Введение к работе
Актуальность исследования. Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами, такие как иксодовые клещевые ооррелиозы (ИКБ), клещевой энцефалит (КЭ) и их микст-формы представляют серьезную проблему здравоохранения для большинства территорий Российской Федерации. На протяжении последней четверти XX века заболеваемость этими инфекциями неуклонно росла и достигла беспрецедентно высокого уровня [Коренберг Э.И., 2004; Онищенко Г.Г., 2007; Львов Д.К., 2007; Злобин В.И., 2010]. В пределах России находится значительная или даже большая часть мирового ареала В. burgdorferi sensu lato [Коренберг Э.И. и др., 2010]. По мере улучшения диагностики показатели заболеваемости приближаются к прогнозированной величине, которая составляет не менее 10-12 тыс. случаев в год. Наибольшее число случаев приходится на Урал, Западную Сибирь и Волго-Вятский регион [Коренберг Э.И., 2001; Ястребов В.К., 2010].
На территории России практически все очаги ИКБ и КЭ являются соче-танными. Районы интенсивного роста заболеваемости ИКБ в основном совпадают с зоной высокого риска заражения КЭ [Бельгии CO., 2007; Коренберг Э.И. и др., 2007; Козлова И.В., 2008]. Показано нередкое наличие микст-форм при заражении двумя и более геновидами боррелий, а также боррелий в сочетании с вирусом КЭ. Удельный вес микст-инфекции среди больных с ИКБ составляет от 5 до 30% по данным разных авторов [Оберт А.С, 2001; Коренберг Э.И., 2002; Леонова ПН., 2007]. Имеются работы, которые затрагивают отдельные аспекты эпидемиологии клещевых моно- и микст-инфекций на территории Уральского региона [Колясникова Н.М., 2008 г., Волкова Л.И., 2010], но в них не проведен комплексный анализ, необходимый для выявления эпидемиологических закономерностей, тенденций в динамике заболеваемости, определения ее структуры, клинических форм, прогноза и планирования противоэпидемических и лечебных мероприятий. В данном контексте особую проблему составляют энцефалитно-боррелиозные микст-заболевания. В Екатеринбурге сочетание двух инфекций отмечено у 10,7±2,2% всех больных КЭ и ИКБ, что составляет 6,3 на 100 тыс. человек [Лесняк О.М., 1999]. В Северо-Западном регионе России - в 14% наблюдений [Усков А.Н., 2008], в Томской области от 25-30% до 40% случаев ИКБ протекает одновременно с КЭ [Удинцева И.Н. и др., 2010].
Экспоненциальный рост исследований по изучению генома вируса клещевого энцефалита в конце XX века выявил генотипическую и фенотипиче-скую вариабельность популяций ВКЭ, привел к развитию молекулярной эпидемиологии КЭ. Большинство авторов, описывающих явление патоморфоза КЭ, связывает это явление с особенностями местных популяций вируса КЭ [Злобин В.И. и др., 2003, 2010; Погодина В.В. и др., 2004, 2007]. Клинический полиморфизм иксодовых клещевых боррелиозов на различных эндемичных территориях во многом обусловлен генетической гетерогенностью возбудителей [Усков А.Н., 2003; Манзенюк И.Н.,2005; Коренберг Э.И., 2007]. В связи с этим актуальным становится изучение молекулярной эпидемиологии возбудителей в
природных очагах и клинической картины «клещевых» инфекций, этиологически обусловленных различными патогенами и их генетическими вариантами.
Если патогенетические аспекты моно-инфекции КЭ и ИКБ достаточно глубоко изучены, то механизмы взаимовлияния, интерференции и взаимоисключения при микст-инфекции (МИ) этих возбудителей остаются практически не исследованными. Вовлечение в процесс нервной системы при данных заболеваниях усложняет диагностику и изучение микст-инфекции [Лобзин Ю.В., 2003; Деконенко Е.П., 2005]. К настоящему времени глубоко исследованы ци-топатические проявления и апоптотические процессы в ЦНС при КЭ [Boje К. et al., 2002; Komatsu, Т., 2003]. Практически не исследованы механизмы иммуно-опосредованного воспаления при МИ. Вместе с тем существуют две концепции иммунологического контроля воспалительных реакций в ткани мозга: одна из них предполагает наличие собственного пула иммунокомпетентных клеток мозга [Малашхия Ю.А., 1999; Лисяный Н.Н., 2004; Hart, M.N., 2001], другая -осуществление контроля за воспалением в пределах ЦНС иммунокомпетент-ными клетками периферической крови [Fawcell, J.W., 1999; DeVries Н.Е., 2003]. Предметом дискуссии является вопрос о влиянии изменения функционального состояния клеточной системы эндотелий-астроглия на развитие и течение патологического процесса в ткани мозга, особенно при возникновении воспалительных реакций [Беляева И.А., 1999; Гусев И.А., 2001; Calderwood, S.K., 2007]. Это связано с полученными доказательствами экспрессии эндотелием ГЭБ и глией молекул клеточной адгезии, Са2+— независимой изоформы фермента син-тазы-оксида азота (нейротрансмиттера и нейротоксина), который в отличие от Са —зависимых изоформ синтазы экспрессирует NO только при патологических состояниях в ЦНС. Появились данные о наличии общих лиганд-рецепторов астроглии и иммунокомпетентных клеток периферической крови для ряда цитокинов [Чехонин В.П., 2007; Changping, Y., 2008]. Это обуславливает необходимость разработки и научного обоснования клеточно-молекулярной схемы патогенеза иксодовых клещевых боррелиозов, КЭ и микст-инфекции, протекающих с поражением ЦНС.
Установлено изменение характера нитроксидергической регуляции при КЭ [Конькова А.Б., 2001], однако не исследованы эти процессы при ИКБ и МИ. Между тем усиление системной и локальной продукции NO может приводить к инициации процессов апоптоза, свободнорадикального окисления и требует патогенетически обоснованной медикаментозной коррекции. Применение ингибиторов продукции оксида азота представляет собой потенциальную фармако-терапевтическую стратегию [Muscara M.N. et al., 2009].
Секреторные продукты иммуноцитов, как показано в большом цикле работ различных авторов, несомненно, обладают нейромедиаторными и психотропными эффектами [Кравцов А.Н, и др., 2004; Connor T.G., 1998]. Наличие нейропсихологических изменений, выявленных у пациентов, перенесших клещевые инфекции, является одним из показателей завершенности процесса или его прогредиентности [Ерман Б.А., 2001; Иерусалимский А.П., 2006]. Однако,
несмотря на проводимые исследования, психосоматические феномены при КЭ и ИКБ остаются недостаточно изученными, а при МИ - неизвестными.
Таким образом, перечисленные выше обстоятельства, делают инфекции, передающиеся иксодовыми клещами (ИКБ, КЭ и их микст-формы) важной научной и практической проблемой, требующей всестороннего изучения, обосновывают необходимость проведения настоящего исследования.
Цель исследования. Изучить этиологию, основные закономерности эпидемического процесса, иммуноопосредованные механизмы патогенеза при различных клинических формах иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с клещевым энцефалитом) у больных, проживающих на эндемичной территории Южного Урала, обосновать рациональные подходы к патогенетической терапии.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать основные закономерности эпидемического процесса при иксодовых клещевых боррелиозах, клещевом энцефалите и их микст-формах в Южно-Уральском регионе России.
-
Провести молекулярно-эпидемиологический анализ возбудителей клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов в природных очагах и выявить этиологические и клинико-эпидемиологические особенности клещевых инфекций на территории Челябинской области.
-
Дать клиническую характеристику клещевых инфекций, этиологически обусловленных различными патогенами, и их генетическими вариантами, а так же микст-инфекции, вызванной сочетанным инфицированием вирусом клещевого энцефалита и боррелиями.
-
Изучить тип иммунного ответа на системном и локальном уровне, степень резистентности ГЭБ у больных иксодовыми клещевыми боррелиозами, клещевым энцефалитом и микст-формами с преимущественным поражением нервной системы.
-
Оценить роль клеточно-молекулярных иммунных нарушений в патогенезе поражений ЦНС у больных клещевым энцефалитом, иксодовыми клещевыми боррелиозами (моно- и микст-инфекция), протекающих с преимущественным поражением ЦНС.
-
Изучить лечебный эффект цитофлавина для коррекции нитроксидерги-ческих процессов при иксодовых клещевых боррелиозах, клещевом энцефалите, микст-инфекции.
Научная новизна исследования
Проведен анализ количественного содержания в клещах ДНК боррелий и РНК вируса клещевого энцефалита с использованием метода ПЦР с электрофоре-тической и гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакций в реальном времени. Выявлена генетическая вариабельность возбудителей ИКБ {В. garinii и ее геноварианты В. garinii NT 29, В. garinii 20047, В. afielii) в основных переносчиках и в биологических материалах от больных. Показано, что спонтанное инфицирование иксодовых клещей вирусом КЭ обусловлено сибирским субтипом, относящимся к субгенотипу «Заусаев».
Изучен механизм регуляции иммунного ответа на системном и локальном уровнях при клещевых нейроинфекциях на основе анализа гуморальных про- и противовоспалительных факторов (метаболиты нитроксид-молекулы, цитокины, белки системы комплемента, иммуноглобулины, ферритин). Выявлены и научно обоснованы основные патогенетические механизмы клеточно-молекулярных иммунных нарушений при КЭ, ИКБ, МИ.
Выявлена стереотипность патофизиологических процессов на системном (кровь) и локальном (ЦНС) уровнях. Показано формирование Th-І- зависимого типа иммунооопосредованного воспаления в ЦНС, выявлена готовность лимфоцитов ликвора к FAS-опосредованному рецептор-зависимому апоптозу в остром периоде клещевых нейроинфекций.
Установлено, что на системном уровне превалирует клеточный иммунный ответ в острой фазе инфекционного процесса при КЭ, ИКБ, МИ. Взаимодействие цитокинов у больных с КЭ, ИКБ, МИ с преимущественным поражением нервной системы определяется или синергизмом TNF-cc и ИФН-у, или антагонизмом ИЛ-4 с ИФН-у. Выявлен существенный рост содержания TNF-oc в сыворотке крови и ликворе в остром периоде клещевых инфекций, который способен через соответствующие рецепторы инициировать рецептор-зависимый апоптоз клеток.
Доказана активация биорегуляторной системы «L-аргшшн-оксид азота» по достоверному приросту концентрации нитратов, нитритов и суммарных метаболитов нитроксид-молекулы в сыворотке крови и ликворе.
Изучена резистентность ГЭБ в направлении мозг- кровь для цитозолыюго нейронспецифического белка - NSE. Показано, что различие степени проницаемости ГЭБ при ИКБ, КЭ и МИ зависит не столько от выраженности деструктивных изменений, сколько от соотношения повреждения между эндотелиально-базальной и астроглиальной частей барьера.
Установлено, что воспалительный процесс в мозговых оболочках и мозговой ткани характеризуется повышением концентрации ферритина не только в сыворотке крови, но и в СМЖ. Повышенный уровень синтеза ферритина, как белка теплового шока, является одним из факторов прогноза течения заболевания.
Установлены достоверные отличия в способности геновидов боррелий комплекса В. burgdorferi sensu lato обусловливать различный характер органной патологии, так поражение нервной системы и общеинфекционный синдром преимущественно обусловлены геновидом В. garinii, а поражения опорно-двигательного аппарата- геновидом В. burgdorferi sensu stricto.
У больных ИКБ в сочетании с КЭ на эндемичной территории Южного Урала наблюдается несколько вариантов реализации инфекционного процесса, отличающихся частотой, характером и динамикой клинических симптомов. При анализе манифестных форм в 35% наблюдений доминируют клинические симптомы и синдромы, характерные для КЭ, в 23% превалирует клиническая симптоматика, характерная для ИКБ. Получены достоверные отличия в частоте интоксикационного синдрома и органных поражений со стороны нервной и сердечно-сосудистой систем у больных микст-инфекцией, вызванной сочетанным инфицированием вирусом клещевого энцефалита и геновидом В. burgdorferi s.s.
Практическая значимость работы
Анализ зоолого-паразитологической информации позволяет проводить типизацию природных очагов. В Южно-Уральском регионе России на основании типов населения иксодовых клещей и их доминирующих видов, фаунисти-ческих комплексов мелких млекопитающих-прокормителей иксодовых клещей, характера заболеваемости в различных ландшафтных зонах выделены административные территории с высокой рекогносцировочной оценкой степени риска заражения.
Внедрение современных молекулярно-генетических методов исследования основных переносчиков клещевого энцефалита, иксодовых клещевых боррелио-зов, гранулоцитарного анаплазмоза человека, моноцитарного эрлихиоза человека в практическую работу ФГУЗ «Центра гигиены и эпидемиологии в Челябинской области» позволило улучшить качество экстренной профилактики клещевых инфекций в регионе.
Апробирован аппаратный метод цитофлюориметрического исследования клеточного состава нативного ликвора у больных с нейроформами КЭ, ИКБ, МИ.
Исследование в крови и ликворе провоспалительных (метаболиты нитро-ксид-молекулы, система белков комплемента, цитокины) и противовоспалительных факторов (ферритин) позволяет контролировать эффективность лечебных мероприятий.
Использование психометрического метода и мини-исследование умственного состояния (MMSE-тест) в клинической практике позволяет выявить у пациентов с поражением ЦНС нейропсихологические и когнитивные расстройства в раннем и отдаленном периодах реконвалесценции.
Применение патогенетической коррекции нарушений нитроксидергиче-ской регуляции позволяет улучшить исход при КЭ, ИКБ, МИ, протекающих с преимущественным поражением нервной системы. Получен патент на изобретение: «Применение цитофлавина для лечения клещевых нейроинфекций».
Личное участие автора в получении результатов
Автором разработана методология проведения комплексного научного исследования по проблеме трансмиссивных «клещевых» инфекций в условиях со-четанных природных очагов КЭ и ИКБ, определены цели и задачи исследования, разработана информационная составляющая темы и дизайн исследования, выполнен сбор, анализ, статистическая обработка результатов исследования, сделаны выводы.
Автором изучены и статистически обработаны архивные данные заболеваемости КЭ, ИКБ Управления Роспотребнадзора Челябинской области и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области» за период с 1998 по 2010 гг. Автором изучены и подробно проанализированы результаты прямых и непрямых микробиологических, вирусологических методов исследования. Автор принимал участие в клиническом обследовании и лечении больных, организовывал проведение всех лабораторных, иммунологических и инструментальных исследований.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Основными закономерностями эпидемического процесса иксодовых клещевых боррелиозов и клещевого энцефалита на территории Южного Урала являются высокий эпизоотический потенциал природных очагов, расширение ареала возбудителей, антропогенная трансформация естественных ландшафтов. Территория Челябинской области эндемична по иксодовым клещевым инфекциям (иксодо-вые клещевые боррелиозы, клещевой энцефалит, а также их сочетание - микст-инфекция) и характеризуется высокими уровнями заболеваемости в горнолесной и лесостепной зонах, превышающими показатели РФ в 2-8 и 5-14 раз соответственно, значительной долей смешанного инфицирования (20%). Молекулярная эпидемиология возбудителей клещевых инфекций на Южном Урале характеризуется гомогенностью генетической структуры циркулирующего вируса клещевого энцефалита, изоляты которого принадлежат сибирскому субтипу, субгенотипу «Заусаев» и циркуляцией в природе широкого спектра геновидов боррелии у основных переносчиков (В. garinii и ее геноварианты, В. afzelii) и часто выявляемых в биологическом материале от больных (В. afzelii, В. garinii, В. burgdorferi s.s).
-
Клещевой энцефалит у больных в Челябинской области характеризуется своеобразием эпидемиологии клинических форм и явлениями патоморфоза, что выражается в большой доле среднетяжелого и тяжелого течения, преимущественно в виде менингеальных и очаговых форм, наличием летальных исходов. Клиническая картина иксодовых клещевых боррелиозов у больных, проживающих на территории Южного Урала, обусловлена частым инфицированием геновидом В. garinii и проявляется преимущественным поражением нервной системы (частота поражений нервной системы, в том числе центрального отдела, составляет - 38,3%).
-
При клещевых инфекциях (ИКБ с преимущественным поражением нервной системы, КЭ и их сочетанные формы) формируется иммунный ответ на системном и локальном уровнях. Основными патогенетическими механизмами поражения нервной системы являются: 1) L-аргинин-зависимый механизм с гиперпродукцией метаболитов нитроксид-молекулы в крови и ликворе, 2) прогрессирующий апоптоз как результат прямого проапоптогенного действия N0 на клетки-мишени и опосредованного действия нейропатогенов через активацию TNF-a, рецептора CD95, 3) воспалительная цитокиновая реакция, 4) ок-сидативный стресс мембран нейронов и глии.
-
Флогогенные и антифлогогенные гуморальные факторы отражают характер, выраженность и направленность патологического процесса в различные периоды течения клещевых нейроинфекций (острый период, период реконвалес-ценции) и позволяют контролировать эффективность комплексной, в том числе, и патогенетически ориентированной терапии. Стратегия патогенетической терапии больных клещевым энцефалитом, иксодовыми клещевыми боррелиозами, микст-инфекцией, направленная на ингибирование нитроксидергических процессов, приводит к более быстрому регрессу менингеального синдрома и уменьшению продолжительности стационарного лечения больных.
Реализация и внедрение результатов исследования
Основные положения и результаты исследования используются в практической работе инфекционных отделений, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области». В результате проведенного исследования разработан и внедрен в практику работы отделений инфекционного корпуса №№ 1,4 городской клинической больницы № 8, городского центра нейроинфекций г. Челябинска способ патогенетической терапии клещевых нейроинфекций, подтвержденный патентом на изобретение РФ, и способ этиологической диагностики иксодовых клещевых боррелиозов методом ПЦР.
Структуры нуклеотидных последовательностей фрагмента гена белка оболочки ВКЭ (ген Е) депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank: 1) TBEV Cheliabinsk GU 143821, 2) TBEV Cheliabinsk GU 143822,3) TBEV Cheliabinsk GU 143820 под № 1281338, № 1281349, № 1281351.
Для осуществления практической деятельности с учетом результатов исследования разработаны методические рекомендации для врачей «Иксодовые клещевые боррелиозы: моно- и микст-инфекция (клиника, диагностика, лечение, профилактика)», 2008г.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ЧелГМА.
Апробация и публикация материалов диссертации
Основные положения и результаты работы были представлены на втором Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004 г.), Всероссийском конгрессе по иммунологии и аллергологии (г. Уфа, 2005 г.), научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Новосибирск, 2005 г.); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней военно-медицинской академии им. СМ. Кирова (Санкт-Петербург, 2006 г.), областных научно-практических конференциях врачей-инфекционистов и эпидемиологов (г. Челябинск, 2006, 2008, 2011 гг.), Юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике», посвященной 70-летию кафедры инфекционных болезней (Уфа, 2007 г.), 7-ом Всероссийском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (г. Н. Новгород, 2006 г.), Российской научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения СП. Боткина (Санкт-Петербург, 2007 г.), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней: традиционные и психосоматические подходы» (г. Челябинск, 2007 г.), Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: современные проблемы диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2008 г.), научно-практической конференции «Инфекции в практике клинициста: антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах» (г. Харьков, 2008 г.), 1 Ежегодном Российском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009 г.), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (г. Томск, 2009 г.), межрегиональной научно-практической
конференции «Полипатии в семейной и клинической медицине» (г. Челябинск,
-
г.), 7 итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (г. Челябинск, 2009 г.), Второй Национальной конференции с международным участием «Нейроинфек-ции. Современные аспекты клещевых нейроинфекций» (г. Екатеринбург,
-
г.), научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (г. Иркутск, 2010 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцино-логия 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010 г.), научно-практической конференции «Нейроинфекций в практике клинициста. Проблемы диагностики и лечения» (г. Харьков, 2011 г.), 4 Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012 г.).
По материалам диссертации опубликована 41 печатная работа, в том числе 18 статей в журналах, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ и 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертационной работы