Введение к работе
Актуальность проблемы. Холера является особо опасной инфекционной болезнью с диарейным синдромом, даже единичные случаи которой в свете Международных медико-санитарных правил (ММСП, 2005 г.) могут рассматриваться как чрезвычайная, нередко имеющая международное значение, ситуация.
Чрезмерная продолжительность седьмой пандемии (вызванной Vibrio cholerae eltor O1), по сравнению с шестью предыдущими (этиологическим агентом которых явился V. cholerae cholerae O1), объясняется как изменением биологических свойств возбудителя (возможность длительного существования в водной среде, изменение вирулентности), так и формированием обильного вибриононосительства, по-видимому, обеспечивающего беспрепятственное прохождение носителей и больных стертыми формами через пункты пропуска на Государственной границе. В конце 1992 г. в Индии, а затем в Бангладеш и Таиланде зарегистрированы вспышки клинически сходного с холерой тяжелого диарейного заболевания, вызванного ранее неизвестным эпидемическим холерным вибрионом О139 (Бенгал), продуцирующим типичный холерный энтеротоксин. С 1996 г. холерный вибрион О139 существует вместе с вибрионом эльтор и в ряде районов Индии и Бангладеш занимает доминирующее положение (Sinha S. et al, 2002).
Анализ эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России вместе с информацией о действующей вспышке холеры на Гаити с высокими показателями летальности свидетельствуют о том, что прогноз по этой инфекции на ближайшие годы остается неблагоприятным и существует реальная возможность завоза из эндемичных стран.
В регионе Сибири и ДВ последнее эпидосложнение по холере (обусловленное заносом инфекции из Китая в гг. Уссурийск и Южно-Сахалинск с последующим накоплением возбудителя в водоемах и развитием вспышек в гг. Владивостоке и Южно-Сахалинске) зарегистрировано в 1999 г.
В отношении холеры общая эпидобстановка обычно характеризуется ежегодным (в летне-осенний сезон) выделением холерного вибриона из поверхностных водоемов. И хотя в регионе подавляющее число изолируемых штаммов является нетоксигенным, видимо, существование интенсивного антропогенного воздействия на водоемы (загрязнение недостаточно очищенными и необеззараженными сточными водами) способствует превращению их в резервуары для размножения вибрионов с опасностью реализации водного пути передачи инфекции при попадании микроба в водоем во время заноса.
Поэтому представляется приоритетным изучение способствующих адаптации, существованию и накоплению холерного вибриона в водной окружающей среде экологических факторов. Все это требует постоянного эпидемиологического надзора за холерой, включая наблюдение за циркуляцией микроорганизмов рода Vibrio в поверхностных водоемах. При этом разработка способа сигнальной детекции холерного вибриона, направленного на оперативное выявление одновременно генетических детерминант возбудителей О1 и О139 серогрупп также актуальна.
Заслуживает внимания тот факт, что холерный вибрион в водоёмах подвержен многообразной изменчивости, степень которой адекватна условиям среды. Вибрион в окружающей среде может пребывать в разных формах, обладает значительной гетерогенностью, а потому его способность к адаптации в разнородной и изменчивой во времени среде обитания требует специального изучения.
Цель исследования. Комплексная оценка эпидемиологической ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке по данным эпидемиологического, микробиологического, молекулярно-генетического, санитарно-гигиенического и экологического мониторинга.
Задачи исследования.
-
Дать оценку динамики развития эпидемиологической ситуации по холере в Сибирском и Дальневосточном Федеральных округах РФ в последнее десятилетие текущей пандемии.
-
Провести анализ абиотических и биотических факторов, влияющих на выживаемость холерного вибриона в поверхностных водоемах.
-
Разработать метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции генов холерного вибриона wbО1, wbО139 и регуляторного гена toxR, апробировать данный метод для ускоренного выявления антигенов холерного вибриона в сочетании с методом иммунофлуоресценции.
-
Охарактеризовать биоразнообразие V. cholerae на основе комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов в условиях эпидемиологического благополучия.
-
Изучить способность V. cholerae разных серогрупп к образованию биопленки в условиях эксперимента.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Установлена закономерность обнаружения атоксигенных холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в мелких полузамкнутых малопроточных водоемах, а также в местах сброса ливневой канализации с неблагоустроенных участков селитебной территории.
Показана роль и значение усовершенствованных методов лабораторной диагностики (комплекса методов – разработанной М-ПЦР на обнаружение генов холерного вибриона О1 и О139 и реакции иммунофлуоресценции на определение специфических антигенов О1 и О139) для изучения экологии холерного вибриона и микробиологического мониторинга за поверхностными водоемами.
Показано преимущественное значение применения комплекса методов – мультиплексной ПЦР и РИФ для детекции V. cholerae O1/О139 серогрупп перед бактериологическим методом, что позволяет вести целенаправленный поиск указанного микроорганизма.
Представлена эпидемиологическая оценка изолированных в регионе штаммов холерного вибриона по комплексу фенотипических и молекулярно-генетических методов.
Показана более выраженная адаптационная способность токсигенных штаммов холерного вибриона из поверхностного водоема во время вспышки холеры к формированию биопленки в сравнении со штаммами от больных.
Теоретическая значимость исследования состоит: в установлении существования скрытого периода накопления токсигенного возбудителя в благоприятных участках поверхностных водоемов в случае заноса, что обусловливает в ряде случаев внезапное возникновение эпидосложнений по холере и подтверждает роль мелких полузамкнутых малопроточных водоемов как возможного резервуара инфекции; в получении новых данных о способности вибрионов разных серогрупп образовывать биопленку и описании морфологических признаков её формирования.
Практическая значимость. Материалы диссертации включены в нормативно-методические документы: методические указания «Лабораторная диагностика холеры» МУК 4.2.2218-07, утверждены руководителем Роспотребнадзора Главным государственным санитарным врачом РФ в 2007 г.; санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации» СП 3.1.1.2521–09, утверждены руководителем Роспотребнадзора Главным государственным санитарным врачом РФ в 2009 г. Депонирован в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" экспериментально полученный RO вариант токсигенного Vibrio cholerae eltor КМ 258. Разработан и внедрен в практику эпидемиологического надзора за холерой метод мультиплексной ПЦР, основанный на одновременном определении в пробе генов холерного вибриона О1, О139 серогрупп и глобального регуляторного гена toxR. Метод в комплексе с реакцией иммунофлуоресценции по данным многолетнего применения (для ускоренного обнаружения вибрионов О1 и О139) внедрен в практику экологического мониторинга. Методические рекомендации «Детекция холерных вибрионов в исследуемом материале с применением мультиплексной ПЦР и иммунофлуоресценции» одобрены Ученым Советом (протокол № 4 от 29.03. 2007 г.), утверждены директором института. «Методические рекомендации по получению и морфологической оценке структуры образуемой холерным вибрионом биопленки» одобрены Ученым Советом (протокол № 2 от 05.03.2010 г.), утверждены директором. Выделенные штаммы с характеристикой их биологических свойств, указанием мест и времени их выделения внесены в таблицу-шаблон в программе Microsoft Access для создания информационной базы данных V.cholerae, изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока с глубиной ретроспективы в 8 лет (2001-2008 г.).
Сформированная коллекция штаммов позволяет изучать их фенотипические свойства и структуру генома с применением современных методов и технологий и получать новые данные для понимания механизмов эволюции эпидемического процесса при холере. Материалы настоящей работы используются в учебном процессе на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям в ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.
Положения, выносимые на защиту:
-
Ситуация по холере в регионе определяется регистрацией заносов с накоплением в ряде случаев возбудителя в поверхностных водоемах, развитием в последующем острых вспышек инфекции (1999 г.) и длительной ежегодной циркуляцией нетоксигенного холерного вибриона в водной окружающей среде;
-
Длительному пребыванию нетоксигенного холерного вибриона в поверхностных водоемах способствует сброс в них неочищенных хозяйственно-бытовых сточных вод и наличие благоприятных биотических и абиотических факторов водной окружающей среды. Обнаружение нетоксигенного холерного вибриона эльтор главным образом в мелких малопроточных водоемах (места неорганизованного отдыха населения) и чрезвычайно редкие находки его в санитарных поясах водозаборов и в гарантированных зонах рекреации в условиях региона обусловливают выбор стационарных точек забора проб также в местах несанкционированного использования водоемов (для купания, рыболовства и летних видов спорта).
-
Предлагаемый вариант мультиплексной ПЦР для одновременной детекции генов Vibrio cholerae О1, О139 серогрупп (wbO1, wbO139) и toxR позволяет оперативно обнаружить ДНК холерного вибриона соответствующей серогруппы и в комплексе с реакцией иммунофлуоресценции повышает эффективность индикации холерного вибриона и своевременного установления границ контаминации поверхностного водоема.
-
Холерные вибрионы, выделенные из поверхностных водоемов в благополучный по холере период, характеризуются вариабельностью культурально-морфологических, агглютинабельных и фаголизабельных свойств; их чувствительность к некоторым антибактериальным препаратам изменяется в динамике. Штаммы не содержат в своем геноме основных генов вирулентности, входящих в состав профагов СТХ (ctxAB, zot), RS1 (rstC), острова патогенности VPI-1 (tcpA). Холерные вибрионы эльтор и О139 серогруппы различаются по наличию в их геноме детерминант персистенции и генов, отвечающих за формирование структуры биопленки.
-
Штаммы Vibrio cholerae eltor О1 обладают широким диапазоном формирования биопленки в отличие от Vibrio cholerae О139 серогруппы. Порошкообразный и коллоидный хитин, а также микрокристаллическая целлюлоза усиливают образование вибрионом биопленки. Токсигенный вибрион эльтор, выделенный из поверхностного водоема во время вспышки холеры, в сравнении с таковым от больных холерой, обладает выраженной способностью к образованию биопленки.
Апробация работы. Изложенные материалы исследований представлены на научной конференции «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения» (М., 2004); 2-ом Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007); IX Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (М., 2007); межрегиональной научно-практической конференции «Итоги, проблемы и перспективы государственной санитарно-эпидемиологической службы Иркутской области» (Иркутск, 2007); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии» (Иркутск, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008); 2-ом межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2008); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней» (г. Иркутск, 2009); научно-практической конференции, посвященной 60-летию со дня образования республиканской санитарно-эпидемиологической станции (Улан-Удэ, 2009 г.); Проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (Ростов-на Дону, 2003-2010); заседании Иркутского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Иркутск, 2010 г.); 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, (Vienna, Austria, 2010); международной научной конференции и международной школе для молодых ученых «Проблемы экологии: Чтения памяти профессора М.М.Кожова» (Иркутск, 2010), а также на научно-практических конференциях Иркутского НИПЧИ (2007-2010 гг.).
Личный вклад автора. Сбор данных в ходе эпидемиологического надзора за холерой, отбор и исследование проб из объектов водной окружающей среды, исследование биологических свойств штаммов холерного вибриона, в т.ч. с применением молекулярно-генетического метода, постановка экспериментов, анализ результатов и подготовка публикаций проведены при непосредственном участии автора.
Работа выполнена в рамках двух плановых тем: «Экологические аспекты эпиднадзора за холерой на территории Сибири и Дальнего Востока» и «Оценка ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке по данным экологического мониторинга и результатам молекулярно-биологического исследования циркулирующих V. cholerae» (№№ государственной регистрации 0120.0013861, 0120.0511209).
Публикации по теме исследования. Материалы исследования изложены в 36 опубликованных научных работах, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертационных работ, 1 – в зарубежной печати и в одном заключительном отчете.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 197 ссылок, из них 106 отечественных и 91 зарубежных авторов и приложения. Работа содержит 20 таблиц и 42 рисунка.
Благодарность. Выражаю глубокую признательность моему Учителю, выдающемуся эпидемиологу и замечательному человеку д.м.н. профессору Александру Семеновичу Марамовичу.
