Содержание к диссертации
Введение
1. Энтомопатогенные гифомицеты - возбудители микозов саранчовых (обзор литературы) 7
1.1. Видовой состав возбудителей и распространенность 7
1.2. Жизненный цикл 10
1.3. Факторы патогенности микромицетов 17
1.3.1. Ферментативная активность 17
1.3.2. Токсины 24
1.4. Культивирование 27
1.5. Препаративные формы 33
1.6. Применение энтомопатогенных гифомицетов для подавления численности саранчовых 35
2. Место, материалы и методы исследований 42
2.1. Место проведения исследований 42
2.2. Объекты исследований 42
2.2.1. Патогены 42
2.2.2. Тест-насекомые 43
2.3. Методика исследований 45
2.3.1. Культивирование грибов, микроспоридий и бактерий 45
2.3.2. Изучение продуктивности при поверхностном и глубинном культивировании 47
2.3.3. Определение скорости прорастания конидий в капле воды 47
2.3.4. Определение жизнеспособности конидий 48
2.3.5. Определение токсигенности энтомопатогенных грибов 48
2.3.6. Разведение и сбор тест-насекомых 49
2.3.7. Лабораторная оценка биологической активности 49
2.3.8. Оценка биологической активности в полевых условиях 51
2.3.9. Обработка полученных данных 53
3. Влияние биологических свойств энтомопатогенных гифомицетов на их вирулентность в отношении саранчовых 54
3.1. Изоляция и первичный скрининг штаммов микромицетов по признаку вирулентности к саранчовым 54
3.2. Оценка биологической активности изучаемых штаммов на насекомых из других систематических групп 61
3.3. Морфо-культуральные свойства изучаемых штаммов мюскардиновых грибов 64
3.3.1. Продуктивность грибов при поверхностном и глубинном культивировании 64
3.3.2. Динамика прорастания конидий 72
3.4. Влияние пассирования на биологическую активность гриба М. anisopliae 73
3.5. Влияние сублетальных доз гриба М. anisopliae на его активность 75
3.6. Оценка инсектицидной активности экзотоксинов гриба М. anisopliae 77
3.7. Зависимость смертности личинок перелетной саранчи от концентрации инокулюма 80
4. Влияние популяции хозяина на биологическую активность энтомопа тогенных грибов 84
4.1. Чувствительность различных видов саранчовых к гифомицетам 84
4.2. Восприимчивость стадной и нестадной фаз перелетной саранчи к энтомопатогенным грибам 100
4.3. Влияние пола хозяина на биологическую активность мюскардиновых грибов 103
4.4. Возрастная чувствительность личинок перелетной саранчи к микозу 106
5. Активность смешенных инфекций в отношении личинок перелетной саранчи 109
5.1. Микроспоридиально-грибная инфекция 109
5.2. Бактериально-грибная инфекция 114
6. Оценка биологической эффективности энтомопатогенных грибов в отношении перелетной саранчи в полевых условиях 120
Выводы 127
Практические рекомендации 128
Заключение 129
Список литературы 130
- Жизненный цикл
- Изоляция и первичный скрининг штаммов микромицетов по признаку вирулентности к саранчовым
- Чувствительность различных видов саранчовых к гифомицетам
- Оценка биологической эффективности энтомопатогенных грибов в отношении перелетной саранчи в полевых условиях
Введение к работе
Актуальность темы. Разработка биологических средств подавления численности вредных саранчовых является одним из наиболее приоритетных и динамично развивающихся в настоящее время направлений в области защиты растений Подобные исследования активно проводятся в ряде стан мира - США, Аргентине, Бразилии, Южно-Африканской Республике, Франции, Германии, Испании и др (Lomer et all, 2001)
Из всех известных групп энтомопатогенньгх микроорганизмов, поражающих саранчовых наибольшее внимание исследователей привлекают мюскардиновые грибы (Deuteromycetes, Hyphomycetes)
В результате проведенных за рубежом работ было создано и успешно внедрено два препарата на основе гриба Metarhizium amsophae var acndum - Green Muscle (Африка), Green Guard (Австралия), обладающих высокой биологической эффективностью (85-95%) против перелетной, пустынной, мороккской саранчи и кобылок (Langewald et all, 1997, Lomer et al, 2001) Ha основе Beauvena bassmna в США созданы два экспериментальных противо-саранчовых препарата - Mycocide GH и Mycotrol
На территории СНГ исследования, посвященные использованию энтомопатогенньгх микроорганизмов в борьбе с вредными саранчовыми - немногочисленны и носят эпизодический характер В отечественной практике в настоящее время нет ни одного биологического препарата для контроля численности саранчовых
В связи с этим поиск перспективных штаммов, юс изучение, а также создание отечественных противосаранчовых микоинсектицидов является приоритетным
Цель работы - отбор видов и штаммов энтомопатогенньгх гифомицетов -как продуцентов биопрепаратов для борьбы с вредными саранчовыми (перелетная саранча, итальянский прус и др) и оценка возможности их использования
В задачи работы входило
Поиск и выделение природных изолятов гифомицетов, паразитирующих на саранчовых, в том числе и в резервациях
Скрининг культур грибов (новых и коллекционных) по признаку вирулентности в отношении различных видов, возрастов и фаз саранчовых,
Определение продуктивности отобранных штаммов при поверхностном и глубинном культивировании,
Оценка биологической активности отобранных штаммов в полевых условиях
Изучение возможностей совместного использования разных видов патогенов и смешанных инфекций
Научная новизна. Отобраны новые отечественные высоковирулентные штаммы гифомицетов Показано, что наибольшей патогенностью к саранчовым обладают штаммы, выделенные из насекомых целевой группы, обитающих в ксерофитных стациях (биологическая активность до 100%) Впер-
вые показано, что виды саранчовых, обитающие в гигрофитных стациях существенно устойчивее к микозам, в сравнении с ксерофилами Выявлена большая чувствительность к грибам стадной формы азиатской саранчи по сравнению с одиночной Установлена зависимость смертности саранчовых от титра конидий гриба рабочей суспензии и стадии развития насекомых-хозяев Впервые изучены особенности развития смешанной микроспориди-ально-грибной и бактериально-грибной инфекции на перелетной саранче
Практическая ценность. Отобраны два высокоэффективных штамма эн-томопатогенных гифомицетов Metarhizium amsophae (Sorok) -МАК-1, Beau-vena basswna (Bals) Vuill - ББК-1, перспективных для создания на их основе биопрепаратов для контроля численности саранчовых Проведена первичная оценка методов их наработки в поверхностной и глубинной культуре Подобраны оптимальные титры рабочей суспензии для проведения испытаний в полевых условиях. Показана перспективность использования смешанных инфекций (микроспоридиально-грибных и бактериально-грибных) для подавления численности вредных саранчовых
Апробация работы. Результаты работы доложены на XII и XIII съездах Русского энтомологического общества (С Петербург, сентябрь, 2002 г, Краснодар , 2007 г), совещании международного общества Патологии беспозвоночных (SIP) (Упсала, Швеция, июнь, 2004 г), на отчетно-плановой сессии ВИЗР (С Петербург — Пушкин, март, 2004 г), на втором Всероссийском съезде по защите растений (С Петербург - Пушкин, декабрь, 2005 г), на международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах», посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова (Москва, февраль, 2006 г), на международной конференции «Актуальные проблемы развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии» (Алмалыбак, Казахстан, июль, 2006 г), на VII межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока «Энтомологические исследования в северной Азии», (Новосибирск, октябрь, 2006 г), на 1-ой Международной конференции молодых ученых и аспирантов, посвященной 15-летию Независимости Республики Казахстан. (Алматы, Казахстан, 2006 г), на XV конгрессе Европейских микологов (С -Петербург, сентябрь 2007 г)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, из них две входят в Перечень научных журналов и изданий, рекомендованный ВАК
рф п, /иг
Объем и структура диссертации изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, выводов и практических рекомендаций Работа иллюстрирована 38 таблицами и 22 рисунками Список цитированной литературы включает 185 источников, из них 120 на иностранных языках
Работа выполнялась при финансовой поддержке гранта «Ориентированные фундаментальные исследования Российского фонда фундаментальных исследований РФФИ» № 06-04-08174-офи
Жизненный цикл
Проникновение грибов в организм насекомого-хозяина может осуществляться различными способами: через кишечник (перорально), дыхальца, поровые канальца на кутикуле, но наиболее распространенный тип - активное внедрение через кутикулу (перкутанно) (Евлахова, 1974).
Инфицирование насекомых грибами можно условно разделить на следующие этапы: 1) адгезия; 2) развитие гриба на поверхности кутикулы; 3) проникновение и развитие гриба в кутикуле и 4) вторжение в полость тела и колонизация внутренних органов насекомого (Борисов и др., 2001).
Адгезия грибных конидий на кутикуле происходит за счет гидрофобных взаимодействий между липидными компонентами эпикутикулы и клеточной оболочки, а также за счет неровностей и выростов (складки, щетинки, и др.) на поверхности кутикулы. В некоторых случаях патоген адгезируется только к определенным тканям. Например, при поражении личинок комаров рода Culex энтомопатогенным грибом Metarhizium anisopliae споры гриба фиксируются на гидрофобной поверхности сифона и затем инвазируют ткань последнего (Гештовт, 2002 ). Этому способствует гидрофобная поверхность спор M.anisopliae, которая обеспечивает адгезию гриба и длительное нахождение его на поверхности воды.
Последующие этапы заражения наиболее полно были изучены Р. Заха-рук (Zacharuc, 1970) при заражении личинок щелкунов Limonlus californicus, Hypolithus bicolor, Ctenicera aeripennis и C.destructor грибом Metarhizium anisopliae.
Типичная непроросшая конидия возбудителя имеет круглое, расположенное в центре, ядро. В начале или незадолго до прорастания ядро становится вытянутым и перемещается из центра споры к полюсу прорастания, где начинает делиться. Через некоторое время у одного из полюсов появляется ростковая трубка. Иногда она может появиться из середины споры, или может наблюдаться биполярное прорастание. Оставшееся в конидии ядро со временем разрушается (Zacharuc, 1970). Ростковая трубка внедряется вертикально в хитиновый покров насекомого и проникает в полость тела. Эта фаза развития гриба начинается через 10-12 часов после разбухания спор и может продолжаться несколько дней. В месте соприкосновения с покровами ростковая трубка, разрастаясь, образует аппрессориальную клетку, которая отделяется от ростковой трубки септой. Закончив свое формирование, аппрессо-риальная клетка начинает делиться. Дочерние клетки отделяются от материнской септами. Аппрессориальные клетки покрыты слизеподобным веществом, которое и обеспечивает плотное сцепление этих структур с эпикути-кулой. Аппрессории, развивающиеся из разных ростковых трубок, могут сформировать так называемую инфекционную подушку. Она обычно содержит от 2 до 10 и более аппрессории (Zacharuc, 1970, Борисов и др. 2001).
Перед началом внедрения гриба в кутикулу наблюдается образование полостей в эпикутикуле под аппрессорием. При этом происходит расширение поровых канальцев и исчезновение воскового слоя. В образовавшиеся полости переливается эндоплазма аппрессориальных клеток и образуется проникающая трубочка. Расширение поровых канальцев, исчезновение воскового слоя и отсутствие видимого механического повреждения эпикутикулы определено действием гидролитических ферментов гриба в процессе инфицирования. Кроме того, наличие многочисленных митохондрий и диктиосом в аппрессориальных клетках может предполагать высокий уровень метаболизма и экскреторной активности (Гештовт, 2002).
После этого из проникающей платы начинают развиваться отростки, растущие латерально и/или вниз. Тонкие латеральные гифы дают затем начало гифальным телам первого (ГТ1) и второго (ГТ2) порядка. Тип ГТ1 имеет неправильную форму, электронно-плотную эндоплазму и тонкую клеточную стенку. Другой тип — ГТ2 — имеет более правильную форму, обычно она овальная или несколько вытянутая; с менее плотной цитоплазмой и с более толстой клеточной стенкой, чем у ГТ1. Оба этих типа встречаются в виде слоев, наложенных друг на друга, цепочек или беспорядочно разбросаны среди ламелл прокутикулы. Образование гифальных тел происходит путем почкования или гифальных тел, или латеральных гиф. В результате ультраструктурного изучения было выявлено, что ГТ1 появляются раньше и дают начало ГТ2. Первоначально развитие гриба происходит в верней части прокутикулы. В ламинизированной части прокутикулы развитие гриба происходит следующим образом: ГТ2 продуцирует короткую вертикальную гифу, достигающую пространства между двумя смежными ламеллами и дающую начало новому ГТ2. В нижележащих слоях прокутикулы вертикальная гифа имеет тенденцию к удлинению и продуцированию нескольких гифальных тел (Борисов и др., 2001).
По данным световой микроскопии, в местах внедрения гриба в гиподерму наблюдается лизис клеток этой ткани. Проникшие за пределы этой ткани гифы увеличиваются в размере и начинают делиться. Начальные этапы колонизации внутренних органов характеризуются формированием в гемо 13 лимфе звездообразных гифальных тел (бластоспор). Токами гемолимфы они разносятся по телу и через некоторое время продуцируют бластоспоры правильной элипсовидной формы (Евлахова, 1974). Прежде всего, разрушаются лимфоциты. В этот период гриб продуцирует токсины, приводящие хозяина к гибели. К моменту, когда патоген уничтожит лимфоциты, насекомое погибает. Гибель хозяина обычно наступает, в зависимости от паразитических свойств гриба, морфо-физиологических особенностей насекомого и абиотических условий среды на третьи - двадцатые сутки. Наиболее интенсивное размножение гриба в виде бластоспор наблюдается в гемолимфе насекомого-хозяина; зародышевый мицелий концентрируется в местах проникновения. Активная колонизация внутренних органов насекомого начинается лишь после его гибели. В первую очередь гриб атакует жировое тело, затем наступает очередь кишечного тракта и мальпигиевых сосудов (Леднев и др., 2003). Остальные органы заселяются обычно в следующем порядке: гиподерма — нервная система — мышечная ткань — трахеи. Нарастающая масса гиф заполняет тело хозяина, не деформируя его покров, и труп насекомого вначале имеет внутри творожную консистенцию, затем уплотняется и мумифицируется. После этого гифы патогена начинают расти к поверхности тела и при наличии достаточной влажности прорастают на поверхность кутикулы насекомого, образуя пушистый или войлочный мицелий, который выступает на поверхность трупа поясками из-под крыльев или же прорывающий покровы между сегментами, часто покрывая все тело. Первоначальные места выхода гриба на поверхность тела приурочены к тонким частям интегументов: порам чувствительных органов и межсегментным мембранам. Однако появление гриба не ограничивается только этими местами. Он также может проникать через утолщенные участки кутикулы — склериты. Следует отметить, что очевидного разрушения органов и тканей, и особенно прокутикулы, во время роста гриба к поверхности тела может не происходить. Выход гиф на поверхность осуществляется путем разрыва покровов гифами, находящимися в прокутикуле. Споруляция начинается через сутки после появления вегета 14 тивных гиф. На мицелии формируется конидиальное спороношение в виде конидиеносцев с воздушными конидиями, которые осуществляют последующее заражение насекомых-хозяев в течение периода активного развития и возобновления паразитического цикла весной. В ряде случаев заражение может проходить и в зимний период на диапаузирующих насекомых в почве, но при этом развитие микоза происходит крайне медленно (Борисов и др., 2001).
Видовые особенности грибов и насекомых, физиологическое состояние организма последних, а также места на кутикуле, через которые происходит внедрение, могут вносить коррективы в процесс инфицирования.
Существенные различия могут быть в скорости прорастания спор эн-томопатогенных дейтеромицетов. По данным некоторых авторов, споры гриба M.anisopliae начинают прорастать через 12 ч на покровах личинок жуков-щелкунов, но основная их масса прорастает в период между 24-48 ч после заражения (Гештовт 2002). В целом скорость прорастания часто бывает напрямую связана с вирулентностью штаммов — высоковирулентные прорастают в большинстве случаев раньше, чем средне- и низковирулентные (Се-ребров, 2000).
При заражении гусениц Ostrinia furnacalis было отмечено, что с возрастом насекомого изменяется скорость развития инфекции. Период проникновения ростковой трубки через кутикулу в гемоцель гусениц 1-2 возраста занимает 36 ч, а гусениц 3-4 возраста — 46 ч. Повреждение и разрушение тканей у гусениц 1-2 возраста начинается через 42-48 ч после заражения, у 3-4 возраста — через 72-96 ч, у гусениц последнего возраста — через 120-140 ч. Заражение М. anisopliae тлей Myzodes perslcae, Lepaphis erysimis и листоеда Psylliodes chrysophella показало, что конидии легче прорастают и удерживаются у тлей на поверхности, а у жуков — под надкрыльями. На кутикуле тлей гриб образовывал в большом количестве мелкие аппрессории, а на кутикуле жуков они иногда вообще не формировались.
Изоляция и первичный скрининг штаммов микромицетов по признаку вирулентности к саранчовым
Первый этап исследований направленных на отбор штаммов энтомопа-тогенных гифомицетов, перспективных для подавления численности саранчовых включал в себя два направления:
1. Сбор и выделение новых природных изолятов из пораженных микозом представителей семейства Acrididae из различных природно-климатических зон России, в т.ч. и резервациях, с последующей оценкой их биологической активности на личинках перелетной саранчи;
2. Скрининг штаммов гифомицетов из коллекций ВИЗР, ИСиЭЖ и АО «Росагросервис» по признаку вирулентности в отношении саранчовых.
В ходе выполнения настоящей работы нами совместно с Г.Р. Ледневым было выделено три новых изолята гифомицетов - В. bassiana (ББК-1, ББЛ-03) и М. anisopliae (МАК-1).
Штаммы ББК-1 и МАК-1 были изолированы из личинок 5-го возраста стадной фазы итальянского пруса в Карасукском районе Новосибирской области в июле 2000 года в период вспышки его массового размножения. Тогда, численность насекомых на отдельных участках степи достигала более сотни особей на квадратный метр. Для штамма ББК-1 было характерно первичное разрастание белой мицелиальной массы гриба на сочленениях и межсегментных областях насекомого, с последующим интенсивным спороноше-нием (рис.3 А). Штамм МАК-1 характеризовался локальной концентрацией корочек спор на белой мицелиальной массе (рис.3 Б).
Анализ видового состава грибов обнаруженных на трупах пруса в этот период показал, что доминирующим видом являлась В. bassiana, доля которого в общей структуре микромицетов (как патогенных, так и сапротрофных) составила 61 % (рис. 2). Среди других энтомопатогенных видов был отмечен М. anisopliae (6 %). Остальная доля принадлежала сапротрофным видам.
Таким образом, в групповом составе микромицетов обнаруженных в природной популяции итальянского пруса существенно доминировали паразитические виды из группы мюскардиновых грибов (суммарно 68 %). Анализ зараженности вредителя представителями данной группы патогенов показал, что суммарная смертность от мюскардинозов насекомых, собранных 18 июля составила 16,6 % (при общем объеме выборки 868 особей). Особо следует обратить внимание на то, что достаточно активное развитие микоза в данном случае происходило в засушливых условиях сухой Кулундинской степи, при практически полном отсутствии осадков и незначительных росах. ГТК здесь не превышает 0,75 (табл. 3). Таким образом, здесь мы имели дело с высоко агрессивными популяциями патогенов, приспособленными к ярко выраженным ксерофитным условиям.
В ряде работ также приводятся данные об энзоотическом развитии микозов природных популяций стадных саранчовых в ксерофитных стациях. Так на юге Испании в отдельные годы уровень зараженности морокской саранчи Dociostaurus maroccanus грибами В. bassiana и М. anisopliae варьирует в пределах от 1,6 до 20,5% (Hernandez-Crespo et al., 1997).
На севере Бенина в пойме реки Нигер зараженность Pyrgomorpha cognata и других видов кобылок М. anisopliae в среднем не превышает обычно 6% (Lomer et al., 2001).
Штамм ББЛ-03 {В. bassiana) был выделен из материала, собранного в июле 2003 года в условиях Лазовского государственного биосферного заповедника (окрестности кордона «Сухой лог»), расположенного в юго-восточной части Приморского края. В данном случае наблюдалась массовое поражение личинок старших возрастов комплекса нестадных саранчовых микозом (личное сообщение Г.Р. Леднева). Количество трупов насекомых с признаками грибной инфекции достигало 10-15 особей на 1 м , при этом численность живых личинок не превышало 1 - 2-х особей. Таким образом, уровень смертности кобылок от микоза превышало 80%. При этом площадь очага массового поражения по самой приблизительной оценке превышала 1 га.
В данном случае вспышка эпизоотии наблюдалась при метеорологических условиях типичных для Приморского края в этот период (ГТК - более 2-х) (табл. 3).
Первичный анализ вирулентности указанных штаммов в отношении личинок 3 - 4-го возрастов лабораторной популяции перелетной саранчи показал, что микромицеты изолированные в Новосибирской области обладают высокой биологической активностью в отношении указанного вида вредителя. Смертность личинок на 9 - 15-е сутки при титрах рабочей суспензии 1 и 5х107 составляет 90 - 100%. Штамм ББЛ-03 напротив показал низкую активность по отношению к данному хозяину. Смертность личинок на 17-е сутки при приведенных выше концентрациях составила 40 - 60%) (табл. 3). Особо следует обратить внимание на то, что штамм ББЛ-03, показавший низкую биологическую активность, был выделен из очага массового заражения саранчовых (выше 80%) и, следовательно, находился на пике своей вирулентности. В тоже время культуры ББК-1 и МАК-1 - высоко активные в отношении перелетной саранчи изолированы из очага пруса, при его относительно низком уровне зараженности микозом (до 17%). Таким образом, естественный уровень пораженности насекомых микозом в данном случае не оказывает существенного влияния на его биологическую активность в отношении саранчи.
Здесь необходимо подчеркнуть, что все опыты по оценке биологической активности энтомопатогенных гифомицетов проводили в условиях, оптимальных для саранчи (температура воздух - 27-29С; относительная влажность не превышала 80%). Как известно из литературы подобные условия являются неблагоприятными для развития возбудителей микозов (Евлахова, 1974; Гештофт, 2002).
Вероятно, столь значительные различия по уровню вирулентности между данными штаммами обусловлены в первую очередь особенностями их гидротермического преферендума.
Так, штаммы ББК-1 и МАК-1 были выделены из типично ксерофиль-ной стации (ГТК ниже 1). В связи с этим данные изоляты обладают высокой устойчивостью к повышенным температурам и пониженной влажности воздуха, что в конечном итоге и обеспечивает их высокую вирулентность по отношению к термофильным видам насекомых-хозяев. Штамм ББЛ-03 был выделен в зоне с типично муссонным климатом (ГТК более 2) и, следовательно, для него оптимальна повышенная влажность воздуха и умеренные температуры, что и является лимитирующим фактором при заражении саранчи.
Скрининг штаммов из коллекции ВИЗР и ИСиЭЖ, выделенных также из саранчовых выявил туже закономерность (табл. 3). Так, штамм ББЧ-99, выделенный Г.Р. Ледневым в 1999 году на северо-западных предгорьях Алтая, характеризующихся умеренно теплой погодой и высоким количеством осадков (380 мм за лето; ГТК - 2,4) показал низкую биологическую активность в отношении личинок перелетной саранчи. Смертность хозяина в этом случае при использовании приведенных выше титров на 17-е сутки после обработки не превышала 60%.
Напротив штамм БТ-86 гриба В. brongniartii, выделенный А.А. Нуржановым в 1986 году в Каракалпакии, регионе с типично пустынным климатом, где среднесуточная температура воздуха за летние месяцы составляет 33С, а количество осадков не превышает 30 мм обладает высокой агрессивностью в отношении перелетной саранчи. В данном случае биологическая активность на 13 - 17-е сутки варьирует в приделах от 60 до 100% (табл. 3).
Подобный уровень смертности хозяина наблюдается и под действием штаммов САР-31 и R-72y (коллекция ИСиЭЖ), выделенных из кубышек саранчовых и почвы соответственно на юго-западе Новосибирской области, в условиях сходных с местом изоляции штаммов ББК-1 и МАК-1.
Для сравнения была проведена оценка биологической активности двух штаммов микромицетов из коллекции АО «Росагросервис» ББКЖ (В. bassiana) и МАЛИ (М. anisopliae), выделенных из жуков-листоедов (Coleoptera, Chrysomilidae) в степной зоне Краснодарского края. По личному сообщению Б.А. Борисова данные штаммы являются высоко устойчивыми к повышенным температурам и пониженной влажности воздуха, и проявляют высокую биологическую активность в борьбе с комплексом сосущих вредителей в условиях защищенного грунта.
Проведенные опыты показали, что данные штаммы проявляют низкую агрессивность в отношении личинок перелетной саранчи. Смертность хозяина к 17-м суткам после обработки не превышала 30-60% (табл. 3).
Чувствительность различных видов саранчовых к гифомицетам
Важным элементом при разработке биопрепаратов является определение круга целевых насекомых - вредителей.
Из литературы известно, что различные виды саранчовых проявляют неодинаковую чувствительность к химическим инсектицидам (MacCuaig, 1956; Курдюков, Наумович, 1984). В отношении биологических препаратов подобные сведения в литературе отсутствуют.
В связи с этим нами был проведен ряд экспериментов, направленных на определение восприимчивости различных видов насекомых из семейства Acrididae (как стадных, так и нестадных) к энтомопатогенным гифомицетам.
На первом этапе работ оценивали сравнительную чувствительность двух видов лабораторных популяций стадных саранчовых: перелетной (L. migratoria migrator ides) и пустынной саранчи (Sch. gregaria) к трем штаммам грибов (МАК-1; ББК-1; БТ-86).
Проведенные наблюдения показали высокую активность всех изучаемых штаммов в отношении личинок 1-го и 3-го возрастов обоих видов саранчовых. Для личинок первого возраста уже через одну неделю после обработки гибель насекомых при двух испытуемых титрах рабочей суспензии (5x10 и 1x10 ) составляла 100% (табл. 17). Аналогичный уровень смертности личинок 3-го возраста (титры -5х106; 1х107и 5х107) наблюдался к 11-м суткам (95-100%) (табл. 17).
При этом были выявлены существенные различия в динамики смертности личинок в зависимости от вида хозяина. Так, к четвертым суткам после обработки смертность личинок 1-го возраста пустынной саранчи в зависимости от штамма гриба и титра конидий превышала значение этого показателя для одновозрастных личинок перелетной саранчи на 30-55% (25-60 и 55-90% соответственно) (табл. 17; рис. 10). К 7-м суткам указанные различия нивелировались.
Экспериментальные данные указывают на то, что наиболее сильные различия в чувствительности к микозам личинок указанных видов саранчи проявляются при использовании минимальной из испытуемых концентраций (5х106) - 45-55%.
Для личинок 3-го возраста указанная тенденция полностью сохраняется. В данном случае к пятым суткам после обработки смертность пустынной саранчи была выше в сравнении с перелетной на 10-40% (табл. 18; рис. 10). Наиболее ярко дан-ная закономерность проявилась в отношении штамма МАК-1 при титре 5x10 . В этом случае смертность личинок Sch. gregaria составила 85%, в то время как для L. migratoria значение этого показателя не превысило 55%.
Таким образом, проведенные исследования показали, что пустынная саранча обладает повышенной восприимчивостью к микозам по сравнению с перелетной саранчой.
На наш взгляд причина данного явления может заключаться, так же как и в случае с самими изучаемыми штаммами грибов (см. раздел 3.1.) в различиях гидротермических преферендумов и соответственно мест обитания указанных видов саранчовых. Так, L. migratoria в местах резервации занимает стации близкие к гигрофильным (плавни рек) и ее температурный оптимум находится в приделах 26-28 С (Лачининский и др., 2002). Такие условия вполне благоприятны для развития энто-мопатогенных грибов и, следовательно, высока вероятность контакта между патогеном и хозяином. При таких обстоятельствах постоянного сосуществования вполне вероятно предположить наличие у насекомого-хозяина дополнительных защитных реакций к патогенным микромицетам.
Напротив, пустынная саранча занимает в основном типично ксерофильные стации (пустыни и полупустыни), температурный оптимум у нее несколько выше -28-30 С (Лачининский и др., 2002). Подобный гидротермический режим явно неблагоприятен для возбудителей микозов. Таким образом, при этих условиях возможность контакта между паразитом и хозяином сильно ограничена, и как следствие этого, можно предположить отсутствие определенных защитных реакций саранчи к энтомопатогенным грибам. Здесь особо следует подчеркнуть, что это лишь одна из возможных гипотез, нуждающаяся в дальнейшем подтверждении.
Кроме лабораторных популяций перелетной и пустынной саранчи сравнительная оценка биологической активности штаммов МАК-1, ББК-1 и БТ-86 была проведена на природных популяциях трех видов нестадных саранчовых, а также перелетной саранче, итальянском прусе и на комплексе видов трибы Dociostaurini.
В 2004 году в условиях Астраханской области (Дамчикский участок Астраханского биосферного заповедника) было проведено два параллельных эксперимента по оценке биологической активности изучаемых штаммов гифомицетов в отношении имаго кобылки Вагнера {Mioscirtus wagneri) и зеленой болотной кобылке {Parapleurus alliaceus) (табл. 19, 20).
Оценка биологической эффективности энтомопатогенных грибов в отношении перелетной саранчи в полевых условиях
Кроме лабораторной популяции перелетной саранчи оценку биологической активности отобранных штаммов микромицетов в течение трех сезонов проводили в ходе мелкоделяночных полевых опытов (под изоляторами из газовой ткани) на природных популяциях данного вида вредителя (Астраханская область - 2002-2003 годы; Алматинская область (Казахстан - 2005 год).
В 2002 году эксперимент по оценке биологической активности энтомопатогенных грибов в отношении азиатской саранчи был заложен в период, когда в природных популяциях вредителя доминировали личинки 5-го возраста (83%).
Опыт включал в себя следующие варианты: М. anisopliae (штамм МАК-1) (титры - 1х107, 5x107, 1x108); В. bassiana (ББК-1) (титры - 1х107, 5х107, 1хЮ8);Я. brongniartii (ЪТ-Щ (1x108) (табл.36).
Результаты наблюдений показали, что уровень смертности саранчи во всех вариантах опыта был существенно выше (на уровне вероятности 95%) по сравнению с контролем. При обработке штаммом БТ-86, с титром спор 1x10 , гибель личинок вредителя уже на седьмые сутки после обработки составила 52,9 %, а к одиннадцатому дню достигла 94,1 % (табл.36). Среди других вариантов опыта наиболее высокая смертность хозяина к семнадцатым суткам на уровне 94% была отмечена при обработке саранчи споровой суспензией МАК-1 с титром 1x10 . При использовании этого штамма с титрами 1-х 10 и 5-х 10 гибель вредителя в этот же период была несколько ниже и составила 82,2 и 76,4 % соответственно. Однако наблюдавшиеся различия по смертности саранчи между всеми тремя концентрациями гриба на данную дату учета были статистически не достоверны.
На 22-е сутки по всем вариантам опыта гибель саранчи прекратилась, и различия по уровню ее смертности нивелировались (статистически существенных различий не обнаружено).
Анализ динамики посуточной смертности саранчи показал, что во всех вариантах максимальный уровень гибели личинок наблюдался на 13 - 17-е сутки после обработки. За исключением БТ-86, где максимальный уровень гибели саранчи был уже на 7-9-е сутки. В дальнейшем смертность под воздействием грибов снижалась и к 22-м суткам полностью прекратилась. При этом все погибшие особи, собранные в течение всего периода наблюдений при помещении их во влажную камеру активно обрастали мицелием патогенов.
Таким образом, проведенные исследования выявили достаточно высокую эффективность отдельных штаммов и видов энтомопатогенных грибов в отношении личинок старших возрастов азиатской саранчи в полевых условиях.
В 2003 году оценка биологической активности энтомопатогенных гифомицетов на азиатской саранче проводилась также на Дамчикском участке Астраханского заповедника.
Как и в предыдущем сезоне использовали те же три штамма гифомицетов - МАК-1, ББК-1 и БТ-86 при двух титрах конидий концентрациях (1x107, 5x107).
В этот период в природных популяциях вредителя доминировали личинки 4 -5-го возрастов (80%).
Результаты наблюдений показали, что уровень смертности саранчи как и в предыдущем году во всех вариантах опыта был существенно выше (на уровне вероятности 95% ) по сравнению с контролем (табл.37). Наиболее высокая смертность личинок саранчи на 17-е сутки после обработки наблюдалась при использовании штаммов БТ-86 и ББК-1 с титром конидий 5x10 - 77,9 и 75,2% соответственно (рис. 23). При обработке личинок азиатской саранчи штаммом МАК-1 в обеих концентрациях к 17-м суткам после закладки опыта смертность вредителя составила 41,7 и 44,5 % соответственно, что существенно ниже по сравнению с другими вариантами.
Анализ динамики посуточной гибели саранчи показал, что во всех вариантах максимальный уровень гибели личинок наблюдался на 7-15-е сутки после обработки. В дальнейшем смертность под воздействием грибов снижалась. К сожалению, нам не удалось наблюдать за гибелью саранчовых после 17-ти суток. При этом все погибшие особи, собранные в течение всего периода наблюдений при помещении их во влажную камеру активно обрастали мицелием патогенов.
Следует отметить, что в целом биологическая активность испытуемых агентов биоконтроля в отношении перелетной саранчи была существенно ниже по сравнению с 2002 годом (рис. 23).
Вероятно, это было обусловлено тем, что на следующий день после закладки опыта пошел сильный ливень, который смыл часть спор с поверхности обработанных насекомых. В особенности это может объяснить ситуацию со штаммом МАК-1, который в прошлом году проявил биологическую эффективность на уровне 94%, что было существенно выше по сравнению с большинством других изучаемых штаммов, а в текущем сезоне его активность была значительно ниже в сравнении с другими культурами.
Поскольку в ходе лабораторных опытов было показано, что конидии этого гриба при оптимальных условиях начинают прорастать только через 14 часов (см. раздел 3.3.2.), то, следовательно, до ливня, который прошел через 12 часов после обработки, МАК-1 находился еще в неактивном состоянии. После прошедших осадков большая часть конидий патогена была смыта с кутикулы хозяина, что, по всей видимости, и обусловило столь низкий уровень активности данного штамма.
К сожалению, в 2004 году на Дамчикском участке Астраханского заповедника нам не удалось обнаружить ни одного очага стадной фазы перелетной саранчи, что и не позволило заложить опыты на данном целевом виде.
В 2005 году аналогичный эксперимент в отношении личинок 5-го возраста перелетной саранчи был заложен на базе НИИ защиты растений Казахстана (п. Рахат, Алматинской обл.).
Личинки для опыта были отобраны из природного очага вредителя в окрестностях озера Балхаш.
Схема опыта включала те же варианты, что и в 2003 году в Астраханском заповеднике - штаммы МАК-1, ББК-1 и БТ-86 при двух титрах (1x107, 5x107).
Проведенные исследования показали, что и как в случаях с астраханской популяцией перелетной саранчи смертность личинок во всех вариантах опыта была существенно выше в сравнении с контролем (табл. 38).
Причем в данном опыте эти различия были существенны уже к третьим суткам после обработки. Смертность насекомых в этот период варьировала от 13,6 до 14,6%) при титре 1х107 и от 20,7 до 35% при титре 5х107. При этом гибели в контроле не наблюдалось. Наибольшую активность в данном эксперименте проявил штамм ББК-1 - уже к 9-м суткам смертность насекомых составляла 77,4 и 90% при концентрациях 1x107 и 5x107 соответственно, а к 17-у дню 88,3 и 100% (табл. 38, рис. 23).
