (холерогенпые и цитотоксины) и термостабильные токсины. Впоследствии выяснилось [2, 11, 94, 117], что основная патогенетическая роль в развитии холерной диареи принадлежит термолабилыюму холерному энтеротоксину (холерогену) - глобулярному белку с молекулярной массой 84 кД. В структурном плане этот токсин сходен с термолабильным токсином Escherichia coli и представляет собой А-В комплекс, состоящий из одной А и пяти В субъедшшц. В свою очередь, А-субъединица включает соединенные дисульфидным мостиком А1 и А2 полипептидные цепи. Токсической активностью в этом комплексе обладает А1 фрагмент, в то время как В-субъединицы, объединенные нековалентной связью, являются нетоксичными и выполняют функцию связывания молекулы токсина с клеточным рецептором на поверхности энтероцитов [2, 80, 117, 225, 232]. Специфическим рецептором для холеро-гена служит расположенный на апикальной мембране клеток кишечного эпителия ганглиозид GMi. Связываясь с ним, субъединица В изменяет конформа-цию, что приводит к формированию в мембране клетки гидрофобного канала. Через этот канал внутрь энтероцита проникает отсоединившийся от А-В комплекса фрагмент А1, активирующий через каскад реакций внутриклеточный фермент аденилатциклазу, которая обусловливает переход АТФ в цАМФ [2, 117, 225]. Повышение концентрации внутриклеточной цАМФ через активацию протеинкиназы приводит к секреции клетками кишечных крипт воды и электролитов в просвет кишечника, что лежит в основе развития обильной водянистой диареи — основного клинического проявления холеры [94, 225, 259]. Гены, кодирующие биосинтез А- и В- субъединиц холерного токсина, составляют ctxAB оперон, локализованный на хромосоме токсигенных вибрионов [18, 112, 168, 225, 233]. Гибридизационный анализ ДНК штамма классического холерного вибриона на выявление последовательности гена холерного токсина (СТ) с использованием зондов из генов А - и В - субъединиц термолабилыюго энтеро-токсина (LT) Е. coli показал, что гены СТ и LT характеризуются сходством их генетической организации [252]. При этом обнаружено, что все эпидемические штаммы холерного вибриона классического биотипа содержат две отдельные копии ctxAB оперона холерного токсина, локализованные на двух хромосомах возбудителя. В составе генома токсигенных вибрионов эльтор выявлены множественные тандемно расположенные копии оперона размером 7 и 9,7 т.п.н. только на большой хромосоме. Различия в размере этих регионов обусловлены разницей количества копий прямых повторов RS1 элемента, фланкирующего ctxAB гены [118, 193, 234, 278]. Pearson G.D. et al. [182] показали, что гены ctxAB входят в состав «коровой части» СТХ генетического элемента или «кассеты вирулентности». Кроме генов холерного токсина «кассета вирулентности» содержит также структурные гены Zot и Асе токсинов, ген фактора кишечной колонизации — сер и orfU с неизвестной функцией. Поскольку оказалось, что СТХ элемент имеет отличные от хромосомы вибриона химические характеристики и окружен кодирующими систему сайт-специфической рекомбинации RS1 последовательностями, было высказано предположение о его транспозон-ной или фаговой природе [110, 182, 202, 233].
Известно, что умеренные бактериофаги способны проникать в клетки бактерий и изменять посредством лизогенной конверсии их свойства. Указанные фаги часто кодируют гены, не существенные для жизнеспособности бактерий, но обеспечивающие им определенные эволюционные преимущества [62, 101]. Описаны случаи приобретения бактериями способности продуцировать токсины или другие факторы вирулентности в результате фаговой трансдукции [39]. Так, доказано, что структурные гены дифтерийного, ботулинического, стрептококкового, шигаподобного токсинов Е. coli локализованы в геномах умеренных фагов [25, 101,233,298].
В 1996 году Waldor М.К. и Mekalanos J.J. [299], изучая в лабораторных экспериментах возможность конъюгационного переноса СТХ элемента (с ин-тродуцированными в него генами резистентности к канамицину) обнаружили, что он обладает способностью передаваться от штамма к штамму. При этом донорские штаммы, содержащие ген резистентности к канамицину в области структурных генов ctx, могут передавать устойчивость к указанному антибиотику реципиентному даже при отсутствии прямого контакта между бактериальными клетками. Электронная микроскопия супернатантов донорских штаммов позволила обнаружить структуры, морфологически сходные с нитевидными бактериофагами. Кроме того, содержащиеся в СТХ элементе гены обнаруживают сходство с генами колифага М13. Это послужило основанием для заключения о том, что структурные гены холерного токсина кодируются филамен-тозным бактериофагом, названым СТХф [202, 233, 299]. Геном СТХф имеет две области - «коровую» (с генами ctxAB, zot, асе, сер и orfU) и RS2. Анализ структуры и функции генов «коровой» области -zot, асе, сер и orfU показал, что они сопоставимы с I, VI, III, VIII генами фага МІ3 и необходимы для формирования и размножения частиц СТХф. Учитывая необходимость продуктов этих генов в морфогенезе СТХ фага, сделано заключение о том, что они либо не несут в себе токсической активности, о которой сообщалось ранее, либо выполняют двойственную функцию [202, 299]. Делеция же в области генов, кодирующих холерный токсин, не выявила нарушений в формировании фаговых частиц, подтверждая тем самым, что ctxAB не участвуют в морфогенезе фага, а являются только токешшыми генами, приобретенными фагом в процессе эволюции, и обеспечивающими «бактерию-хозяина» селективными преимуществами в период пребывания в желудочно-кишечном тракте человека [112, 202, 233]. Вторая функциональная область бактериофага СТХф — последовательность RS2 (2,5 т.п.н.) — обеспечивает репликацию и интеграцию фагового генома в хромосому вибриона [112, 202].
Бактериологический и биологический методы
Изучение культуралыю-морфологических, биохимических, серологических свойств, чувствительности исследуемых штаммов к диагностическим бактериофагам проводилось в соответствии с «Инструкцией по организации и проведению противохолерных мероприятий» (Москва, 1995 г.) и МУ 4.2.1097-02 «Лабораторная диагностика холеры» [46].
Определение холерогенности V. cholerae — по методу Dutta N.K., Habbu М.К. [194]. С этой целью взвесь исследуемого штамма 10 м.к./мл вводилась внутрикишечно новорожденным крольчатам. При изучении токсигенных свойств вибрионов эльтор, утративших детерминанты холерного токсина, использовалась микробная взвесь с концентрацией от 105 до 109 м.к./мл. Результаты оценивались (через двое суток) в зависимости от изменений в толстом и тонком кишечнике [78].
Молекулярно-генстический метод (полимеразная цепная реакция - ПЦР) применялся для определения генетических детерминант вирулентности холерного вибриона.
ПНР с одной парой праймеров. Подготовка проб для ПЦР проводилась в соответствии с МУ 1.3. 1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенності!» (Москва, 2003 г.). Экстракция ДИК из бактериальных суспензий холерных вибрионов в бидистилированной воде (концентрация 107КОЕ/мл) осуществлялась прогреванием при 100 С в течение 30 минут. При этом одновременно достигалось и обеззараживание культуры. Полученная ДНК использо-валсь при постановке ПЦР. Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала: ІОхПЦР буфер - 2,0 мкл; 25 тМ MgCI2- 0,75 мкл; смесь 2,5 тМ дНТФ - 1 мкл; праймеры - по 10 пкмоль; Taq-полимераза — 1ЕД; исследуемая проба ДНК — 5 мкл; бидистиллнрованная вода - до 25 мкл. Реакционная смесь закрывалась минеральным маслом (40 мкл) и помещалась в термоблок амплифнкатора «Терцик» (АО «ДНК - технология»). Амплификация осуществлялась по соответствующей для детекции каждого из определяемых генов программе. Учет результатов - посредством электрофореза продуктов амплификации в 1,5 % агарозном геле на ІхТВЕ (трис-боратном электрофорезном буфере) в присутствии бромистого этидия и последующего видеодокументирования с использованием компьютерной программы «Gel Imager». Размер амплифицированных фрагментов идентифицировался в сравнении с полосой положительного контроля или с маркером молекулярной массы 100-1000 п.н. («Медиген»). ПЦР мультиплексная основана на применении в одной амплификацион-ной смеси трех пар праймеров для детекции основных генов вирулентности холерного вибриона. Детальная разработка варианта мультиплексной ПЦР представлена в разделе 4.2.
Применены два разных метода. Первый основан на культивировании микроорганизма в условиях ограниченного содержания питательных веществ и низкой температуры [147, 270]; для этого культуры холерного вибриона помещались во флаконы (микрокосмы), содержащие забуференный фосфатами физиологический раствор - ФБР (NaCl - 8,5 г, Na2HP04 - 2,2 г, КН2Р04 - 0,25 г, 1000 мл дистиллированной воды, рН 7,2) в конечной концентрации 10 -10 м.к./мл, и подвергались длительному инкубированию при 6 С.
Второй метод заключается в применении в среде культивирования высокой концентрации солей и сравнительно оптимальной температуры микрокосма [228]. Культуры холерного вибриона эльтор засевались во флаконы (NaCl -80 г, КС1 - 2 г, Na2HP04xl2H20 - 29 г, КН2Р04 - 2 г, дистиллированная вода -1000 мл, рН - 7,2) - в конечной концентрации 107 м.к./мл с последующим инкубированием при 25 С в течение 20 сут.
После внесения культуры соответствующего штамма вибриона в среду культивирования ежедневно (первая неделя) и еженедельно (в последующие сроки наблюдения) проводился учет концентрации вибрионов (путем высева на плотную питательную среду). При заметном снижении концентрации микробных клеток в условиях первой серии опытов (на 20, 30, 50, 50, 60, 70 сутки) содержимое флаконов подвергалось фильтрации (под давлением) через мембранные фильтры с разным размером пор: вначале через 0,45 мкм (Millipore, USA), затем 0,22 мкм (Владипор) - для освобождения от растущих и концентрирования некультивируемых форм вибриона. После полного прекращения высевае 64 мости из флаконов (трехкратные с интервалом три дня отрицательные высевы) пробы (каждые 10-14 дней до 80 суток отсутствия высеваемости) концентрировались центрифугированием (ЦЛС-3, 5000 об./мин, 15 мин). По второму методу одна часть материала на 20 сутки подвергалась центрифугированию, другая часть — фильтрации, как указано по первому методу. Для проведения комплексного исследования на выявление НФ холерного вибриона использовался следующий материал: - смыв с фильтра (диаметр пор 0,22 мкм), полученный при фильтрации (на разных сроках опыта) культивируемых проб, находящихся в условиях голодания и низкой температуры; - осадок после центрифугирования проб (инкубированных в условиях голодания и низкой температуры) в разные сроки отсутствия высеваемости из флаконов; - смыв с фильтра 0,22 мкм и осадок после центрифугирования проб, содержащихся в условиях повышенной концентрации солей (2 серия опытов, 20 сут).
Полученный материал исследовался комплексно бактериологическим, бак-териоскопическим, серологическим, молекулярно-генетическим и биохимическим методами в динамике. Бактериологически проводился прямой посев материала с фильтра и осадка после центрифугирования на щелочной агар и на него через среду накопления. Морфология клеток изучалась микроскопированием фиксированных мазков, окрашенных по Граму. Кроме того, проводилось окрашивание акридиновым оранжевым (1:6000) нефиксированного материала после центрифугирования [121]. Для более детального морфологического исследования использовался метод негативного контрастирования (просмотр материала с помощью элек 65 тронного микроскопа JEM-100S). Для этого на фильтр с осадком (после фильтрации материала) наносился 2,5 % глутаровый альдегид на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4), после чего осадок суспензировался петлей и выдерживался при комнатной температуре (2-5 мин). Затем взвесь петлей наносилась на сеточку, фиксировалась 1% Os 04 (10-15 мин.) и контрастировалась 3 % уранил-ацетатом (на 30 спирте 15 мин). После промывки (дистиллированной водой) и подсушивания — электронное микроскопирование материала (увеличение 25000, 30000 раз).
Выявление антигенных детерминант проводилось в реакции агглютинации (РА) на стекле с холерными видоспецифической О-, типоспецифическими Ога-ва-, Инаба- и RO-сыворотками. Дополнительно материал исследовался в реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ) с люминесцирующими сыворотками для выявления V. cholerae Ol серогруппы и ФИТЦ-МКА для выявления V. cholerae 0139 серогруппы [129] (просмотр материала с использованием люминесцентного микроскопа МЛД-1 и Leica DMRXA), что позволило, наряду с определением серологической принадлежности, выявить морфологию клеток.
Определение эпидемической значимости Vibrio cholerae по чувствительности к диагностическим бактериофагам
Исследование показало присутствие гена ompU во всех изолятах холерного вибриона, определенных ранее как эпидемически опасные. Один из штаммов (V. cholerae eltor И-566), утративших ген холерного токсина, характеризовался наличием исследуемой детерминанты, тогда как в геноме другого (V. cholerae eltor И-1362) ген отрU отсутствовал (рис. 25, табл. 8).
Лишь небольшая часть эпидемически неопасных изолятов холерного вибриона от людей содержит этот ген, а именно — два штамма от транзиторных носителей (г. Новосибирск, 1972 г., г. Уссурийск, 1982 г.) и один от носителя в заносном очаге (г. Новокузнецк, 1975 г.). Интересно, что в двух других штаммах, изолированных от вибриононосителей, в ПЦР выявлен мажорный флуоресцирующий фрагмент меньшего размера в сравнении с положительным контролем (приблизительно 700 н.п.). Возможно, в этом случае имеет место делеционная мутация в гене, кодирующем белок наружной мембраны, за счет которой происходит сокращение нуклеотидной последовательности гена ompU. При этом один нетоксигенный штамм с возможной мутацией указанного гена, изолирован от хронического вибриононосителя.
Вполне вероятно, что длительное воздействие желчесодержащей среды (в кишечнике и гепатобилиарной системе человека) повлияло определенным образом на структуру вибриона (ген ompU), вовлеченную в формирование устойчивости микроорганизма к желчи.
Среди 47 исследованных штаммов вибриона эльтор из поверхностных водоемов выявлено 46,8 % (22) ompU-положительных штаммов (табл. 8). В геноме 12,8 % (6) культур из объектов окружающей среды обнаружен ген ompU с делеционной мутацией (ампликон приблизительно 700 п.н.). В то же время значительная часть исследованных культур V. cholerae 0139 и У. cholerae не 01/0139 являются ПЦР-положительными на наличие ompU.
Таким образом, установлено достаточно широкое распространение гена порина наружной мембраны в холерных вибрионах различного происхождения. Продукт гена ompU, по-видимому, необходим вибриону, как в условиях инфекционного процесса, так и вне организма при неблагоприятном воздействии на него факторов окружающей среды.
Детекция генов xerC, xerD. Выявленная в предыдущих исследованиях мобильность генома холерного вибриона и неоднородность популяции авиру-лентных штаммов может рассматриваться как основа для изменчивости микроорганизма. В последние годы экспериментально установлена возможность формирования эпидемического клона возбудителя холеры из нетоксигенных предшественников посредством последовательного приобретения генов вирулентности в составе филаментозных фагов СТХф и УРІф [154, 160, 272]. Установлено, что фаги интегрируют в определенные dif-подобные сайты (att-сайты) хромосомы микроорганизма. Однако СТХф не содержит генов, кодирующих известные рекомбиназы, интеграция его происходит лишь при наличии соответствующих ферментов (Хег С, Xer D), контролируемых хромосомными генами вибриона [217]. В связи с этим для выяснения потенциальной способности холерных вибрионов к рекомбинациям генома проведено исследование, направленное на обнаружение в хромосоме генов xerC, xerD, кодирующих ферменты рекомбиназы. Подбор праймеров, специфичных для каждого из указанных генов, проводился на основании полной нуклеотидной последовательности генома холерного вибриона, опубликованной в Gen Bank.
Расчетный размер специфического фрагмента гена, расположенный между двумя праймерами, составляет 224 п.н. Поскольку важным фактором специфичности ПЦР является температура отжига, для выяснения необходимых параметров амплификации сначала рассчитывалась температура плавления (Тт) каждого праймера и определялась ее средняя величина. Средняя Тт для пары праймеров Xer CI Xer С2 соответствует 65 С. При проведении апробации ре 120 жима ПЦР с температурой отжига в диапазоне от 57 до 65 С оптимальной оказалась температура 58 С, при которой наработка неспецифических ампликонов отсутствует. В соответствии с этим амплификация осуществлялась по программе: С-30 сек
Средняя Tm для этой пары праймеров соответствует 72 С. В эксперименте в качестве оптимальной определена температура отжига 67 С. Максимальный выход продукта амплификации наблюдается при режиме: С-30 сек 67 С-30 сек 72 С - 20 сек циклов.
Для проведения ПЦР (в объеме 25 мкл) в амплификационную смесь стандартного состава вносится по 10 пкмоль прямого и обратного праймера. Концентрация праймеров рассчитывается в зависимости от оптической плотности раствора и количества оснований праймера.
С применением разработанных тест-систем проведено тестирование 115 изолятов V. cholerae на присутствие в хромосоме генов рекомбиназ xerC, xerD. Оказалось, что все изоляты V. cholerae eltor, V. cholerae 0139, V. cholerae не О I/O 13 9, независимо от объекта выделения, обладают генами ферментов рекомбиназ (рис. 26 а, б).
Вероятно, эти ферменты, выполняя функцию разделения димерных хромосом, принимают участие в различных перестройках генома микроорганизма. Эти результаты предполагают существование потенциальной возможности возникновения рекомбинаций в геноме холерных вибрионов, приводящих к изменению их первоначальных свойств.
В целом, изучение распространенности дополнительных генов вирулентности среди различных по эпидемической опасности штаммов холерного вибриона, изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока, обнаружило определенные закономерности. Эпидемически опасные изоляты наряду с основными генами вирулентности {ctxAB, tcpA, toxR) характеризуются присутствием и всех дополнительных тестируемых генетических детерминант {zot, rstC, nanH, ompU), что еще раз подтверждает клональность их происхождения. Штаммы, лишенные основных генов вирулентности, не содержат и дополнительных детерминант, входящих в состав филаментозных бактериофагов -СТХф (ген zot) и RSlcp (ген rstC). Вероятно, эти гены напрямую влияют на формирование патогенных свойств микроорганизма и их присутствие характерно только для вирулентных вариантов вибриона. Гены фермента нейрами-нидазы и белка наружной мембраны OmpU распространены среди эпидемически неопасных изолятов более широко. Не исключено, что продукты этих генов участвуют в процессах адаптации микроорганизма к определенной среде обитания.
Реверсия некультивируемых форм холерного вибриона в вегетативное состояние
Привлекает внимание факт обнаружения в последние годы в популяции вибрионов эльтор из поверхностных водоемов ctxAB tcpA вариантов, лизи-рующихся фагом СТХ+, в том числе и гемолизнегативных (г. Чита, 2002 г.) или обусловливающих частичный гемолиз эритроцитов (г. Находка, 2000 г.). Интересно то, что большая часть таких культур (10 из 19) изолирована из поверхностных водоемов Приморья через год после вспышки холеры. Возможно, эти штаммы представляют собой измененные варианты токсигенных вибрионов эльтор, выявленных в поверхностных водоемах в период вспышки 1999 г., которые в результате воздействия условий среды обитания утратили гены вирулентности, но сохранили при этом признаки фенотипа вирулентных штаммов. Подобный тип изменчивости токсигенных штаммов установлен при пассаже на питательных средах в лабораторных условиях. Кроме того, у семи из этих культур определена принадлежность к RO сероварианту, в который, согласно литературным данным [220], чаще способны переходить вирулентные вибрионы, приспосабливаясь таким образом к условиям среды обитания. Появление в регионе штаммов, расцененных по фенотипическим тестам как вирулентные, с присутствием в геноме некоторых «дополнительных» детерминант патогенності! наводит на мысль о возможности постепенного формирования в определенных «экологических нишах» поверхностных водоемов нового клона возбудителя. Полученные результаты свидетельствуют о гетерогенности популяции эпидемически неопасных штаммов по некоторым фенотипическим и генетическим признакам, что, в свою очередь, может рассматриваться как основа для изменчивости микроорганизма. Обнаружение у вибрионов разного происхождения генов ферментов рекомбиназ, принимающих участие в интеграции мобильных генетических элементов в хромосому, свидетельствует о потенциальной возможности рекомбинационных событий в геноме, приводящих к изменению первоначальных свойств микроорганизма. Эти данные, а также экспериментально показанная возможность горизонтальной передачи генов вирулентности в составе филаментозных бактериофагов от токсигенных предшественников к авирулентным культурам [154, 160, 202, 221] дают основание рассматривать эпидемическую безопасность культур из поверхностных водоемов лишь как относительную. Это подтверждается еще и тем, что рецептором для фагов могут являться не только токсинкорегулируемые пили адгезии, отсутствующие у изученных эпидемически неопасных штаммов, но и продуцируемые большим количеством изолятов из поверхностных водоемов маннозочувствительные ге-магглютинины [247].
Таким образом, циркуляция эпидемически опасных штаммов холерного вибриона среди людей и в объектах окружающей среды в регионе ограничена периодом эпидемических осложнений. Ни до вспышки, ни в последующие годы после нее токсигенные штаммы не выявляются. При этом ситуация отличается от таковой на других территориях. Например, в Туркменистане (Иолтании) показана циркуляция как эпидемически опасных, так и потенциально эпидемически опасных (ctxAB tcpA+) вибрионов эльтор среди вибриононосителей и в объектах окружающей среды за год до вспышки холеры [88]. Кроме того, в некоторых регионах на фоне эпидемиологического благополучия отмечается изоляция из поверхностных водоемов токсигенных штаммов (Саратовская и Ростовская области) [22, 37], а также вариантов вибриона с генотипом ctxAB tcpA+ (Саратовская и Ростовская области) или ctxAB tcpA (Саратовская область) [37, 22, 131]. При этом большая часть ctxAB tcpA+ культур оказывается чувствительна к СТХ+ бактериофагу [22, 131], что дает основание рассматривать TCP в качестве рецептора для СТХ+ фага [24]. В нашем же регионе все чувствительные к СТХ фагу штаммы из поверхностных водоемов на фоне эпидемиологического благополучия лишены как генов холерного токсина, так и токсинкорегули-руемых пилей адгезии. Кратковременность циркуляции токсигенных V. chol-erae, отсутствие промежуточных {ctxAB tcpA ) вариантов вибриона, вероятно, связано с жесткими климатическими условиями, которые способствуют значительным адаптационным изменениям микроорганизма. Не исключено, что длительные воздействия среды могут приводить к утрате штаммами генов вирулентности.
Другим вариантом адаптационной изменчивости холерного вибриона в объектах окружающей среды может являться переход его под влиянием неблагоприятных условий в некультивируемое состояние [26, 47, 48, 73, 173, 264]. Экспериментальное культивирование вибрионов разной эпидемической значимости в условиях физиологически низкой температуры и дефицита питательных веществ, а также «солевого стресса» показало закономерное снижение концентрации вегетативных клеток в исходных пробах и параллельный переход части популяции в некультивируемое состояние. С течением времени воздействие этих условий приводит к полной утрате способности культур из микрокосмов к росту на стандартных питательных средах. При этом в пробах посредством световой, люминесцентной и электронной микроскопии обнаруживаются уменьшенные в объеме округлой формы клетки, единичные и собранные в конгломераты. Отмечается также уплотнение клеточной поверхности, целостность ее не нарушается. С увеличением «возраста» НФ клетки продолжают уменьшаться в размере и становятся более электронно-плотными. Наблюдаемые изменения морфологии вибриона соответствуют установленным закономерностям его перехода в НС [65, 161, 173, 219, 289]. Происходящие в НС структурные модификации могут рассматриваться как адаптационная реакция, которая обеспечивает стабилизацию клеток и персистенцию их в неблагоприятных условиях [245]. Способность к формированию конгломератов НФ, возможно, также увеличивает продолжительность сроков выживания клеток в НС. Не исключено, что указанные конгломераты функционируют подобно биопленке, в составе которой, как известно [114, 297], микроорганизмы защищены от неблагоприятного воздействия среды обитания. Вместе с тем морфологически измененные клетки сохраняют определенный уровень метаболической активности, на что указывает наличие у них ряда функционально активных де-гидрогеназ, выявленных в результате исследования их INT-редуктазной активности, которая в присутствии интермедиатов цикла Кребса повышается в 4,5-6,5 раз. Жизнеспособность таких клеток холерного вибриона подтверждается и сохранением у них на начальных этапах некультивируемости подвижности. Наряду с этим у НФ выявлено сохранение специфических антигенных детерминант. На протяжении всего периода наблюдений изменений в составе генов вирулентности у НФ не обнаружено. Наличие в геноме НФ токсигенных штаммов исходного комплекса генетических детерминант патогенності!, видимо, может свидетельствовать об их эпидемической опасности. Согласно данным других авторов стабильность геномного состава вибриона в НС наблюдалась от 3-4 недель [104] до 3 месяцев [67, 122] и одного года [67, 122, 289].
