Введение к работе
Актуальность проблемы
Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами, такие как иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ), клещевой энцефалит (КЭ) и их микст-формы представляют серьезную проблему здравоохранения для большинства территорий Российской Федерации. На протяжении последней четверти ХХ века заболеваемость этими инфекциями неуклонно росла и достигла беспрецедентно высокого уровня (Злобин В.И., Горин О.З., 1996; Коренберг Э.И., 1996; Борисов В.А., 2002; Злобин В.И., 2010).
В пределах России находится значительная или даже большая часть мирового ареала B. burgdorferi sensu lato (Коренберг Э.И. и др., 1995). По мере улучшения диагностики показатели заболеваемости неуклонно приближаются к прогнозированной величине, которая составляет не менее 10-12 тыс. случаев в год. Наибольшее число случаев приходится на Урал, Западную Сибирь и Волго-Вятский регион (Коренберг Э.И., 2001; Ястребов В.К., Утенкова Е.О., 2010).
На территории России практически все очаги ИКБ и КЭ являются сочетанными. Районы интенсивного роста заболеваемости ИКБ в основном совпадают с зоной высокого риска заражения КЭ (Матущенко А.А., 2002; Вельгин С.О. и др., 2007; Козлова И.В., 2008; Баранова Н.С. и др., 2010). Показано нередкое наличие микст-форм при заражении двумя и более геновидами боррелий, а также боррелий в сочетании с вирусом КЭ. Удельный вес микст-инфекции среди больных с ИКБ составляет от 5 до 30% по данным разных авторов (Коренберг Э.И., 2002; Леонова Г.Н. и др., 2002; Оберт А.С. и др., 2001; Ястребов В.К., 2010). Имеются отдельные работы, которые затрагивают некоторые аспекты эпидемиологии клещевых моно- и микст-инфекций на территории Уральского региона (Волкова Л.И. и др. 2003; Колясникова Н.М., 2008 г.), но в них не проведен комплексный анализ, необходимый для выявления тенденций в динамике заболеваемости, определения ее структуры, клинических форм, прогноза и планирования противоэпидемических и лечебных мероприятий. Отсутствуют данные об уровне зараженности переносчиков возбудителями клещевых инфекций, в т.ч. микст-инфицированности, не известны генетическая структура возбудителей, современный ареал, процессы формирования антропоургических очагов. Не дана оценка влияния объемов и качества профилактических мероприятий на уровень заболеваемости, нет обоснований современных подходов к профилактике клещевых инфекций. Вместе с тем особую проблему составляют в настоящее время энцефалитно-боррелиозные микст-заболевания. В Екатеринбурге сочетание двух инфекций отмечено у 10,7±2,2% всех больных КЭ и ИКБ, что составляет 6,3 на 100 тыс. человек (Лесняк О.М., 1999), в Северо-Западном регионе России – в 15% наблюдений (Лобзин Ю.В., Усков А.Н., 2000); в Томской области от 25-30% до 40% случаев ИКБ протекает одновременно с КЭ (Лепехин А.В. и др.,2000; Ундинцева В.А. и др., 2010). Ряд авторов отмечает явление патоморфоза КЭ, различия в тяжести течения, преобладании определенных клинических форм, летальности в пределах нозоареала (Злобин В.И., 2006; Иерусалимский А.П., 2000; Волкова Л.И., Ковтун О.П., 2010; Захарычева Т.А., 2010; Толоконская Н.П. и др., 2010).
Если клинико-патогенетические аспекты моно-инфекции КЭ и ИКБ достаточно глубоко изучены, то механизмы взаимовлияния, интерференции и взаимоисключения при микст-инфекции (МИ) этих возбудителей остаются практически не исследованными. Вовлечение в процесс нервной системы при обеих инфекциях усложняет диагностику и изучение микст-инфекции (Лобзин Ю.В. и др., 2000; Деконенко Е.П. и др., 2002). К настоящему времени глубоко исследованы на системном и локальном уровне цитопатические проявления и апоптотические процессы при КЭ (Olsen C.W., Kehren J.C.,1999; Komatsu, Т., 1999; Boje K. et al., 2002). Практически не исследованы механизмы иммуноопосредованного воспаления при МИ. Интерес представляет анализ нарушений иммунного гомеостаза на системном уровне и в пределах ЦНС, в частности, популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов, количественное изучение продуктов индуцированной секреции медиаторов воспаления, образуемых активированными клетками нервной ткани, макрофагальными элементами нейроглии (интерлейкины, оксид азота, комплемент, БТШ), что не исследовано при КЭ, микст-инфекции с ИКБ и собственно ИКБ, протекающих с преимущественным поражением нервной системы.
Секреторные продукты иммуноцитов, как показано в большом цикле работ различных авторов, несомненно, обладают нейромедиаторными и психотропными эффектами. На эмоциональную сферу человека оказывают влияние нейропептиды костного мозга и тимуса, установлена нейротрансмиттерная роль секреторных продуктов иммуноцитов: ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-g (Кравцов А.Н. и др., 2004; Connor T.J.et al., 1998; Dinan T.G. et al., 1998; Segman R.H. et al., 2002). Наличие нейропсихологических изменений, выявленных у пациентов, перенесших клещевые инфекции, является одним из показателей завершенности процесса или его прогредиентности, поскольку с разрешением основного заболевания становится более благоприятным восстановление мнестических расстройств (Ерман Б.А., 2001; Иерусалимский А.П., 2003). При КЭ были отмечены мнестико-интеллектуальные и характерологические нарушения (Помогаева А.П., 2006; Надеждина М.В., 2007). До 54% реконвалесцентов, перенесших ИКБ, беспокоили снижение памяти и нарушение концентрации внимания, не имеющие объективного подтверждения, но отражающиеся на качестве жизни пациентов (Деконенко Е.П., 2005; Бондаренко А.Л. и др., 2006; Steere A.C., 1989; Logigan E.L., 1996). Однако, несмотря на проводимые исследования, психосоматические феномены при КЭ и ИКБ остаются недостаточно изученными, а при МИ – неизвестными.
Установлено изменение характера нитроксидергической регуляции на системном и локальном уровне при КЭ (Конькова А.Б., 2001), однако не исследованы эти процессы при микст-инфекции с ИКБ. Между тем усиление системной и локальной продукции NO может приводить к инициации процессов апоптоза, свободнорадикального окисления и требует патогенетически обоснованной медикаментозной коррекции. Указанные мотивы послужили основанием для проведения настоящей работы.
Цель исследования: на основании результатов комплексных эпидемиологических и клинико-иммунологических исследований установить региональные особенности этиологии, эпидемиологии, иммуноопосредованные механизмы патогенеза при различных клинических формах иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с КЭ) на эндемичной территории Южного Урала, обосновать рациональные подходы к патогенетически ориентированной терапии.
Задачи исследования:
1) охарактеризовать основные эпидемиологические закономерности иксодовых клещевых боррелиозов, клещевого энцефалита, микст-инфекций в Южно-Уральском регионе;
2) осуществить сравнительный молекулярно-эпидемиологический анализ возбудителей клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов на территории Челябинской области;
3) выявить региональные этиологические и клинико-эпидемиологические особенности «клещевых» инфекций на территории Южно-Уральского региона России;
4) изучить клиническую характеристику «клещевых» инфекций, этиологически обусловленных различными патогенами, и их генетическими вариантами, микст-инфекции, вызванной сочетанным инфицированием вирусом КЭ и боррелиями;
5) изучить тип иммунного ответа на системном и локальном уровне, в том числе анализ нарушений иммунного гомеостаза в пределах ЦНС и проницаемости ГЭБ при подостром течении иксодовых клещевых боррелиозов с преимущественным поражением нервной системы, КЭ и микст-формах по семиотике поражения ЦНС;
6) разработать патогенетическую схему клеточно-молекулярных иммунных нарушений при ИКБ (моно и микст-инфекция с КЭ), протекающих с поражением ЦНС;
7) оптимизировать тактику лечения микст-инфекции (КЭ+ИКБ) и собственно КЭ на основе внедрения патогенетически ориентированных методов коррекции нитроксидергических процессов.
Научная новизна
Получена достоверная информация о генетической вариабельности возбудителей ИКБ в основных переносчиках (B. garinii NT 29, B. garinii 20047, В. afzelii) и в биологических материалах от больных (B. garinii, B. afzelii и Borrelia burgdorferi sensu stricto), что подтверждает роль геновидов боррелий патогенного комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato в развитии ИКБ у больных в Челябинской области. Показано спонтанное инфицирование иксодовых клещей вирусом КЭ, относящимся к сибирскому субтипу, субгенотипу «Заусаев». Проведен количественный анализ содержания в клещах ДНК боррелий и РНК ВКЭ посредством ПЦР с электрофоретической или гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакций в реальном времени.
Разработан новый подход к изучению центральных механизмов регуляции иммунного ответа на системном и локальном уровнях при клещевых нейроинфекциях, протекающих с поражением ЦНС на основе анализа клеточных (иммунотипирование мононуклеаров ликвора) и гуморальных про- и противовоспалительных факторов (метаболиты нитроксид-молекулы, цитокины, белки системы комплемента, иммуноглобулины, ферритин).
Новыми являются сведения об иммунологических особенностях патогенеза иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с КЭ), в том числе нарушений проницаемости ГЭБ при микст-инфекции (ИКБ+КЭ), что является основанием для определения направлений коррекции выявленных нарушений. Разработана клеточно-молекулярная схема патогенеза ИКБ и микст-инфекции, протекающих с поражением ЦНС.
Практическая значимость работы
Разработана система повышения качества лабораторной диагностики трансмиссивных клещевых инфекций на эндемичной территории Челябинской области за счет использования современных молекулярно-генетических тестов и расширения спектра определяемых патогенов. Для улучшения лабораторной диагностики внедрены в практическую работу ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области" современные молекулярно-генетические методы исследования основных переносчиков КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, что будет способствовать повышению качества экстренной профилактики клещевых инфекций и, в конечном итоге, реальному снижению заболеваемости трансмиссивными клещевыми инфекциями в регионе.
Структуры нуклеотидных последовательностей фрагмента гена белка оболочки ВКЭ (ген Е) депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank: 1) TBEV Cheliabinsk GU 143821, 2) TBEV Cheliabinsk GU 143822, 3) TBEV Cheliabinsk GU 143820 под № 1281338, № 1281349, № 1281351.
Оригинальным направлением в лечении изучаемых инфекций является применение патогенетической коррекции нарушений нитроксидергической регуляции при моно- и микст-инфекциях. Новизна способа защищена патентом на изобретение. (№ 2007103435/14(003704): «Применение цитофлавина для лечения клещевых нейроинфекций»).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Территория Челябинской области является эндемичной по иксодовым клещевым инфекциям (иксодовые клещевые боррелиозы, клещевой энцефалит, микст-инфекция); уровни заболеваемости в течение последних 12 лет превышали показатели по РФ в 2-8 и 5-14 раз соответственно; начиная с 1999 г. в области отмечается тенденция снижения заболеваемости.
2. Молекулярная эпидемиология возбудителей «клещевых» инфекций на территории Челябинской области характеризуется гомогенностью генетической структуры циркулирующего вируса КЭ, изоляты которого принадлежат сибирскому субтипу, субгенотипу «Заусаев» и несоответствием между спектром геновидов боррелий у основных переносчиков (B. garinii NT 29, B. garinii 20047, В. аfzelii) и в биологическом материале от больных (B. afzelii , B. garinii B. burgdorferi s.s).
3. Челябинская область характеризуется своеобразием эпидемиологии клинических форм и явления патоморфоза клещевого энцефалита по сравнению с другими эндемичными регионами РФ, что выражается в утяжелении клинического течения КЭ, росте менингеальных и очаговых форм. Преимущественная циркуляция геновида В. garinii находится в полном соответствии с клинической картиной заболевания и доказанной нами нейротропностью данного геновида борелий (частота поражений нервной системы, в том числе центрального отдела, составляет по нашим данным - 38,3 %, что существенно превышает данные ряда авторов по Пермскому краю (28 %), Иркутской области (27%), Северо-Западному региону России (37,6%). Южный Урал является самой восточной точкой Евразии, где был обнаружен геновид B. burgdorferi s.s.
4. Клещевые нейроинфекции (ИКБ, КЭ и их сочетанные формы) приводят к формированию иммунного ответа на системном и локальном уровнях. Основными патогенетическими механизмами являются: 1) L-аргинин-зависимый механизм с гиперпродукцией метаболитов нитроксид-молекулы в крови и ликворе, 2) прогрессирующий апоптоз как результат прямого проапоптогенного действия NO на клетки-мишени и опосредованного действия нейропатогенов через активацию TNF-a, рецептора CD95, 3) воспалительная цитокиновая реакция, 4) оксидативный стресс мембран нейронов и глии.
5. Данные параллельного исследования в сыворотке крови и ликворе флогогенных и антифлогогенных гуморальных факторов отражают характер, выраженность и направленность патологического процесса на различных этапах течения клещевых нейроинфекций (острый период, период реконвалесценции) и позволяют контролировать эффективность комплексной, в том числе, и патогенетически ориентированной терапии. Использование цитофлавина, как средства нейромедиаторной поддержки, с целью коррекции гиперпродукции оксида азота у больных клещевыми нейроинфекциями, является патогенетически обоснованным.
Внедрения
Основные положения и результаты исследования используются в повседневной практической работе инфекционных отделений, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области». В результате проведенного исследования разработаны и внедрены в практику работы отделений инфекционного корпуса № 1, № 4 ГКБ № 8, городского центра нейроинфекций г. Челябинска способ патогенетически ориентированной терапии клещевых нейроинфекций, подтвержденный патентом на изобретение РФ, и способ этиологической диагностики иксодовых клещевых боррелиозов методом ПЦР.
Для осуществления практической деятельности с учетом результатов исследования разработаны и опубликованы методические рекомендации для врачей «Иксодовые клещевые боррелиозы: моно и микст-инфекция (клиника, диагностика, лечение, профилактика)», утвержденые приказом МЗ Челябинской области № 637 от 16.07.2008 г., подготовлен и находится на утверждении в МЗ РФ «Стандарт специализированной медицинской помощи больным иксодовыми клещевыми боррелиозами» (2008 г.)
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия».
Апробация материалов диссертации
Основные положения и результаты работы были представлены на втором Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004 г.), Всероссийском конгрессе по иммунологии и аллергологии (Уфа, 2005 г.), научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2005); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней военно-медицинской академии им. С.Н.Кирова (СПб., 2006 г.), областных научно-практических конференциях врачей-инфекционистов и эпидемиологов (Челябинск, 2006, 2008), Юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике», посвященной 70-летию кафедры инфекционных болезней (Уфа, 2007 г.), 7-ом Всероссийском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Н. Новгород, 2006), научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины» (СПб., 2007), на юбилейной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения С.П.Боткина (Санкт-Петербург., 2007), научно-практической конференции, посвященной 75-летию Дагестанской государственной медицинской академии «Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней: традиционные и психосоматические подходы» (Челябинск, 2007), научно-практической конференции «Инфекции в практике клинициста: антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах» (Харьков, 2008 г.), 1 Ежегодном Российском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009), Российской научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009 г.), межрегиональной научно-практической конференции «Полипатии в семейной и клинической медицине, посвященной 65-летию ЧелГМА и памяти профессора П.Д. Синицина (Челябинск, 2009), 7 итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2009), Второй Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых нейроинфекций» (Екатеринбург, 2010), научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (Иркутск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, из них 13 в рекомендуемых ВАК изданиях. Имеется патент на изобретение (№ 2007103435/14(003704): «Применение цитофлавина для лечения клещевых нейроинфекций»), методические рекомендации для врачей.
Структура и объем диссертационной работы
Диссертационная работа изложена на 359 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, восьми глав собственных исследований, обсуждения результатов работы и заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и 59 таблицами. В работе представлено 8 выписок из истории болезни. Библиографический указатель содержит 478 источников, из которых 230 работ отечественных и 247 зарубежных авторов.
