Введение к работе
Актуальность темы
Последние десятилетия XX века характеризуются активизацией эпидемического проявления природно-очаговых риккетсиозов, объединяемых в группу клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) в различных регионах мира (Тарасевич И.В. и др., 1980, Raoult D., et al., 1997, Rudakov N.V., et al, 2003). Риккетсиозы являются важной проблемой инфекционной патологии многих стран, в том числе и России (Тарасевич И.В., 1975, Raoult D., et al, 1997). За последние годы описано несколько заболеваний, вызываемых ранее неизвестными риккетсиями: астраханская пятнистая лихорадка, японская пятнистая лихорадка, клещевая пятнистая лихорадка острова Флиндерса (Австралия), риккетсиозы, вызываемые Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia parkeri. Они либо ранее не регистрировались, либо принимались за инфекции другой этиологии.
Методы, предлагаемые молекулярной биологией, прежде всего полимеразная цепная реакция и секвенирование нуклеиновых кислот, позволили не только с точностью характеризовать генетический материал микроорганизмов, но и в ряде случаев выявлять возбудителей новых инфекционных заболеваний (Chen S.M., et al, 1994, Nichol S.T., et al, 1993). Молекулярно-биологические методы стали особенно актуальными в риккетсиологии, поскольку микроорганизмы, относящиеся к порядку Rickettsiales, являются облигатными внутриклеточными паразитами, неспособными расти на искусственных питательных средах. Возбудитель ряда риккетсиозов был идентифицирован в результате амплификации (с последующим секвенированием полученных ампликонов) в ПЦР генов риккетсий в материалах от больных людей без выделения чистой культуры. Это заболевание, носящее аббревиатуру TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy), вызываемое Rickettsia slovaca, и заболевание, вызываемое Rickettsia aeschlimannii (Preterms А-М., et al, 2002, Raoult D., et al, 1997, 2002).
Применение «золотого стандарта» идентификации причины инфекционного заболевания (Koch R, 1891, Rivers Т.М., 1937), а именно выделение чистой культуры возбудителя, в риккетсиологии является сложным и не всегда достижимым. Другие способы установления этиологического диагноза в риккетсиологии также не всегда достоверны. Серологический метод не является достаточно точным, поскольку для риккетсий характерны перекрестные серологические реакции, как между собой, так и с неродственными микроорганизмами, например Proteus spp. и Legionella spp. (La Scola В., et al, 1997, Raoult D., et al, 1995, Weil E., et al., 1916). Клинико-лабораторная картина заболевания зачастую вариабельна и не имеет! вырадьЖ^садшнаватрльных кри-
1 вЩо&
териев для каждого конкретного риккетсиоза (La Scola В., et al., 1997). Таким образом, амплификация генов риккетсий в материалах из различных тканей и сред организма человека с последующим секвенированием ампликонов для видовой идентификации оказалась ценным методом установления диагноза в риккетсиологии.
Одним из первых описанных в СССР риккетсиозов человека, передаваемых иксо-довыми клещами, является клещевой сыпной тиф Северной Азии (клещевой риккетси-оз, клещевой сыпной тиф), активные эндемические очаги которого распространены в азиатской части Российской Федерации. С 1979 по 1997 гг. в Российской Федерации выявлено 23980 случаев этой инфекции с ростом заболеваемости более чем в 8 раз (Шпынов С.Н., 1999). Показатели заболеваемости также увеличиваются и в 2001 году составили 2,38 на 100 тыс. населения. Это может быть объяснено как ростом активности очагов клещевого сыпного тифа, так и интенсификацией природопользования и контактов человека с природными очагами и улучшением диагностики. Выделение возбудителя, Rickettsia sibirica, произошло в Восточной Сибири в 1937-1939 гг. После этого все острые инфекционные заболевания, клинически, эпидемиологически и серологически (в РСК с растворимым антигеном R sibirica) соответствующие клещевому сыпному тифу в Сибири и на Дальнем Востоке России, относили к этому заболеванию. Немногочисленные штаммы риккетсий из дальневосточного региона, также отнесенные к R. sibirica, были утрачены.
Еще с середины прошлого века исследователи отмечали отличия клинико-эпидемиологических показателей заболевания, считавшегося клещевым сыпным тифом Северной Азии на Дальнем Востоке России, от заболевания в классических очагах клещевого риккетсиоза Северной Азии в Центральной Сибири (Маевский М.М., 1947, Томилка Г.С, 1987). Пик заболеваемости в Хабаровском крае возникал в июне-июле, что на два месяца позднее, чем, например, в Алтайском крае, среди заболевших отмечалось большое количество лиц пожилого возраста, яркость сыпи выражена меньше (Томилка Г.С, 1987). Были выявлены также и отличия в микробиологических свойствах возбудителя, выделенного на Дальнем Востоке (Сомов Г.П., 1966, Шапиро М.И., 1959). Тем не менее, выделенные в Приморском крае штаммы также были отнесены к R. sibirica. Нужно отметить, что методы исследования, применявшиеся в то время, не позволяли провести четкую видовую дифференциацию риккетсий. Соответственно этому, для серологической диагностики заболевания у человека на Дальнем Востоке РФ использовали растворимый (группоспецифический) антиген, приготовленный из штамма «Нецветаев» R sibirica Подтверждение клинического диагноза клещевого сыпного тифа Северной Азии на Дальнем Востоке с помощью серологических методов
при исследовании с антигенами R sibirica колебалось в различных исследованиях от
53 до 95% (Киреева Р.Я., 1974).
Указанные особенности и различия клинико-эпидемиологических признаков клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации по сравнению с регионами Сибири послужили поводом для подробного изучения этиологии клещевого риккетсиоза в этом регионе.
В прилежащих районах Китая в последние годы было выделено несколько новых штаммов риккетсий (Fan M.Y., et al, 1999, Wang J.W., et al., 1987, Yu X., et al, 1993). Большинство штаммов оказалось идентичными Rickettsia sibirica, однако некоторые были идентифицированы как новые виды. Одним из таких штаммов является штамм
054 или Rickettsia heilongjiangensis, выделенный из клещей Dermacentorsylvarum в се
верной провинции Хэйлунцзян КНР, непосредственно граничащей с Хабаровским кра
ем. Связывание антител в сыворотках переболевших людей в Китае с антигеном этой
риккетсий предполагает патогенность ее для человека (Lou D., et al, 1989).
Цель работы: идентифицировать возбудителя клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке России с помощью молекулярно-биологических методов и дать клинико-эпидемиологическую характеристику этого заболевания.
В соответствии с целью поставлены следующие задачи исследования:
-
Провести оценку эпидемиологической ситуации по клещевому риккетсиозу в Хабаровском крае РФ и вьювить ее особенности по сравнению с регионами вьщеления классических штаммов Rsibirica.
-
Обследовать стандартными методами больных острыми инфекционными заболеваниями, связанными с присасыванием иксодовых клещей, и дать им эпидемиологическую и клиническую характеристику.
-
Провести исследование сывороток больных на наличие антител к антигенам риккетсий группы пятнистой лихорадки (Rickettsia sibirica; Rickettsia heilongjiangensis; Rickettsia Conorii) в РНИФ с корпускулярным антигеном.
-
Разработать тест-систему на основе ПЦР для определения ДНК риккетсий в материалах с потенциально низким ее содержанием. Полученные ампликоны при последующем секвенировании должны позволять точно идентифицировать вид риккетсий.
-
Исследовать разработанным методом материалы от больных (ДНК, выделенную из крови и биоптата первичного аффекта), идентифицировать полученные при ПЦР
результаты при помощи секвенирования ампликонов для определения этиологии рик-кетсиальной инфекции в Хабаровском крае.
-
Дать характеристику выявленным бактериальным агентам методом построения филогенетического дерева.
-
Провести эпидемиологическое обследование природных очагов клещевого рик-кетсиоза, исследовать собранных в очагах и с больных иксодовых клещей молекуляр-но-биологическими методами для выяснения их инфицированности и определения вида риккетсий.
Научная новизна. Проведенное исследование позволило выявить этиологический агент клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации. Молекуляр-но-биологическими методами у больных клинически диагностированным клещевым риккетсиозом выявлены гены Rickettsia heilongjiangensis, что доказывает его этиологическую роль. Среди широкой выборки с помощью молекулярно-биологических методов выявлено 18 больных клещевым риккетсиозом, а серологическими методами - 52 больных. Описана клиническая картина этого заболевания, ему предложено название: «дальневосточный клещевой риккетсиоз».
Вследствие клинического сходства с другими риккетсиозами группы КПП и серологических перекрестных реакций это заболевание ранее принималось за клещевой сыпной тиф Северной Азии, распространенный в Сибири и на Алтае.
Установлено, что основным переносчиком дальневосточного клещевого риккетсиоза являются иксодовые клещи Haemaphysalis сопсіппа, инфицированность которых в изучаемых биотопах составила 28,13%. Клещи Haemaphysalisjaponica douglasi также могут являться переносчиками дальневосточного клещевого риккетсиоза, инфицированность достигает 4,48%.
Изучены эпидемиологические особенности как в группе официально регистрируемого клещевого риккетсиоза, так и в группе больных с диагнозом риккетсиоза, подтвержденным молекулярно-биологическими методами. Выявленные особенности совпадали в обеих группах и оказались следуюгцими: преобладание среди заболевших лиц старших возрастных групп, пик заболеваемости в конце июня-июле.
Впервые проведено сравнение взаимодействия сывороток больных дальневосточным клещевым риккетсиозом с антигенами различных риккетсий, в том числе этиологического агента {Rickettsia heilongjiangensis) и антигена возбудителя клещевого сыпного тифа Северной Азии {Rickettsia sibirica) Исследованные сыворотки реагировали
не только с антигеном R. heilongjiangensis, но также и с антигенами других риккетсий, в т.ч. R. sibirica и R. conorii, однако, как правило, в меньшем разведении.
Разработана модификация ПЦР с использованием «гнездовых» праймеров на основе гена цитрат-синтазы (gltA) риккетсий. Она позволяет обнаруживать генетический материал любых риккетсий в клиническом материале и клещах.
Впервые секвенированы и помещены в базу генетических данных GenBank гены отрВтиповых штаммов Rickettsia heilongjiangensis и Rickettsia hulinensis. Выявлены и по согласованию с авторами (J.Z. Zhang и др.) исправлены неточности в опубликованных в GenBank нуклеотидных последовательностях генов gltA и отрА Rickettsia heilongjiangensis.
В клещахHaemaphysalisjaponicadouglasi впервые была обнаружена ДНКСапсІісІа-tus Rickettsia tarasevichiae.
Впервые выявлена ДНК новой риккетсий, генетически значительно отличающейся от всех известных. Ей дано предварительное название Candidatus Rickettsia principis.
Научно-практическая ценность и реализация результатов работы
Полученные данные свидетельствуют о том, что заболевание, традиционно считавшееся на Дальнем Востоке Российской Федерации клещевым сыпным тифом Северной Азии, вызывается не Rickettsia sibirica, а недавно описанной Rickettsia heilongjiangensis. Поскольку возбудитель клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке отличается от микроорганизма, традиционно считавшегося этиологическим агентом этого давно известного заболевания, предлагается ввести новую нозологическую единицу: «дальневосточный клещевой риккетсиоз», относящийся к группе КПП и вызываемый Rickettsiaheilongjiangensis.
Организациям практического здравоохранения рекомендуется включить обследование на дальневосточный клещевой риккетсиоз в комплекс лабораторных обследований заболевших после присасывания клеща.
Идентификация возбудителя дальневосточного клещевого риккетсиоза предоставляет возможность проводить специфическую диагностику. Корпускулярный антиген этиологического агента болезни {Rickettsia heilongjiangensis) позволяет проводить принципиально более точную диагностику, поэтому именно его следует применять для проведения серологических исследований в эндемичных очагах.
Разработана чувствительная и специфичная модификация ПЦР на ген цитрат-синтазы риккетсий с использованием «гнездовых» праймеров. Она может применяться как в клинической диагностике, так и в научно-исследовательской работе.
Исследование биоптатов первичных аффектов на наличие ДНК риккетсий является значительно более успешным, чем исследование фибриновых сгустков. Это позволяет рекомендовать для клинических реакций использовать материалы биоптатов первичного аффекта.
Материалы диссертации представлены на:
Конференции общества инфекционистов Хабаровского края, г. Хабаровск, 2001 г.
Краевом конкурсе молодых ученых, г. Хабаровск, 2001 г.
Конференции отдела эпидемиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва, 2002 г.
Научных конференциях справочного центра ВОЗ, лаборатории риккетсиозов Средиземноморского университета, г. Марсель, 2003, 2004 гг.
14-м ECCMID, Прага, 2004 г.
По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в базу генетических данных GenBank внесено 6 отдельных позиций.
Апробация диссертации состоялась на совместной конференции отдела природно-очаговых болезней и отдела эпидемиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 21 апреля 2004 года.
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц и 21 рисунок. Состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 37 работ, опубликованных на русском языке и 106 работ на иностранных языках.
![Клинико-эпидемиологическая характеристика полиомиелита и острых вялых параличей на этапе ликвидации заболевания [Электронный ресурс]](/i/i/4604/209879.png "Клинико-эпидемиологическая характеристика полиомиелита и острых вялых параличей на этапе ликвидации заболевания [Электронный ресурс] Шестакова Ольга Ильинична")
![Клинико-эпидемиологическая характеристика поражений печени у больных туберкулезом легких [Электронный ресурс]](/i/i/4292/209973.png "Клинико-эпидемиологическая характеристика поражений печени у больных туберкулезом легких [Электронный ресурс] Муромцева Александра Анатольевна")
![Клинико-эпидемиологическая характеристика стрептококковой инфекции в г. Сургуте (на примере скарлатины) [Электронный ресурс]](/i/i/4404/207456.png "Клинико-эпидемиологическая характеристика стрептококковой инфекции в г. Сургуте (на примере скарлатины) [Электронный ресурс] Козловская Ольга Витальевна")