Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы. актуальные проблемы эпидемиологического надзора и профилактики чумы 19
1.1 Распространение и заболеваемость в мире 19
1.2 Состояние изученности факторов природной очаговости 24
1.3 Основные направления борьбы и профилактики, нерешенные вопросы антропогенного воздействия на трансмиссивную передачу чумного микроба "Ч
1.4 Проблемы эпидемиологического надзора в связи с ан тропогенно детерминированным изменением активно сти предикторов эпидемиологических осложнений . 38
2 Собственные исследования 44
2.1 Материалы и методы 44
2.1.1 Использованные штаммы микроорганизмов 44
2.1.2 Микробиологические методы исследования 44
2.1.3 Молекулярно-биологические методы исследования . 47
2.1.4 Биологические методы исследования 48
2.1.5 Гистоморфологические методы 51
2.1.6 Методы эпидемиологического анализа 52
2.1.7 Статистические методы 53
2.2 Эпидемиологическая характеристика вспышки чумы в индии в 1994 г 55
2.2.1 Ландшафтно-эпизоотологические особенности природных очагов чумы в Индии 55
2.2.2 Генез и эпидемиологические особенности вспышки чумы в округе Бид (штате Махараштра) в 1994 г 66
2.2.3 Генез и эпидемиологические особенности вспышки чумы в г. Сурате и других местностях Индии 75
2.2.4 Организация и проведение противоэпидемических мероприятий в Индии в связи со вспышкой чумы 89
2.3 Биологические особенности штаммов чумного микроба, выделенных в период эпидемических осложнений в индии в 1994 г 103
2.4 Вспышка чумы в индии в 1994 г. - модель "возвращающейся" инфекции (проблемы надзора) 113
2.5 Эффективность передачи возбудителя чумы блохами x. Cheopis под влиянием некоторых антропогенных факторов в условиях эксперимента 138
2.5.1 Рост чумного микроба в жидких и на плотных питательных средах, содержащих инсектициды 138
2.5.2 Некоторые биологические свойства чумного микроба после выращивания его на агаре Хоттингера, содержащем риапан 143
2.5.3 Децис и риапан как регуляторы трансмиссивного механизма передачи возбудителя чумы в эксперименте 147
2.5.4 Влияние тетрациклина и бициллина-5 на инфекционный потенциал зараженных чумным микробом блох 157
2.5.5 Гистоморфологические особенности размножения чумного микроба в блохах, подвергавшихся влиянию дециса, риапана, тетрациклина и бициллина-5 166
2.6 Изучение активности трансмиссивной передачи возбудителя чумы в условиях питания блох на разных видах лабора торных животных 178
2.6.1 Эффективность передачи чумной инфекции блохами C.t.sungaris, зараженными штаммами Y. pestis из Центрально-Кавказского природного очага чумы, лабораторным животным 180
2.6.2 Гистоморфологические особенности переваривания крови у C.t.sungaris, инфицированных возбудителем чумы, выделенным в Центрально-Кавказском природном очаге 188
2.7 Совершенствование методов обнаружения чумного микроба в блохах 193
2.7.1 Экспериментальное обоснование использования модифицированной биологической модели для выделения чумного микроба от блох 193
2.7.2 Применение полимеразнои цепной реакции самостоятельно и в сочетании с магноиммуносорбентами в исследовании блох на чуму 196
Заключение 207
Выводы 219
Список литературы 222
- Состояние изученности факторов природной очаговости
- Биологические особенности штаммов чумного микроба, выделенных в период эпидемических осложнений в индии в 1994 г
- Изучение активности трансмиссивной передачи возбудителя чумы в условиях питания блох на разных видах лабора торных животных
- Совершенствование методов обнаружения чумного микроба в блохах
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее десятилетие во многих странах мира среди первоочередных проблем здравоохранения рассматриваются вопросы кризисного положения контроля над инфекционной заболеваемостью. Становится все более очевидным, что успехи в области профилактики и лечения многих нозологических форм, достигнутые в середине XX столетия, позволили в течение ограниченного периода времени (исчисляемого десятилетиями) удерживать инфекционную заболеваемость на стабильно невысоком уровне (по крайней мере в странах с развитыми экономикой и социальной инфраструктурой), однако, эти достижения не обеспечили гарантии не только ликвидации целого спектра инфекционной патологии (в частности, давно известных человечеству природно-очаговых заболеваний), но и оказались малоэффективными при возникновении вспышек, вызванных новыми возбудителями бактериальных и вирусных инфекций
Проблема усугубляется недостаточным финансированием служб здравоохранения в ряде стран с традиционно высокой долей инфекционной патологии в структуре заболеваемости; ростом числа густонаселенных регионов мира с низким уровнем санитарии. Со второй половины XX века резко возросли миграционные про-дессы, что угрожает распространением заразных болезней (в том числе и чумы) из эндемичных регионов в новые районы мира. Все это происходит на фоне постоянного сокращения арсенала лекарственных средств для их лечения в связи с появлением устойчивости возбудителей (чумного микроба, в частности) к антимикробным препаратам, распространением резистентности эпидемиологически значимых видов фауны к инсектицидами родентицидам.
Возврат некоторых инфекционных болезней стимулировал интерес клиницистов, эпидемиологов к изучению исторических аспектов частной эпидемиологии. Моделью этих исследований может являться чума, оказавшая большое влияние в про-илом на демографию в связи с высокими контагиозностью и смертностью, сходными с аковыми при наиболее опасных вирусных инфекциях.
Вместе с тем, как показали события в Индии в 1994 г., чума представляет реальную опасность для мирового сообщества и в современный период времени. Вопреки имевшейся прежде уверенности о достаточно эффективном контроле за чумой в ее природных очагах, эпидемические осложнения в Индии и в ряде других стран в конце XX - начале XXI веков выявили проблемы, требующие серьезного внимания служб здравоохранения на национальном и международном уровнях. Сложившаяся обстановка диктует необходимость изучения современного состояния природных очагов чумы, разработки и внедрения в практику эффективных и ускоренных методов обнаружения чумного микроба при угрозе эпидемических ослоАнений, анализа особенностей эпидемических проявлений чумы в мире в современных условиях.
Цель исследования. Изучение современного состояния биологических и социальных факторов, определяющих эпидемичность зооантропонозной чумы; оценка содержания эпизоотолого-эпидемиологического надзора на территории ее природных очапв (на примере вспышки ч)мы в Индии и 1994 г.), усовершенствование методов обнаружения чумного микроба при угрозе эпидемических осложнений.
Задачи исследования:
mm»
1. Изучить генез и эпидемиологические особенности B№UWPtiUМЫ Л]1
199 г I БИБЛИОТЕКА
СПстсрДдо ОЭ ТОО,
Охарактеризовать биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных от людей в Индии в 1994 г
Рассмотреть проблемы эпизоотолого-эпидемиологического надзора за чумой, определить его важнейшие структурные элементы на основании опыта ликвидации Индией вспышки чумы
Проанализировать эффективность основных противоэпидемических мероприятий (в том числе антибактериальной терапии, поселковой дезинсекции), проведенных в Индии в период ликвидации эпидемических осложнений по чуме
Провести экспериментальные исследования инфекционного потенциала блох, подвергавшихся действию инсектицидов
Изучить трансмиссивную передачу чумного микроба под влиянием антибиотиков в эксперименте
Выяснить особенности векторной активности блох в условиях питания на разных видах лабораторных животных
Определить диагностическую ценность анализа блох на чуму методом ПЦР в полевых условиях и возможности его оптимизации, усовершенствовать метод биологического исследования зараженных чумным микробом блох в эксперименте
Научная новизна и теоретическая значимость. При изучении эвотюции и потенциала современной чумы впервые на модели исследования эпидемиологических и микробиологических ее аспектов в Индии установлена исторически выраженная трансформация эпидемиологического типа заболеваемости - анадемического в анаде-мо-эпидемический В упомянутой стране на котор>ю в XX столетии приходилось около 13 млн больных из 14 млн, зарегистрированных в мире, анадемический тип был характерным для первой половины указанного исторического периода. Он проявлялся в высоком уровне заболеваемости, в основном, бубонно-септической формой чумы при крайне незначительном антропонозном ее распространении из-за отсутствия блох человеческого жилья Pulex irritans и низкой эффективности воздушно-капельного механизма передачи инфекции в период максимального подъема эпизоотической активности в популяции синантропных крыс, этот период совпадал с сезоном высокой влажности окружающей среды, не оптимальной для образования заражающих аэрозолей
Возникновение вспышек легочной чумы в Индии в 1994 г, обусловивших массовую внутригосударственную миграцию населения, поражение легочной чумой крупных городов с международными транспортными связями, а также регистрация в стране группы случаев легочной чумы в начале XXI века, свидетельствуют о трансформации анадемического типа заболеваемости в анадемо-эпидемичесьий, то есть об исторически выраженной изменчивости эпидемического процесса и эволюции чумы
На основании комплексного эпизоотологического и эпидемиологического анализа проявлений чумы в Индии в 1994 г охарактеризован ее современньй потенциал, обусловленный как трансформацией эпидемиологического типа заболеваемости, так и сокращением программ эпидемиологического надзора, широким применением антибактериальных препаратов, инсектицидов, антропогенным воздействием на окружающую среду и особенностями состояния и взаимодействия сочленов паэазитарной системы, которые исследованы экспериментально с использованием современных технологий
Потенциальная возможность выхода современной чумы из-под контроля в природных и "крысиных" очагах охарактеризована на модели чумы в Индии также
интегрированным влиянием на интенсивность эпидемического процесса чрезвычайных природно-климатических, биологических и социальных факторов. Обоснована вероятность и оценены параметры наиболее взрывного и трудно контролируемого в современных условиях характера эпидемических событий на национальном уровне, создающего реальную угрозу международного распространения болезни.
Впервые описан генез и охарактеризованы основные тенденции в эпидемиче-' ских проявлениях чумы в Индии, выразившиеся в начале в высокой пораженности бубонной чумой населенных пунктов и населения в штате Махараштра (одновременно 15 деревень округа Вид, до 10% пораженного населения в деревне Мамла). Впервые в истории эпидемий чумы зарегистрирована множественная устойчивость блох к инсектицидам (ДЦТ, дилдрину, малатиону, фентиону).
Возникновение самой крупной вспышки легочной чумы в г. Сурат и высокая летальность среди больных были обусловлены несвоевременными клинической и бактериологической диагностикой и связанной с этим монотерапией пенициллином первых случаев заболевания. Впервые изучены биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных от больных в г. Сурат. Установлено, что они относятся к основному подвиду Yersinia pestis subsp. pestis (в соответствии с международным кодексом номенклатуры бактерий) или Yersinia pestis variant orientalis [no классификации Devignat R., 1951]. Впервые штаммы, выделенные в Индии, охарактеризованы по категориям VNTR. Установлены их принадлежность к одной категории и отличие штаммов, полученных в 1994 г., от штаммов, выделенных в 40-е годы.
По результатам оценки эффективности противоэпидемических мероприятий обосновывается предположение о том, что вспышку чумы в Индии в 1994 г. удалось ликвидировать благодаря проведению беспрецедентных по масштабам дезинсекционных мероприятий (израсходовано 2360 т инсектицидов) и высочайшему уровню охвата населения, подверженного риску заражения чумой, экстренной профилактикой тетрациклином (применено около 37 млн капсул препарата).
С учетом особенностей эпидемической ситуации по чуме в Индии в 1994 г., большого количества случаев легкого течения бубонной чумы, масштабов и направленности противоэпидемических мероприятий, резистентности блох к инсектицидам впервые изучено в эксперименте влияние инсектицидов пиретроидного ряда на чумной микроб в питательных средах и блохах Xenopsylla cheopis. Установлено снижение инфекционного потенциала блох вследствие уменьшения их численности и гибели Y. pestis в кишечном тракте зараженных особей под действием дециса и угнетения бактериального роста и способности чумного микроба приживаться в организме переносчика под влиянием риапана.
Впервые также проведено экспериментальное изучение системного действия широко применяемых в клинической практике антибиотиков на векторную функцию эффективных переносчиков и взаимоотношение чумного микроба и блох. Впервые обнаружено противоположное действие антибиотиков тетрациклина и бициллина-5 на возбудитель чумы в блохах: тетрациклин оказывал угнетающее действие на векторный потенциал переносчиков, а бициллин-5 способствовал его росту. Предположительным объяснением этому может служить подавление жизнеспособности микробной флоры бициллином-5 в кишечном тракте блох, обладающей антагонистическими свойствами в отношении ) pestis.
В результате изучения активности передачи возбудителя чумы блохами при смене прокормителя впервые в экспериментальных условиях вьшвлено повышение
эффективности естественной трансмиссивной передачи чумного микроба из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы блохами Citellophilus tesquorum sun-garis (при попеременном их питании на разных видах лабораторных животных).
Впервые показана высокая информативность ПЦР-анализа при исследовании полевого материала на чуму - блох С. tesquorum, добытых в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы. Установлена высокая эффективность применения магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб (зараженных чумой блох) для ПЦР-анализа, заключающаяся в сокращении времени исследования. Эти методические приемы позволяют усовершенствовать эпидемиологический надзор за чумой в ее природных очагах, что особенно важно в плане ускорения получения эпизоотологиче-ской информации при реальной угрозе эпидемических осложнений.
Предложен метод модифицированной биологической пробы для обнаружения чумного микроба в блохах при низком значении их инфицированности. Этот метод предусматривает введение в суспензию блох, приготовленную для заражения биопробного животного в паравертебральную область, ингибиторов сопутствующей микрофлоры, желтка куриного яйца и гепарина. Исследование материала из места введения суспензии позволит уже через 24 часа обнаружить чумной микроб.
На способы изучения взаимоотношения чумного микроба и блохи, обнаружения чумного микроба в блохах, объектах внешней среды получены патенты на изобретения, а также положительное решение о выдаче патента на изобретение.
1. Способ моделирования блокообразования чумного микроба// Патент на изобретение № 20)7813 от 18.05.92 г.
Патент на изобретение. №2133274. Способ выделения возбудителя чумы от эктопаразитов, например блох. Заявка на изобретение №98112323, приоритет от 22.06.98 г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации, г. Москва, 20 июля 1999 г.
Способ обнаружения эпидзначимости чумного микроба в блохах// Патент на изобретение. № 2160781 от 20.12.2000 г.
Способ ускоренного обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды // Патент на изобретение. № 2149407 от 20.05.2000 г.
Способ определения действия яда на блокообразующую способность блох при чуме // Решение ВНИИГПЭ 20.01.95 г., о выдаче патента №443 по заявке №505908/13(039159).
Практическая значимость. Результаты исследований нашли отражение в ниже перечисленных документах для использования в научно-исследовательской работе и в практическом здравоохранении:
Методических указаниях МУ 3.1. 1027-01 "Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций", одобренных межведомственным научным советом по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации 7 октября 1999 г., утвержденных Первым заместителем Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 06.04.2001 г.
Методических указаниях МУ 3.1. 1092-02 "Организация и проведение эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации", рекомендованных к утверждению комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России и утвержденных Пер-
вым заместителем Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онишенко 15.01.2002 г.
, - Методических рекомендациях "Применение магноиммуносорбентов в методах экспресс-диагностики чумы", которые одобрены Ученым Советом СтавНИПЧИ от 22.09.1999 г. и утверждены директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и директором Всекитайского лечебно-профилактического Центра чумы и бруцеллеза.
- Методических рекомендациях по оценке эпидемиологического значения
штаммов чумного микроба, выделенных от блох, одобренных решением Ученого Со
вета СтавНИПЧИ от 25.05.2000 г.
Методических рекомендациях по изучению блокообразования у олиго- и мо-ноксенных видов блох (на примере С. /. sungaris), одобренных, решением Ученого Совета СтавНИПЧИ 25.05.2000 г.
Ежеквартальных информативных сообщениях "Сведения о заболеваемости опасными инфекциями в мире", направлявшихся институтом в подведомственные, противочумные станции и Центры Госсанэпиднадзора региона Кавказа в период с 1993 по 1997 г.г.
Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе по эпидемиологии, микробиологии и профилактике чумы для слушателей функционирующих при Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте курсов первичной специализации по особо опасным инфекциям работников противочумной службы страны и курсов повышения квалификации работников центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора, в обучении и подготовке аспирантов из Китая Сюй Чен и Сун Джи Джоу, аспирантки из Монгольской Республики Цэренноров Д., стипендиата ВОЗ доктора Дари Тзед Айуш.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Интегрированное действие природно-климатических, биологических и социальных факторов на территории природных очагов чумы обусловило вспышку бубонной и легочной клинических форм заболеваний у людей в Индии. Эпидемиологический фон создавала инфекционная патология, требующая проведения дифференциальной диагностики с чумой.
Эпидемиологические особенности бубонной формы чумы в Индии в 1994 г. определялись трансмиссивным заражением людей блохами, устойчивыми к инсектицидам (ДДТ, дилдрину малатиону, фентиону); вовлечением в эпизоотический процесс синантропньж грызунов и домашних собак вследствие эксплозивного характера его развития. Результирующим моментом явилась более высокая степень пораженно-сти бубонной формой чумы населенньж пунктов, домов в населенных пунктах в современный период времени по сравнению со второй половиной XX столетия.
Основной причиной усугубления эпидемической обстановки по чуме в г. Сурате в 1994 г. следует признать изменение характера эпидемических проявлений, выразившихся в антропонозном распространении инфекции в результате реализации воздушно-капельного механизма передачи возбудителя.
Эпидемические осложнения по чуме в Индии в 1994 г. были вызваны штаммами Y. pestis, относящимися к основному подвиду, но имеющими отличия по VNTR - профилю от шгаммов, выделенных от людей в Индии в 40-е годы.
Ослабление эпидемиологического надзора за чумой в ее природных очагах, определяет обострение эпидемиологической ситуации в эндемичных регионах мира и
угрозу возврата эпидемий современной чумы вследствие высокой активности миграции населения, реальной опасности трансмиссии полирезистентных к антимикробным препаратам штаммов чумного микроба устойчивыми к инсектицидам переносчиками.
В период ликвидации вспышки чумы в штате Махараштра установлена высокая пулецидная активность препаратов пиретроидного ряда. Экспериментальными исследованиями показано угнетение инфекционного потенциала зараженных возбудителем чумы X. cheopis при системном действии дециса и риапана (препаратов пиретроидного ряда) вследствие снижения содержания чумного микроба в блохе и ограничения его передачи трансмиссивным путем.
Ориентация противоэпидемических мероприятий на широкое применение препаратов пенициллинового ряда без бактериологической верификации диагноза у больных привела к резкому обострению эпидемической обстановки по чуме в г. Сурате. Экспериментальные исследования, проведенные на лабораторньж животных, дают основание прогнозировать интенсификацию трансмиссивной передачи возбудителя чумы при системном действии бициллина-5 на зараженных X. cheopis.
При ликвидации вспышки легочной формы чумы в г. Сурате главенствующее значение имело применение тетрациклина для этиотропной терапии и профилактики заболеваний Экспериментальными исследованиями установлено угнетение инфекционного потенциала блох после питания на получавших тетрациклин белых мышах.
Применение ПЦР-анализа при исследовании полевого материала (блох) на чуму обеспечивает раннее обнаружение чумного микроба и является оптимальным при угрозе эпидемических осложнений.
Использование модифицированной биомодели при анализе блох на чуму обеспечивает выявление Y. pestis в блохах при низком индексе встречаемости зараженных эктопаразитов и показателях их инфицирования.
Личный вклад автора. Все основные разделы представленной работы выполнены при личном участии автора.
Апробация работы и публикации. Изложенные в работе материалы (в виде докладов и стендовых сообщений) представлены и обсуждены на: Всесоюзном совещании "Дезинфекция, дезинсекция и стерилизация" (Ленинград, 1992 г.); Международной конференции энтомологов, паразитологов, эпизоотологов (Ставрополь, 1994 г.. Алматы, 1999 г.); Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); Международной конференции по новым и вновь проявляющимся болезням и рабочем совещании по надзору и диагностике чумы, организованными Центром по борьбе с заразными болезнями (Атланта, США) и Всемирной организацией Здравоохранения (Атланта, США, 1998 г.); Научно-практической конференции, посвященной 100-летию противочумной службы России (Ставрополь, 1998 г.); Региональном совещании по профилактике карантинных и других особо опасных инфекций, рабочем совещании ЦГСЭН по вопросам санитарной охраны территории Кавказа (Ставрополь, 1998 г.); Первой Всероссийской научно-практической конференции по генной диагностике особо опасных инфекций (Саратов, 2000 г.); Совещании "Противоэпидемическое обеспечение населения в условиях чрезвычайных ситуаций в Северо-Кавказском регионе" (Ставрополь, 2000 г.); Международной научно - практической конференции, посвященной 10-летию независимости Республики Казахстан (Талдыкорган, 2001г.). Исследования
проводились в рамках пяти плановых научных тем (№№ ГР 01860004637; 01910047310; 01960001801; 01200109088; 01200109081), выполненных при непосредственном участии соискателя в качестве ответственного исполнителя.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 65 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 267 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, шести разделов собственных исследований, заключения и выводов, иллюстрирована 30 рисунками и 12 таблицами. Библиография представлена 430 литературными источниками.
Состояние изученности факторов природной очаговости
Спорадическая заболеваемость, а также вспышки чумы в разных странах в последние десятилетия свидетельствуют о зависимости эпидемического процесса от эпизоотической обстановки в ее природных очагах, отражая активность эпизоотологических факторов и их роль в механизме заражения человека [Топорков В.П. с соавт., 1989; Кокушкин A.M. с соавт., 1994; Куклев Е.В., 1997; Добрица В.П., Аубакиров С.А., Куница Т.Н., 1998; Инокентьева Т.И., Балахонов СВ., 1998; Волосивец СИ., 1999; Топорков В.П., Подсвиров А.В., Яшкулов К.Б., 1999; Akiev А.К., 1982; Hiroshi N., 1995; Martinez L.J. et all., 1995; Plag. mann., 1999]. Описаны очаги "дикой" чумы на территории ряда зарубежных стран [Ралль Ю.М., 1958, 1965; Жовтый И.Ф., Емельянова Н.Д., 1959; Федоров В.Н., Козакевич В.П. 1959; Козакевич В.П., Варшавский С.Н., Лавровский А.А., 1970; 1971; 1972; 1973; Акиев А.К., 1982; Акиев А.К., Варшавский С.Н., Козакевич В.П., 1983; Величко Л.Н., Иванов В.А., Хотько Н.И., 1983; Козлов М.П., Султанов Г.В., 1993; Kerandel J., 1915; Wu Lien The et all., 1936; Pollitzer R., 1954; Devignat R., 1958; Baltazard M., Bahmanyar M., 1960; Bahmanyar M., 1968; Cavanaugh D.C., Ryan P.F., Marshall J.D., 1969; Kartman L., 1970; Alonso J.M., 1973; Beson S.A., 1979; et all.].
Наиболее детально вопросы природной очаговости чумы, равно как и описание исторических периодов и причин обострения эпидемиологической обстановки, рассматриваются в исследованиях, посвященных проблемам эпидемиологического надзора в России и странах СНГ [Заболотний Д.К., 1899; Айзин Б.М., Белобородова З.С., 1961; Корнеев Г.А., 1968; Акиев А.К., 1970; Наумов Н.П., с соавт., 1972; Акиев А.К., Варшавский С.Н., Голубев П.Д. 1974; Топорков В.П. с соавт, 1978; 1989; Голубинский Е.П. с соавт., 1982; 1999; Солдаткин И.С, Руденчик В.Ю., 1988; Бурделов А.А., Степанов В.М., Агеев B.C., 1989; Малхазова СМ., Тикунов B.C., 1989; Покровский В.И. с соавт, 1989; Воронова Г.А. с соавт., 1990; Солдаткин И.С. с соавт., 1994; Подсвир ь А.В., 1996; Иннокентьева Т.И., 1997; 2001; Куклев Е.В. с соавт., 1997; Куница Т.Н., 1997; Михайлов Е.П., с соавт., 1997; Топорков В.П., Подсвиров А.В., Яшкулов К.Б., 1999; Бурделов Л.А. с соавт., 2001; Корнаухов И.Г. с соавт., 2001; Куклев Е.В., Кокушкин A.M., Кутырев В.В., 2001; и др.]. Так, многочисленными опытами и полевыми наблюдениями по изучению характера эпизоотического процесса в разных природных очагах чумы показана зависимость его динамики от географического положения региона, ландшафтно-экологических особенностей, видового состава фоновых видов грызунов и их блох, активности паразитарного контакта носителей и переносчиков [Миронов Н.П. 1959; Жовтый И.Ф., 1966; Куницкий В.Н., Гаузштейн Д.М., Куницкая Н.Т. 1967в; Куницкий В.Н., Гаузштейн Д.М 1968; Петров B.C., 1968; Лавровский А.А., 1969; Лавровский А.А., Варшавский С.Н., 1970; Петров П.А., 1972; Бибикова В.А., Осадчая Л.М., Хрусцелевская Н.М., 1963; Воронова Г.А., 1978; Топорков В.П., 1978; Амплеева Э.А., Сорокина В.В., 1979; Пунский Е.Е. с соавт., 1979; Машковский И.К., Деревщиков А.Г., 1980; Сулейменов Б.М., Атчабаров
Б.Б., 1992; Вержуцкий Д.Б., Попков А.Ф., Инокентьева Г.И., 1994; Кокушкин A.M. с соавт., 1994; Никитин Л.Я. с соавт., 1995; Базанова Л.П., Маевский М.П., 1996; Аубакиров С.А., Сержанов О.С., 1997; Вершинин Е.А., 1997; Вержуцкий Д.Б., 1999; Иннокентьева Т.И., с соавт. 1999; и др.]; популяционной чувствительности грызунов к чуме и их восприимчивости к возбудителю в связи с возрастом, физиологическим состоянием [Кучерук В.В., 1960; 1965; Дятлов А.И., 1989; Варшавский С.Н., Щепотьев Н.В., Конева З.А., 1982; Ларионов Г.М., Погасий Н.И., 1989; Атшабар Б.Б., 1999; и др.]; полиморфности биологических свойств штаммов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах, вариабельности некоторых экологических признаков возбудителя на разных фазах эпизоотии, обусловленных изменчивостью его фено- и генотипа [Шварц Е.А., Шиля-ев Л.Ф., 1963; Кочкарева Л.В., Кочетова А.Х., Левина Л.А., 1972; Анисимов П.И., 1978; Ларионов Г.М., 1972; Гражданов А.К., 1980; Маевский М.П. с соавт., 1994; Цой Д.Г., Меняйкин А.К., 1994; Величко Л.Н., Кокушкин A.M. с соавт., 1998; Иннокентьева Т.И., 1997; Кокушкин A.M., 1997; Сагимбеков У.А., 1997; Анисимов П.И., Попов Ю.А., 1997, 1999; Анисимов А.П., 1999; 2002; Горшков О.В. с соавт. 2000; и др.]. Анализ многолетней динамики активности и современное состояние эпизоотологических факторов, обусловливающих риск заражения человека чумой, по-прежнему являются актуальными направлениями исследований [Дубянский М.А., 1984; Арутюнов Ю.И. с соавт., 1988; 2000; Бурделов Л.А. с соавт., 1989; Кокушкин A.M. с соавт. 1994; 1998; Кокуи-кин A.M., 1995; Кузнецов А.А. с соавт., 1997; 1999; Сунцов В.В., Ли Тхи By Хыонг, Сунцова Н.И., 1992; Голубинский Е.П., 1997; Величко Л.Н. с соавт., 1999; Ви-лосивец СИ., Косовцев В.А., 1999; Топорков В.П., Подсвиров А.В., Яшкулов К.Б., 1999; Сунцов В.В., 2001].
Биологические особенности штаммов чумного микроба, выделенных в период эпидемических осложнений в индии в 1994 г
Сведения о биологических свойствах штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах Индии, а также ответственных за эпидемические осложнения по этой инфекции в прошлом, в доступной литературе представлены крайне ограниченно. Тем не менее, имеются основания полагать, что энзоотии могут быть обусловлены разными экологическими вариантами возбудителя чумы. Исследованиями Канатова Ю.В., Мартиневского И.Л. [1994 г.] выявлены различия у 4 выделенных в прежние годы изученных индийских штаммов Y. pestis по ферментации глицерина, денитрификации, один штамм проявлял ауксотрофность по гуанину. Два из четырех изученных штаммов чумного микроба оказались высоко вирулентными для белых мышей и морских свинок, о вирулентности двух других для лабораторных животных судить было трудно вследствие длительного их хранения и регулярных пересевов; чувствительность всех изученных штаммов к антибиотикам оказалась высокой.
Нами были изучены свойства пяти штаммов чумного микроба, в числе которых три штамма (4, 8, 9) выделены от больных в октябре 1994 г. в г. Сурате, а два штамма (776, 777) - в 1931 г. (776 - адрес выделения неизвестен, 777 выделен в г. Хайдарабаде). Штаммы 4, 8, 9 были любезно представлены индийской стороной директору сотрудничающего с ВОЗ справочного и научно-исследовательского центра по чуме при СтавНИПЧИ - Г.М. Грижебовскому во время его работы консультантом в Индии в связи с вспышкой чумы.
Установлено, что культурально-морфологические свойства всех штаммов были типичными для возбудителя чумы. На агаровых пластинах они вырастали в типичной R-форме: колонии с темным зернистым центром и светлой кружевной периферией. Бульон оставался прозрачным с хлопьевидным осадком на дне. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживали мелкие грамотрицатель-ные полиморфные палочки и коккобактерии. В мазках из штамма 777 отмечена более крупная полиморфная палочка, расположенная цепочками.
Все индийские штаммы лизировались чумным поливалентным бактериофагом до титра и проявляли чувствительность к цельному чумному монофагу Л-413.
Штаммы 4, 8, 9 на первые - вторые сутки ферментировали с образованием кислоты без газа арабинозу, мальтозу, глюкозу, маннит, маннозу, не разлагали глицерин, рамнозу, сахарозу, дульцит и сорбит. Однако штамм 776 ферментировал лактозу на 13 сутки, а штамм 777 - рамнозу на 18 сутки, по остальным вышеперечисленным биохимическим тестам эти штаммы не проявили каких-либо особенностей. Все культуры были неподвижны в 0,25 % полужидком агаре. Штаммы 4, 8, 9, 776 давали положительные реакции нитрификации и денит-рификации. Штамм 777 не обладал нитрифицирующей и денитрифицирующей способностью. Ни один из изученных штаммов не ферментировал мочевину.
На среде Джексона-Берроуза и модифицированной среде с гемином только штамм 777 дал рост белых колоний, остальные культуры, полученные из Индии, формировали крупные колонии с темным центром и более светлым неровным краем.
На среде Хигучи-Смита штамм 777 не проявлял кальций-зависимости при 37 С, другие индийские штаммы давали рост от 6,8 % до 24,5 % кальций-зависимых вирулентных клеток. Примечательно, что пассирование штамма 4 через организм белых мышей привело к увеличению в популяции чумных бактерий клеток, зависимых от ионов кальция при 37 С, до 90 %.
Наибольшее количество фракции I синтезировал чумной микроб штамма В штаммах 8, 9, 777 фракция I обнаружена при количестве микробных клеток 1 -106 (РПГА, РНАТ) и ЗЛО5 (ИФА). Вместе с тем, чумные бактерии штамма 776 оказались лишенными фракции I, отсутствие которой было показано всеми серологическими тестами.
Все индийские штаммы проявили высокую чувствительность не только к тетрациклину, левомицетину, гентамицину, стрептомицину, но и к ампициллину и карбенициллину, были менее чувствительными к неомицину и рифампи-цину, резистентными к эритромицину, мономицину, фузидину.
Таким образом, все изученные штаммы чумного микроба, выделенные в Индии в 1994 и 1931 гг., лизировались чумными фагами в диагностических титрах, проявляли типичные культурально-морфологические и ферментативные свойства, обнаруживали в разной степени зависимость роста от ионов кальция при 37 С (за исключением 777 штамма), проявляли слабую способность к пигментсорбции на среде с гемином, синтезировали (за исключением 776 штамма) фракцию I, проявляли чувствительность к антибиотикам, специфичным в отношении грамотрицательных бактерий.
Вирулентность штаммов чумного микроба 4, 8, 9 изучали на белых мышах и морских свинках методом подкожного заражения животных дозами 10 , 10 , 10, 10J м.к. Погибших и убитых на 21 день зверьков подвергали бактериологическому исследованию на чуму.
В результате проведенных исследований установлено, что на 16 сутки пала белая мышь, зараженная дозой 106 м.к. штамма, из всех органов животного посевом на агаровые пластины был выделен чумной микроб. Все морские свинки и оставшиеся живыми белые мыши были забиты на 21 сутки после заражения, однако в посевах органов этих животных на пластинах агара Хоттингера роста чумного микроба не было.
Субкультурой штамма Y. pestis 4, выделенной от белой мыши, были заражены животные этого вида внутрибрюшинным введением от 100 до 400 млн м.к. чумного микроба. Через 48 часов у мыши, инфицированной бактериями чумы в дозе 400 млн м.к., в мазках крови из кончика хвоста обнаружили 60-80 биполяров в каждом поле зрения. На этого зверька выпустили 125 блох X cheopis. Штаммами Y. pestis 8 и 9 инфицировали блох (по 116 особей) на аппа-рате-кормилке в связи с тем, что внутрибрюшинным введением 400 млн м.к. этих штаммов белым мышам не удалось получить бактериемию достаточной степени интенсивности для заражения X. cheopis. Инфицированность блох всех групп составила 90 %. Подкормки эктопаразитов проводили на здоровых белых мышах каждые три дня. После подкормки X. cheopis просматривали под микроскопом для отбора блокированных особей, которых на следующие сутки подвергали принудительному кормлению в стеклянной трубке на брюшке белой мыши для определения стойкости блока и инфекциозности укуса.
Первые блокированные X. cheopis появились на четвертой подкормке (10 - 11 сутки) после заражения: среди блох, инфицированным штаммом 4 - четыре; штаммом 8 - одна; штаммом 9 - две. На 18 сутки (после шестой подкормки) обнаружены по одной блохе с непроходимостью преджелудка в группах эктопаразитов, инфицированных штаммами чумных микробов 8 и 9, и четыре особи в группе блох, зараженных штаммом 4. Через 25 дней (после восьмой подкормки) по одной особи с блоком преджелудка выявлены среди блох, инфицированных штаммами 8 и 9. Продолжительность наблюдений составляла 32 дчя. У части блох при кормлении на брюшке белой мыши блок размывался. Передача возбудителя чумы белым мышам произошла в двух случаях блокированными блохами, зараженными штаммом 4, и в двух случаях - штаммом 9, от павших на 4 - 8 сутки животных посевом на агаровые пластины выделен чумной мигроб.
Изучение активности трансмиссивной передачи возбудителя чумы в условиях питания блох на разных видах лабора торных животных
В природных очагах чумы нередко выделяют штаммы чумного микроба с ослабленной вирулентностью, и эпизоотологическое значение этого феномена остается предметом дискуссий. Вместе с тем, имеются убедительные доказательства того, что циркуляция таких штаммов в чумном биоценозе вполне возможна [Пейсахис Н.И. с соавт., 1989, Воронова Г.И., Жиров А.Я., Дружинин М.М., 1994; Cavanaugh C.J et all., 1956; и др.]. Однако очевидно, что успешность инокулятивной передачи возбудителя чумы с последующим многократным повторением этого феномена зависит от видовых и индивидуальных особенностей всех партнеров в паразитарной системе. Известно, что на уровне видов и штаммов возбудителей трансмиссивных инфекций наблюдается высокая специфичность даже в отношении близких видов переносчиков, а характерной чертой последних является в разной степени выраженная специфичность по отношению к хозяину, что воспринимается как результат адаптации всех членов паразитоценоза к конкретным условиям среды [Догель В.А., 1962; Бибикова В.А., Классовский Л.Н., 1974, Ващенок B.C., 1988, Алексеев А.Н., 1999; Коренберг Э.И., 1981, 1983; Rossingol Р.А., Rossingol A.M., 1988; Rosicky В. Daniel M., 1989; Titus R.G., Ribeira J.M.C., 1990].
Некоторые авторы различают потенциальную и реальную векторную способность переносчиков к передаче возбудителей в природе [De Foliart, Grisad D.R., Watts D.M., 1983; Sonenshine D.E., 1994; Block U.C., Moore C.G., 1995; Блюммер А.Г., 1992; Балашов Ю.С., 1999]. При этом потенциальная способность (vector competence) является генетически детерминированной функцией определенных видов насекомых в поддержании трансмиссивного механизма циркуляции определенных видов и штаммов микроорганизмов в природных очагах паразитарных болезней. Векторный потенциал может варьировать внутри вида, среди разных географических популяций одного вида, между близкими видами переносчиков. Реальную способность (vector capasity) характеризуют как эффективность передач инфекционного агента, т.е. суммарный результат состоявшихся фактов заражения хозяина инфицированным переносчиком в конкретных условиях их взаимодействия. Характер такого взаимодействия возбудителя и переносчика, как полагают, является результатом их эволюционной коадаптации, однако, последствия его могут приводить как к обострению, так и к замедлению циркуляции возбудителя в природном очаге под давлением факторов биотической и абиотической природы.
С середины 80-х годов возрос интерес исследователей к изучению меж-популяционной и внутрипопуляционной дифференциации носителей, массовых видов переносчиков, а также возбудителей с применением методов филогенетического анализа; оценке их роли в различных механизмах (в том числе и дублирующих) поддержания эпизоотического процесса [Жовтый И.Ф., 1975; Вер-жуцкий Д.Б. с соавт., 1994; Вержуцкий Д.Б., 1999; Иннокентьева Т.И., 1997; Иннокентьева Т.И. с соавт., 1999; Наумов Р.Л., 1999; и др.].
Одним из многочисленных частных направлений поиска решений проблемы эпизоотии чумы является разработка методических приемов, позволяющих изучить феномен трансмиссии возбудителя чумы разными подвидами блох, приуроченными к отдельным участкам ареалов их распространения. В особенности это касается олиго - моноксенных видов переносчиков, существование которых в естественной среде их обитания обеспечивается за счет одного или узкого круга их хозяев [Догель В.А., 1962; Ващенок B.C., 1988].
При исследованиях в этом направлении нами были применены методические приемы заражения и подкормок олигоксенного вида блох С. tesquorum sungaris (из Монголии) на лабораторных животных двух видов (белых мышах, золотистых хомячках) для изучения их векторной активности в экспериментальных условиях. В опытах использовали свежевыделенный в Центрально-Кавказском природном очаге чумы штамм Y. pestis с целью изучения вероятности трансмиссии возбудителя чумы в условиях лимитирования этого феномена отсутствием специфичности отношений в схеме возбудитель - переносчик -хозяин.
Сусликовые блохи С. tesquorum относятся к активным переносчикам чумы (С. tesquorum cis caucasicus) и малоактивным (С. tesquorum altaicus) согласно предложенной в 1988 г. B.C. Ващенком классификации, в основу которой положены экспериментальные данные о частоте формирования блока предже-лудка у блох и передачи возбудителя чумы теплокровным животным. В некоторых природных очагах чумы эти блохи принимают активное участие в иир-куляции чумного микроба. Так, локализация участков стойкой очаговости в Тувинском природном очаге чумы привязана к ядрам популяции основного переносчика, т.е. участкам местности с максимально плотными стабильными группировками С. tesquorum altaicus, причем от этого вида блох изолировано 68 % всех штаммов, выделенных от переносчиков в очаге [Вержуцкий Д.Б., 1999; Вержуцкий Д.Б., Галацевич Н.Ф., Ковалева Н.Ф., 2001]. Базановой Л.П. с соавт. [1999] показана сезонность частоты блокирования блох С. tesquorum altaicus с ее увеличением в период активизации эпизоотии в Тувинском природном очаге. Помимо этого, на эффективность заражения сусликов укусами блох оказывала влияние чувствительность носителя к возбудителю чумы, которая также отличается сезонными колебаниями [Базанова Л.П., Маевский Н.П., 1999].
В Центрально-Кавказском природном очаге чумы, где основным переносчиком является блоха С. tesquorum cis caucasicus, количество выделенных от них штаммов Y. pestis на территории Кабардино-Балкарии составляет 39,8 %, а в Карачаево-Черкессии - 86 % от числа всех изолированных [Мезенцев В.М. с соавт., 2000].
Совершенствование методов обнаружения чумного микроба в блохах
В практике эпизоотологического обследования на чуму большое внимание уделяется бактериологическому исследованию блох. Однако известно, что эффективность методов выделения штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, в том числе и У. pestis, зависит от интенсивности течения эпизоотического процесса, т.е. от содержания микроорганизмов в исследуемом материале, качества питательных сред, наличия сопутствующей микрофлоры, которая может обладать ингибирующим действием в отношении чумного микроба, чувствительности конкретных способов и приемов лабораторного анализа на чуму [Апарин Г.П., 1975; Самойлова Л.В. с соавт., 1993; Величко Л.Н., Кокушкин A.M., 1997; Наумов А.В. с соавт., 1997; Саяпина Л.В. с соавт., 1998; и др.].
В связи с этим целью проведенных исследований явилось усовершенствование биологического метода выделения чумного микроба от блох при низких индексах встречаемости инфицированных экземпляров и показателях интенсивности заражения отдельных особей X. cheopis.
Блох X. cheopis заражали через биомембрану взвесью, содержащей 100 м.к. вирулентного штамма Y. pestis (461) в 1 мл дефибринированной крови белой мыши. Далее обездвиженных парами эфира эктопаразитов (от 1 до 5 особей в пробе) растирали стеклянными палочками в лунках стерильных полистироловых пластин, после чего в них вносили по 0,5 мл физиологического раствора хлорида натрия. Полученную суспензию смешивали с гепаринизировакной кровью кролика в соотношении 1:0,5 - 1:0,7. К этой смеси добавляли 0,5 - 0,7 мл желтка куриного яйца, а также кортизон, теллурит калия и генцианвиолет в дозах 5 - 7 мг, 0,01 - 0,03 мг и 0,001 - 0,003 мг соответственно из расчета на одно животное. Полученную суспензию по 0,5 мл вводили двум белым мышам подкожно в область спины. Для этого помощник фиксировал животное, а экспериментатор пинцетом захватывал кожу в области крестца и продвигал иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы достигал линии лопаток. Затем вводили указанное количество материала, надавливая на поршень шприца плавным движением. Оставшиеся 0,25 мл суспензии каждой пробы растертых блох высевали на 3 пластины агара Хоттингера (рН 7,2), инкубировали в течение 5 суток при 28 С для определения индекса встречаемости инфицированных блох и показателя интенсивности заражения отдельных особей X cheopis по числу проб с ростом Y. pestis и количеству колоний чумного микроба в каждой пробе, считая эти результаты контрольными. Материал из места введения суспензии подвергали исследованию бактериологическим и иммунофлуоресцентным методами. Для этого умерщвленного зверька прикрепляли к вскрывочной доске приколы-шами спиной кверху. Кожу над крестцом захватывали хирургическим пинцетом, делали поперечный надрез, который продолжали дугообразно (обходя по бокам место введения). Образовавшийся лоскут кожи откидывали на голову грызуна, место введения суспензии легко обнаруживали по яркому цвету вследствие окрашивания мягких тканей кровью. Далее материал из места введения суспензии исследовали следующим образом: - производили посев платиновой петлей на пластины агара Хоттингера с генцианвиолетом, - изготавливали мазки - отпечатки для окраски по Граму, - изготавливали мазки - отпечатки для иммунофлюоресцентной окраски.
Затем ножницами удаляли ткани из места введения суспензии, растирали их в фарфоровых ступках с 0,5 мл физиологического раствора хлорида натрия, полученную эмульсию высевали на пластины агара Хоттингера для постановки пробы с фагом и определения чувствительности к антибиотикам диско - диффузным методом. В опытах были использованы 200 экземпляров блох X. cheopis и 80 белых мышей.
В результате проведенных исследований было установлено, что в 32 - 55 % мазков (в разных сериях опытов), приготовленных через 24 часа из материала, отобранного в месте введения белым мышам суспензии блох с дополнительными (указанными выше ингредиентами), методом иммунофлуоресценции обнаруживались единичные клетки чумного микроба (от 5 до 15 м.к.) в каждом поле зрения микроскопа. Через 48 часов регистрировали специфическое свечение чумных микробов уже во всех мазках, приготовленных из биопроб, при этом в отдельных полях зрения количество бактериальных клеток превышало 70-80 м.к.
При бактериологическом исследовании этого же материала (полученного от первых животных через 24 часа после заражения) отмечали рост от 3 до 40 колоний Y. pestis на пластинках агара Хоттингера, а в материале, полученном через 48 часов (при исследовании вторых зверьков), соответственно, - от 30 до 160 колоний. В 4 - 6 % проб в разных опытах интенсивность роста оценивали как "сливной". Контаминацию посевов посторонней микрофлорой наблюдали в единичных случаях. Сроки формирования, размеры и морфология колоний чумного микроба не отличались от колоний, выраставших на пластинах агара Хоттингера в посевах суспензий из контрольных проб.
В мазках-отпечатках, приготовленных из материала из места введения смеси первым зверькам, окрашенных по Граму, обнаруживали единичные бипо-ляры (от 2 до 5), однако, не во всех полях зрения (в среднем в 20 %); через 48 часов в мазках-отпечатках, приготовленных из материала от второй группы животных, определяли в каждом поле зрения в среднем 15 м.к. Y. pestis. Чувствительность выделенных от белых мышей субкультур к фагам (чумному, псевдотуберкулезному, Л-413 С) и антибиотикам (тетрациклину, канамицину, мономицину, хлорамфениколу, стрептомицину, гентамицину) не отличалась oi исходной, характерной для штамма Y. pestis, взятого в опыт.
Вместе с тем, в разных сериях опытов в 7 - 12 % образцов прямым бактериологическим посевом контрольных суспензий блох через 24 - 48 часов обнаруживали рост единичных (от 1 до 75) колоний чумного микроба.
