Содержание к диссертации
Введение
Глава I. STRONG Современные представления о взаимоотношениях чумного микроба и блох (обзор литературы)
STRONG
1.1. Природный очаг чумы как экологическая система 15
1.2. Трансмиссивная передача чумного микроба как один из главных механизмов энзоотии чумы 19
1.2.1. Передача чумного микроба «блокированными» блохами 20
1.2.2. Передача чумного микроба «неблокированными» блохами 24
1.2.3. Явление агрегированности чумного микроба в организме переносчика и его значение для блокообразования и трансмиссии микроба 28
1.3. Гипотезы нетрансмиссивной передачи чумного микроба 31
1.4. Основные характеристики сибирских природных очагов чумы 37
Глава 2. Материал и методы 60
2.1. Районы работ и объекты изучения 61
2.2. Методы исследований взаимоотношений чумного микроба с блохами...63
2.2.1. Разведение блох для экспериментальных исследований 63
2.2.2. Заражение насекомых чумным микробом и условия их содержания в опытах 66
2.2.3.Изучение межпопуляционных особенностей взаимоотношений перенос чиков с чумным микробом 70
2.3. Исследование инфицированных блох .: 73
2.4. Исследование зверьков, использованных для кормления инфицированных насекомых 74
2.5. Статистическая обработка экспериментальных данных 75
Глава 3. Влияние сезона года и половых различий блох на взаимоотношения с чумным микробом 76
3.1. Сезонная динамика взаимоотношений чумного микроба и блох
3.1.1. При питании имаго на специфичном прокормителе 76
3.1.2. При питании имаго на неспецифичном прокормителе 89
3.2. Влияние пола блох на их взаимоотношения с чумным микробом 99
3.2.1. Частота и динамика образования «блока» преджелудка 100
3.2.2. Частота передачи чумного микроба 108
3.3. Влияние абиотических факторов на алиментарную активность, смерт ность блох и их взаимоотношения с чумным микробом 112
Глава 4. Второстепенные способы передачи чумного микроба блохами 127
4.1. Передача чумного микроба инфицированными «неблокированными» насекомыми 127
4.2. Заражение носителя при поедании зверьком инфицированных блох... 133
4.3. Заражение носителя через поврежденную кожу 136
4.4. Заражение носителя при контакте с субстратом гнезда, инфицированным трупами и экскрементами блох 137
4.5. Сравнительная эффективность различных способов передачи чумного микроба блохами 140
Глава 5. Межвидовые и межпопуляционные различия во взаимоотношениях блох с чумным микробом 148
5.1. Векторная характеристика массовых видов блох длиннохвостого суслика в Тувинском природном очаге чумы 149
5.2. Межпопуляционные различия блох из Тувинского природного очага в трансмиссии чумного микроба 161
5.3. Особенности взаимоотношений чумного микроба и блох из географически разобщенных популяций (из разных природных очагов) 169
5.4. Особенности взаимоотношений чумного микроба и блох, исторически не контактировавших с возбудителем 190
5.4.1. Блохи с неочаговых по чуме территорий 190
5.4.2. Лабораторные межподвидовые гибриды блох 204
Глава 6. Морфологическая изменчивость у блох как индикатор характера их взаимоотношений с чумным микробом '. 210
6.1. Морфологические особенности и различия уровня флуктуирующей асимметрии билатеральных морф у блох из разных популяций Тувинского природного очага чумы 210
6.2. Уровень флуктуирующей асимметрии и блокообразование у блох с неочаговых по чуме территорий 215
6.3. Уровень флуктуирующей асимметрии и блокообразование у гибридов блох 217
Глава 7. Сохранение чумного микроба блохами в зимний сезон 221
7.1. Выживаемость интактных и зараженных чумой насекомых в зимний период 221
7.2. Состояние агрегированности чумного микроба в организме переносчика и его значение для сохранения микроорганизма 230
7.3. Особенности скрытой (латентной) фазы эпизоотического процесса в Тувинском природном очаге чумы 247
Заключение 255
Выводы 267
Список использованной литературы 270
- Природный очаг чумы как экологическая система
- Разведение блох для экспериментальных исследований
- Частота и динамика образования «блока» преджелудка
- Заражение носителя при контакте с субстратом гнезда, инфицированным трупами и экскрементами блох
Введение к работе
Актуальность проблемы. Огромный естественный природный резервуар чумного микроба вызывает реальные опасения относительно возникновения в современном мире, включая территорию России, эпидемических осложнений (Смирнова, Кутырев, 2006; Anisimov et al., 2004). Антропогенная трансформация ландшафтов, вовлечение территорий природной очаговости чумы в хозяйственную деятельность человека могут привести к непредсказуемым последствиям, в том числе, эпизоотическим и эпидемическим проявлениям. Нельзя игнорировать и существующую в последнее время угрозу террористических актов с использованием биологических объектов, которая определяет необходимость поддерживать и совершенствовать контроль за особо опасными инфекциями, включая чуму (Anisimov et al., 2004; Eisen et al., 2006; Трухачев, Лебедева, 2006, 2007).
Изучение природных очагов болезней представляет большие возможности для познания фундаментальных экологических закономерностей (Когеп-berg, 1982; Коренберг, 1983; 1985; 1986; Korenberg, 1989; Литвин, Коренберг, 1999). Природный очаг чумы является сложной экологической системой (Солдаткин, 1970; Литвин, 1983а, 19836; Иннокентьева и др., 1999; Атшабар, 1999). Трофические связи в этой системе между чумным микробом (Yersinia pestis), носителями инфекции (теплокровными животными), переносчиками (блохами - Siphonaptera), паразитирующими на носителе, обеспечивают формирование трансмиссивного пути поддержания энзоотии чумы (Bacot, Martin, 1914; Иофф, 1941; Бибикова, Классовский, 1974; Анисимов и др., 2001). Открытие феномена блокообразования у имаго блох (Bacot, Martin, 1914) явилось важной вехой на пути дальнейшего изучения их роли в передаче и сохранении возбудителя данной инфекции (Голов, Иофф, 1926; Blanc, Baltazard, 1937, 1942; Иофф, 1941; Wheeler, Douglas, 1941, 1945; Douglas, Wheeler, 1943; Burroughs, 1947; Флегонтова, 1951; Ралль, 1958; Тифлов, 1960; Балашов и др., 1961, 1965; Жовтый, 1966; Cavanaugh, 1971; Traub, 1972; Бибикова, Классовский, 1974; Ващенок, 1984, 1988, 1999; Vaughan, Azad, 1993;
He et al., 1997; Paskewitz, 1997; Beaucornu, 1999; Webb et al., 2006). К началу 70-х годов прошлого столетия исключительность блох как единственных специфических переносчиков чумного микроба не оставляла сомнений (Бибикова, Классовский, 1974). В то же время известная гипотеза «теллурической чумы» предполагала «непаразитарную» (почвенную) фазу существования возбудителя в межэпизоотические периоды (Mollaret, 1963; Baltazard et al., 1963; Baltazard, 1964). К концу 80-х годов все больше исследователей стали обращать внимание на невозможность эффективной передачи чумного микроба, обеспечивающей активные эпизоотии в природных очагах, только «блокированными» насекомыми (Солдаткин, Руденчик, 1988; Сулейменов, 1995; Lorange et al., 2005). Циркуляция вирулентного фенотипа микроба с помощью «неблокированных» имаго предложена в качестве механизма, альтернативного специфическому пути передачи возбудителя (Сулейменов, Ма-таков, 1990; Сулейменов и др., 1993; Eisen et al., 2006, 2007).
Ряд исследователей придерживается мнения о недостаточной изученности вероятности и условий осуществления, так называемых второстепенных механизмов передачи чумного микроба насекомыми, их влияния на скорость течения и распространения эпизоотии (Козлов, 1979; Еремицкий и др., 1988; Жовтый, Вершинин, 1989; Кузнецов, 1997; Ващенок, 1999). Важным направлением исследований признается (Бурделов, 1987) изучение заражающей способности блох в зависимости от различных условий, складывающихся в природных очагах (сезоны года, фазы эпизоотического процесса и др.). По мнению П.И. Анисимова с соавт. (2001), трудно представить фактор трансмиссии как несущественный в механизме энзоотии чумы, поскольку паразитарную систему, сложившуюся в результате длительной эволюции, характеризуют тонко отлаженные механизмы взаимодействия экологических связей, обеспечивающих ее саморегуляцию на основе пищевой зависимости. Актуальность настоящей работы обусловлена следующим: 1. Сибирские природные очаги чумы (Забайкальский, Тувинский и Горно-Алтайский) в России являются северной окраиной Центрально-Азиатс-
7 кой зоны природной очаговости этой инфекции, основная часть которой Расположена на территории Монголии и Китая (Сафонова, Саран, 1974; Голу-бинский и др., 1987; Попов и др., 2005). В Монголии и Китае ежегодно регистрируются вспышки заболевания людей чумой, и в последние годы прослеживается тенденция к увеличению числа заболевших (Tserennorov et al., 2003; Enkhbaatar.et al., 2003; Марамович и др. 2008).
На территории двух горных природных очагов Сибири (Тувинского и Горно-Алтайского) эпизоотии регистрируют ежегодно. Кроме того, в Тувинском очаге с 1989 г. наблюдается трансформация сообществ носителей и переносчиков (Галацевич, 1994; Вержуцкий, 2005), в Горно-Алтайском -изменение структуры таксоценоза блох с возрастанием доли одних видов и сокращением численности других (Корзун, 2007), при этом расширение ареала чумного микроба в обоих очагах.
2. Большинство культур чумного микроба, изолированных в сибирских очагах, получено от массовых видов блох. Так, в Тувинском очаге чумы на долю этих насекомых приходится 70,6 % штаммов возбудителя (Вержуцкий, 2005), Горно-Алтайском - 82,6 % (Корзун, 2007). Учитывая высокую естественную зараженность блох чумным микробом, считается более эффективным контролировать эпизоотическую ситуацию на территории природных очагов посредством борьбы с переносчиками, чем с носителями инфекции (Очиров и др., 1999; 2000; Вержуцкий и др., 2002; Матросов и др., 2004; Попов и др., 2004; Lorange et al., 2005; Никитин и др., 2005).
Результативность такого контроля зависит от глубоких и подробных знаний фауны, экологии, особенностей взаимоотношений блох с чумным микробом. Однако весь комплекс взаимоотношений чумного микроба и блох, влияющих на закономерность трансмиссии возбудителя в природных очагах Сибири, недостаточно исследован. Очевидна необходимость выявления таких особенностей, которые уточняют и расширяют наши представления о механизме энзоотии чумы. Изучение закономерностей функционирования системы паразит-хозяин, отношений между сочленами данной паразитарной
8 системы (переносчик-чумной микроб) актуальны, поскольку напрямую связаны с проблемой эпидемиологического надзора и совершенствованием мероприятий по неспецифической профилактике чумы.
Цель и основные задачи исследования
Цель работы — выявление особенностей взаимоотношений чумного микроба и блох, обеспечивающих трансмиссивный механизм поддержания энзоотии чумы в сибирских природных очагах.
Задачи:
Определить сезонную динамику процесса блокообразования у блох, их заражающей способности, роль самцов и самок этих эктопаразитов в трансмиссии чумного микроба.
Установить влияние абиотических факторов на алиментарную активность, смертность блох и их взаимоотношения с чумным микробом.
Рассмотреть возможность реализации и эпизоотологическую значимость второстепенных способов передачи чумного микроба блохами.
Оценить влияние межвидовых и межпопуляционных особенностей блох на их взаимоотношения с чумным микробом.
Установить особенности контактов между географически разобщенными популяциями чумного микроба и блох, а также исторически не контактировавшими с возбудителем чумы насекомыми и микробом.
Определить значение явления агрегированное чумного микроба в организме имаго блох для его передачи и сохранения насекомыми.
Выявить основные механизмы устойчивости сибирских природных очагов чумы, экологически связанные с блохами-переносчиками.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые для сибирских природных очагов чумы установлена сезонная динамика блокообразования у блох и передачи чумного микроба насекомыми. Максимальные значения данных показателей в экспериментах совпадали по времени с пиком эпизоотии в природном очаге. Выявлено, что при кровососании на лабораторных животных (белых мышах), не имеющих выраженных сезонных различий в чувстви-
9 тельности к возбудителю, динамика заражающей способности насекомых реализуется аналогично отмеченной при питании на длиннохвостом суслике. Это может указывать на коэволюцию эктопаразитов и чумного микроба, ритм взаимодействия которых сохраняется даже при смене прокормителя.
Впервые показано, что процессы распространения и сохранения чумного микроба блохами связаны с полом насекомого: первый лучше осуществляется самцами, второй — самками. У самцов большинства массовых видов блох чаще и в более короткие сроки возникает «блок» преджелудка, чем у самок, и они активнее осуществляют передачу микроба.
Выявлены межпопуляционные различия во взаимоотношениях переносчиков с чумным микробом в Тувинском природном очаге. Более активное взаимодействие (по частоте формирования в организме насекомых бактериальных «глыбок») отмечены в парах (блоха - чумной микроб), происходящих с одного участка очаговости, или обитающих на участках со сходными био-ценотическими характеристиками.
Впервые обнаружена возможность установления функциональных конт тактов между чумным микробом и блохами, исторически не контактировавшими с возбудителем (с неочаговых по чуме территорий, внутривидовыми гибридами). Выявлена связь между уровнем флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков у насекомых и их векторной активностью.
Впервые установлено, что инфицированные «неблокированные» особи Citellophilus tesquorum altaicus — основного переносчика в Тувинском природном очаге - способны более 600 суток сохранять чумной микроб и осуществлять его передачу длиннохвостым сусликам. При массовом питании «неблокированных» блох исходом такой передачи является развитие острой генерализованной формы инфекции у зверьков, или подострое течение заболевания с бактериемией, достаточной для заражения насекомых. У чувствительных к возбудителю чумы животных при укусах даже небольшого числа таких блох развивается острая форма чумы с агональной септицемией.
Выявлено, что второстепенные способы передачи чумного микроба инфицированными насекомыми (внесение через поврежденную кожу зверька из раздавленных блох и их экскрементов, при поедании эктопаразитов грызуном) при определенных условиях могут быть не менее эффективными, чем укусы «блокированных» блох, приводить к заболеванию зверьков с генерализацией инфекции и обеспечивать дальнейшую трансмиссию возбудителя.
Впервые показано, что состояние агрегированности чумного микроба в организме переносчика, сопровождающееся изменением морфологии и ультраструктуры микроорганизма, обусловливает не только его способность к блокообразованию и дальнейшей трансмиссии, но и сохранение микроорганизма при неблагоприятных условиях окружающей среды.
На основании изложенных материалов могут быть обоснованы следующие теоретические положения. Первое - трансмиссия чумного микроба в природных очагах Сибири осуществляется преимущественно укусами «не-блокированных» особей массовых видов блох, содержащих конгломераты микроба. Второе - агрегированная форма чумного микроба в организме блох — его особое состояние, определяющее как трансмиссию, так и сохранение микроорганизма в зимний сезон, что обеспечивает непрерывность его циркуляции в сибирских горных очагах и их устойчивость.
Практическая значимость. Работа проведена в рамках выполнения семи научных тем Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока: «Разработка методов борьбы с носителями и переносчиками в плане оздоровления природных очагов чумы Сибири» // № госрегистрации 81004192. - Иркутск, 1985; «Оценка современного состояния сибирских очагов чумы и изучение фактора их устойчивости при проведении оздоровительных мероприятий» // № госрегистрации 01860020801. - Иркутск, 1990; «Изучение роли Л-форм в персистенции чумного микроба в природных очагах Сибири» // № госрегистрации 01860020809. - Иркутск, 1990; «Оптимизация эпидемиологического надзора в сибирских природных очагах чумы» // № госрегистрации 01910033788. -
Иркутск, 1995; «Совершенствование системы эпизоотологического мониторинга в сибирских очагах чумы в связи с обеспечением эпидемиологического благополучия населения» // № госрегистрации 01960000188. - Иркутск, 2001; «Оптимизация методов регуляции численности синантропных членистоногих (блохи, комары, тараканы) в условиях крупного города» // № госрегистрации 01980010186. - Иркутск, 2002; «Популяционно-экологические аспекты природной очаговости чумы в Сибири в связи с ее профилактикой» // № госрегистрации 012000113852. -Иркутск, 2005.
На основании выполненных экспериментальных работ рекомендовано применять противочумным станциям при проведении бактериологического исследования блох и клещей наряду со стандартными средами сухую питательную среду, предназначенную для выделения Л-форм чумного микроба (ЛС). Применение среды ЛС позволило повысить результативность эпизоотологического обследования сибирских очагов чумы на 25-30 %. -
Материалы диссертации включены в нормативно-методические документы федерального и регионального уровней: «Методические рекомендации по повышению результативности исследований эктопаразитов в природных очагах чумы» (Иркутск, 1990), «Паспорт Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2000), Методические указания. «Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих — переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций» (М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002), «Методические рекомендации по эпизоотологическому обследованию Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2004), «Методические рекомендации по лабораторному разведению блох для научных исследований» (Саратов, 2007).
Основные положения, выносимые на защиту
1. В сибирских горных природных очагах чумы, несмотря на их различные характеристики по гостальности и векторности, основным механизмом поддержания энзоотии является трансмиссия чумного микроба инфицированными «неблокированными» блохами.
Блокообразование как специфический способ передачи чумного микроба блохами имеет выраженную сезонную динамику, обусловленную половыми и возрастными особенностями эктопаразитов и адаптацией к ним возбудителя. Наиболее активен этот процесс в пик эпизоотии в природном очаге.
Второстепенные способы передачи чумного микроба блохами могут быть в определенных условиях эффективными и играть существенную роль в циркуляции микроба в природных очагах Сибири.
Возможно установление функциональных контактов между чумным микробом и переносчиками из географически разобщенных популяций (из разных природных очагов), а также между возбудителем и блохами, никогда не контактировавшими с чумным микробом (насекомые с неочаговых территорий и межподвидовые гибриды блох). Адаптация Yersinia pestis к экологическим особенностям блох увеличивает способность микроба приживаться в их организме, о чем свидетельствует связь уровня ФА билатеральных признаков насекомых с частотой блокообразования.
Агрегированность чумного микроба является функцией его адаптации к организму блох и отражает векторную способность переносчиков.
Апробация работы. Результаты исследований представлены на научно-практической конференции «Профилактика природноочаговых инфекций» (Ставрополь, 1983); X конференции Украинского общества паразитологов (Киев, 1986); X Съезде Всесоюзного энтомологического общества (Ленинград, 1989); Региональном Совещании противочумных учреждений по эпидемиологии, эпизоотологии и профилактике особо опасных инфекций (Уральск, 1989); Межгосударственной научно-практической конференции «Организация эпиднадзора при чуме и меры ее профилактики» (Алма-Ата, 1992); Региональной научно-практической конференции «Проблемы природноочаговых инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке» (Чита, 1993); научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998); IV Международном Симпозиуме по блохам (Казахстан, Алматы, 1999); Первой Меж-
13 дународной юбилейной конференции «Актуальные проблемы инфектологии и паразитологии» (Томск, 2001); юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе», посвященной 50-летию Ставропольского НИГТЧИ (Ставрополь, 2002); научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002); Международной конференции «Проблемы современной паразитологии» и III съезде Паразитологического общества при РАН (Петрозаводск, 2003); конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра (Москва, 2004); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ» (Оболенск, 2005); I Всероссийском Совещании по кровососущим насекомым (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Синантропизация растений и животных» (Иркутск, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007).
Личный вклад соискателя. Лабораторные эксперименты и полевые исследования, а также анализ материалов проведены при непосредственном участии автора. На полевые исследования затрачено 275 дней, на экспериментальные (работа с зараженным материалом) - 2006 дней, из них 739 непосредственно в природных очагах чумы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 74 работы, в том числе 34 в научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации материалов диссертаций, 40 — в других журналах, научных трудах и материалах международных, всесоюзных, региональных конференций (на русском, английском, китайском и монгольском языках).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 327 страницах, иллюстрирована 36 рисунками и 60 таблицами. Список использованной литературы включает 496 источников, из них 124 в иностранных изданиях.
Благодарности. Автор признателен за помощь и поддержку администрации и сотрудникам зоолого-паразитологического, эпидемиологического отделов, лаборатории экспериментальных животных Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, специалистам Тувинской противочумной станции. Искренне благодарю Т.И. Ин-нокентьеву, А.Г. Трухину, Ю.Д.Очирова, М.П. Маевского, А.Я. Никитина, А.Ф. Попкова, В.Т. Климова, Д.Б. Вержуцкого, Е.А. Вершинина, В.М. Корзу-на, Е.Г. Токмакову, Е.А. Чипанина, Г.А. Воронову за разнообразную помощь в проведении исследований и подготовке диссертации.
Природный очаг чумы как экологическая система
Основы идей об экологии применительно к природной очаговости болезней заложены Е.Н. Павловским (1947, 1960, 1964). Многие исследователи представляют вполне закономерной экологическую сущность эпизоотического и эпидемического процессов, поскольку микроорганизмы — возбудители болезней являются естественными сочленами биоценозов (Беклемишев, 1956; Беляков, 1983; Korenberg, 1982, 1989; Коренберг, 1985).
Экосистему (совокупность экосистем) как природный очаг болезни характеризует наличие возбудителя (Korenberg, 1982, 1989; Коренберг, 1983, 1985; 1986; Литвин и др., 1998; Литвин, Коренберг, 1999). Паразитарная система, которую трактуют как популяцию паразита со всеми популяциями его хозяев, является составной частью очага как экосистемы (Литвин, Коренберг, 1999). Регуляция паразитарной системы осуществляется как посредством саморегуляции (Балашов, 1972; Коренберг, 1983; Беляков и др., 1987), так и внешними факторами. Экосистемные механизмы регуляции (хищничество, конкуренция в сообществах) прямо или опосредованно воздействуют на популяции микроорганизма - возбудителя и его хозяев (Литвин и др., 1998).
Для микроорганизмов - возбудителей трансмиссивных инфекций характерно обязательное попеременное пребывание в организме позвоночных и членистоногих. Поэтому для них функциональные связи с животными этих групп в одинаковой мере жизненно необходимы (Коренберг, 1985; Duplantier et al., 2005). В любой момент времени отдельные части популяции возбудителей параллельно населяют разные среды обитания. Различают три такие части: гостальную (совокупность возбудителей в организмах теплокровных), векторную (то же в организмах членистоногих переносчиков) и «внеорга-низменную», обитающую вне данных паразитарных систем - в почвах, водоемах, растениях (Литвин, 1983а; Слудский, 1998; Слудский и др., 2003). Каж дая из этих частей генотипически и фенотипически гетерогенна по ряду признаков, в том числе, вирулентности, а их роль в сохранении возбудителя варьирует в разных условиях и разные сезоны (Korenberg, 1989).
Чумной биоценоз как экологическую систему рассматривает Б.Б. Атша-бар (1999). Для природного очага чумы характерна своя эпизоотическая триада: вид грызуна или зайцеобразного — основного носителя, популяция Y. pestis, вид блох - основного переносчика. Паразитарная триада при чуме обнаруживает черты взаимного приспособления, закрепленные в генетическом аппарате каждого из ее членов (Леви, 1985). Основным экологическим механизмом взаимоотношения Y. pestis и его основного носителя в очаге является соответствие между генетически детерминированными уровнями видовой резистентности носителя и вирулентностью популяции чумного микроба, обеспечивающее динамическое равновесие в изучаемой экологической системе чумного биоценоза (Атшабар, 1999). Вариабельность фенотипа возбудителя определяет широкие, но ограниченные потенциалом генома, адаптивные возможности непрерывного существования чумного микроба в сложившемся биоценозе (Анисимов и др., 2001). Наиболее ярко фенотипическая изменчивость микроба проявляется в выражении свойств вирулентности (До-марадский, 1997; Анисимов и др., 2001; Анисимов и др., 2002). Организм переносчика, как гостальный фактор внешней (по отношению к возбудителю) среды, может влиять на вирулентность находящегося в нем возбудителя (Павловский, 1947; Бибикова, Классовский, 1974; McDonough et al., 1993), в том числе путем воздействия бактерицидного фактора (Алексеев и др., 1969, 1972). Смена фенотипа чумного микроба, вызванная изменением уровня экспрессии генов патогенности, находит свое отражение в волнообразном характере течения эпизоотического процесса (Анисимов и др., 2002). Возбудитель чумы как паразит, переходя на ауксотрофный тип питания, теряет возможность размножения и накопления биомассы во внешней среде, что могло бы создать тупиковую ситуацию для сохранения вида. Выходом из этого положения явилось освоение дополнительной экологической ниши - организма блохи, обеспечивающего транспорт возбудителя чумы между различными носителями. Температурный режим холоднокровного (ниже 26 С) является регулятором активности Lcr-оперона, контролирующего синтез Yop-белков. Подавляя синтез белков FI и Тох, такой режим обеспечивает формирование «блошиного» фенотипа с ослабленной вирулентностью, который оказывает минимальное повреждающее действие на организм блохи. Таким образом, фенотип отражает экологические отношения чумного микроба со средой обитания (Анисимов и др., 2002; Anisimov et al., 2004).
Распространение возбудителя зависит, в конечном счете, от наличия необходимых биотических и абиотических условий, которые складываются под влиянием зональных, интразональных и экстразональных явлений (Корен-берг, 1983). Абиотические, в частности температурные, условия оказывают существенное воздействие на возбудителей облигатно-трансмиссивных инфекций, в том числе чумной микроб (Павловский, 1947; Thomas et al., 1993; Hinnebusch et al., 1998a; Han et al., 2004). По мнению В.Ю. Литвина и Э.И. Коренберга (1999), масштабы этого воздействия еще в полной мере не оценены. Одной из приспособительных реакций чумного микроба на смену условий окружающей среды является сдвиг температурного оптимума размножения возбудителя до уровня жизненного оптимума соответствующего вида переносчика. Это подтверждает более частое (в 5 раз) возникновение чумного «блока» у Oropsylla silantiewi при 10 С, чем при 18-22 С (Бибикова, Сахарова, 1956; Бибикова, Классовский, 1974). Такая же особенность отмечена Ю.М. Раллем (1965) у представителей семейства Ceratophyllidae, что свидетельствует о высокой степени взаимоприспособленности эктопаразита и бактерий чумы в холодных высокогорных условиях.
Абиотические факторы (температура и влажность) оказывают значительное влияние и на жизнеспособность блох (Thomas et al., 1993; Fielden et al., 2004). Так, повышение до определенного уровня температуры увеличивает интенсивность откладки яиц самками, но этот же фактор снижает продолжительность жизни эктопаразитов (Самарина и др., 1968; Ващенок, 1988). Оптимальные значения влажности также различны для разных видов блох, определяя географическое распространение видов (Куницкий и др., 1971; Якунин, Куницкая, 1980, 1992; Бурделов и др., 1999).
Чумной микроб паразитирует в организме двух далеко отстоящих друг от друга в таксономическом отношении хозяев, а изучение его взаимоотношений с организмом специфического переносчика имеет не меньшее значение, чем изучение системы возбудитель — носитель (Бибикова, Классовский, 1974). На закономерности существования природных очагов оказывают влияние особенности видов блох, способных сохранять и передавать чумной микроб, их экология и численность (Ващенок, 1999). Роль переносчиков в сохранении чумного микроба и поддержании эпизоотического процесса в разных природных очагах неоднозначна. Наиболее существенна она в тех очагах, где основными носителями являются впадающие в спячку грызуны ш хорошо выражен осенне-зимний межэпизоотический период (Ралль, 1958; Калабухов, 1969; Найден, Петров,1983; Ващенок, 1999; Вержуцкий и др., 2003). У большинства видов блох сусликов фенопериод зимнего гонотрофи-ческого покоя совпадает по времени с периодом зимней спячки хозяев. Часть имаго остается в необитаемых летних гнездах, пребывая в зимний период в состоянии холодового оцепенения и играя при этом роль хранителей инфекции (Крюков, 1984; Белявцева, Брюханова, 2002; Вержуцкий и др., 2003).
Большое значение для распространения чумного микроба имеет миграционная активность блох, которая возрастает во время эпизоотии, сопровождающихся гибелью животных (Ващенок, 1999). Это отмечено для эктопаразитов большой песчанки (Варшавский и др., 1958) и монгольской пищухи (Ващенок, 1962; Машковский, Деревщиков, 1980; Михайлов и др., 1997), повышенная численность их в устьях нор рассматривается в качестве одного из внешних признаков чумной эпизоотии. Изменения характера жизнедеятельности блох, в зависимости от сезона года, могут оказывать влияние на сезонную динамику эпизоотии в природных очагах (Жовтый, 1966; Бондаренко и др., 1979; Ващенок, 1999). О значении этих эктопаразитов в циркуляции чумного микроба свидетельствует и их зараженность возбудителем в естественных условиях. В периоды активных эпизоотии в очагах отмечена более высокая доля зараженных насекомых (Микулин и др., 1960; Шварц, Лаврентьев, 1961; Ващенок, 1962; Шварц, Шиляев, 1963; Куницкий и др., 1967а, 19676; Седин, 1985). Показана прямая зависимость количества переболевших чумой грызунов от общего обилия блох (Бурделов и др., 1989) и связь общего числа выделенных культур чумного микроба с численностью основного переносчика в Тувинском природном очаге (Равдоникас, 1985). Имеются наблюдения о разной степени заблошивленности больных и здоровых зверьков. Так, индексы обилия блох на подобранных трупах тарбаганов и краснохвостых песчанок превышали таковые на отловленных зверьках в 3-10 раз (Тарасов, Тарасова, 1950; Микулин и др., 1960), что определяет возможность инфицирования большого количества насекомых чумой и дальнейшую трансмиссию.
Разведение блох для экспериментальных исследований
Лабораторное разведение насекомых осуществляли в инсектарии Иркутского противочумного института; для отдельных опытов на базе Тувинской ПЧС (Методические рекомендации ..., 1983; Кондрашкина и др., 1984). В качестве прокормителей использовали белых мышей для разведения крысиной блохи X. cheopis, золотистых хомячков - для блох диких грызунов. Белых мышей, которых содержали в садке с эктопаразитами, помещали в спираль из металлической проволоки или надевали на шею животного картонный воротничок круглой формы. Такие способы содержания мышей не позволяют им скусывать и счесывать с себя эктопаразитов. Золотистых хомячков, как мало агрессивных в отношении паразитов животных, содержали в садках с насекомыми свободно.В опытах использовали молодых, питавшихся, но не размножавшихся имаго. Перед заражением насекомых в течение 5-10 дней содержали голодными в банках с увлажненными автоклавированными древесными опилками или прокаленным мелким песком. Применяли два способа заражения блох чумным микробом: естественный и искусственный. При естественном способе эктопаразитов инфицировали на длиннохвостых сусликах, монгольских пищухах, плоскочерепных полевках, белых мышах, в период развития у них атональной бактериемии. Искусственное заражение осуществляли кормлением насекомых на биомембране (шкурка белой мыши) смесью равных частей дефибринированной крови морской свинки и 2 млрд. взвеси чумного микроба из 48-часовой агаровой культуры, выращенной при 28 С.
Для экспериментов отбирали только хорошо напившихся крови насекомых. Зараженность блох после инфицирования определяли контрольным высевом 10-15 особей. Инфицированных эктопаразитов, исходя из условий опыта, подкармливали периодически или содержали на прокормителе постоянно. Подкормку блох осуществляли в большинстве опытов (за исключением отдельных с определенными условиями) через двое суток на фиксированных монгольских пищухах, длиннохвостых сусликах, плоскочерепных полевках или белых мышах. Сусликов выливали из нор водой, пищух и полевок отлавливали с помощью живоловок на неэпизоотической территории природного очага. До экспериментов животных предварительно выдерживали в карантине и исследовали на наличие антител к чумному микробу в реакциях пассивной гемагглютинации (РПГА) и нейтрализации антигена (РНАг). При постоянном содержании эктопаразитов на сусликах и пищухах, зверьков помещали в садок - спираль из металлической проволоки, а при периодических подкормках - фиксировали с помощью специального станка на 1,5-2 часа. На белых мышей в том и другом случаях надевали картонный воротничок, вырезанный в виде 4-конечной звезды, концы которого после надевания его на шею животного стягиваются ниткой вместе, что исключает возможность поедания блох биопробным животным. После каждой подкормки насекомых просматривали под микроскопом при увеличении в 70 раз, «блокированных» особей отделяли от общей партии. Таких блох подкармливали индивидуально или по несколько (1-6) особей. Продолжительность подкормок составляла от 20-30 минут до одного часа, в некоторых случаях «блокированных» насекомых оставляли на грызунах на сутки или содержали постоянно: Между подкормками блохи находились в прокаленном и увлажненном песке при температуре, соответствующей задачам опыта, и относительной» влажности! воздуха 80-93 %.
Активность взаимоотношений чумного микроба с блохами оценивали по-доле особей с «блоком» преджелудка от количества насекомых приї первой, подкормке после заражающего кормления. Кроме этого, по количеству всех эктопаразитов за подкормку со сформировавшимися «глыбками» чумного микроба, что отмечали визуально при микроскопировании имаго после кро-вососания, и по частоте передачи возбудителя животным, использованным для кормления насекомых. Алиментарную активность блох характеризовали по доле пивших особей от числа живых, а смертность — по доле мертвых имаго от общего их количества при каждой подкормке.
Изучение сезонных особенностей трансмиссии чумного микроба блохами. Насекомых между подкормками содержали в подвале (бункере) экспериментальной лаборатории Монгун-Тайгинского эпидотряда Тувинской ПЧС в специально подготовленных нишах, имитирующих гнездовую камеру суслика. Опыты поставлены при температуре от 5 до 27 С и относительной влажности воздуха 89-93 %. Использованы насекомые разных, условно выделенных календарных возрастов: «перезимовавшие», инфицированные летом или осенью предыдущего года и зимовавшие без прокормителя в условиях искусственной норьгдлиннохвостого суслика, и «молодые» — выплода и инфицирования текущего года. Эксперименты, проведенные весной и в начале лета, поставлены с «перезимовавшими» эктопаразитами. В период, когда в природных условиях Тувинского очага регистрируется пик активизации эпизоотического процесса (конец июля - первая декада августа), использованы как «перезимовавшие», так и «молодые» имаго. Осенью опыты проведены с насекомыми выплода текущего года. Группы блох, используемых в данных опытах, состояли преимущественно из особей второго и третьего физиологических возрастов (Прокопьев, 1958; Куницкая, 1960).
Сезонную активность трансмиссии чумного микроба оценивали по следующим показателям: доли «блокированных» блох и насекомых, содержащих возбудителя в агрегированном состоянии; доли инфицированных сусликов и зверьков с генерализованной формой инфекции. Для изучения инфек-циозности укусов «блокированных» блох 1-3 особи ежедневно кормили на суслике в течение 1,5-2 часов, используя для каждой подкормки нового зверька. Между подкормками имаго содержали в подвальном помещении, где температура и влажность воздуха поддерживались в относительно1 стабильном состоянии. Одну группу блох в весеннем опыте (май), содержали в термостате при температуре 22-27 С, исходя из данных О.Ф. Пауллер и В.Е. Мамаева (1954), которые отметили, что в центре жилого гнезда даурского суслика средняя температура за период наблюдений равнялась 26,7 С и колебалась от 16 до 34 С.
Опыты по выявлению длительности сохранения чумного микроба имаго С. tesquorum altaicus проводили по разработанной нами методике (Базанова, 1993). Зараженных имаго на зиму закладывали в стаканчики-гильзы из органического стекла, дно и крышка которых были выполнены из асбестового стерилизующего фильтра, обеспечивающего свободный доступ воздуха. В «гильзах» насекомых помещали в ниши бункера, имитирующие гнездовую камеру суслика. Температуру и влажность в бункере измеряли перед началом опыта, в середине и в момент изъятия насекомых из «гнезда».
Для выявления особенностей накопления и переживания чумного микроба в организме самок и самцов С. tesquorum altaicus подкормки инфицированных насекомых проводили сразу после их заражения - осенью, затем после переживания ими зимнего периода — весной и в первой половине лета. Температура воздуха в бункере за время проведения опыта менялась от + 2 С до -6 С (отмечена в феврале). Между подкормками насекомых содержали: в осеннем опыте (до зимовки) и весной при 5-6 С, летом при 8-10 С. Общая продолжительность эксперимента по выявлению длительности сохранения возбудителя чумы имаго С. tesquorum altaicus составила 692 дня.
Изучение второстепенных способов передачи чумного микроба блохами. Для изучения возможности инфицирования суслика через слизистую оболочку рта при разгрызании и поедании зараженных блох зверьков заражали суспензией, приготовленной из 1-5 особей, которую в объеме 0,1 мл при помощи микропипетки наносили на слизистую рта. Перед заражением грызунов определяли среднее количество микробов чумы в одной инфицированной блохе методом титрования ее суспензии. Более детально методика заражения сусликов рассмотрена в разделе 4.3.1.
Для изучения возможности инфицирования суслика чумным микробом через поврежденную кожу втирали (в предварительно скарифицированную кожу зверька) раздавленных блох или их экскременты. Количество микробных тел, содержащихся в одном переносчике, определяли непосредственно перед заражением сусликов методом десятикратного титрования суспензии насекомых. Экскременты эктопаразитов собирали в стерильные пробирки, в которых размещали по 10 особей сразу после подкормки на интактных животных. Насекомых содержали в пробирках в течение суток, накопившиеся за это время экскременты заливали 0,1 мл физиологического раствора и втирали полученную суспензию в скарифицированную кожу суслика.
Частота и динамика образования «блока» преджелудка
Блохи раздельнополы с выраженными морфофизиологическими различиями между полами. В.А. Геодакян (1982) рассматривает дифференциацию полов как специализацию по главным альтернативным аспектам эволюции: сохранение (женский пол) и изменение (мужской). Выраженный половой диморфизм у блох, очевидно, должен отражаться на эпизоотологической характеристике пола переносчика, т.е. на сохранении и распространении инфекции самками и самцами, однако этот вопрос мало изучен. В лабораторных условиях отмечали ускоренную гибель самцов по сравнению с самками у имаго Ctenophtalmus wladimiri (Косминский и др., 1970), X gerbilli (Куницкий и др., 1971), Callopsylla caspia (Ващенок и др., 1992), С. tesquorum sungaris, F. luculenta (Цэрэнноров, 1999). В эксперименте на кошачьей блохе показано, что самцы более склонны к смене прокормителя, чем самки (Rust, 1994). Установлено, что в лабораторных условиях самцы N. setosa, X conformis и X. cheopis питались чаще, чем самки (Новокрещенова и др., 1968). Выявлено значительно большее потребление кислорода на единицу веса тела самцами, блох суслика, чем самками, что исследователи связали с их большей активностью, главным образом, подвижностью (Кондрашкина, Дудникова, 1962).
На двух видах крысиных блох {Xenopsylla vexabilis hawaiiensis и X. cheopis) установлено, что накопление чумного микроба более активно происходит у самцов (Kartman et al., 1956b). У С. tesquorum ciscaucasicus из Волго-Уральского очага чумы сроки «блокирования» самцов оказались намного короче, а доля «блокированных» самок была выше (Гражданов и др., 1971). У самцов X. cheopis наблюдалась тенденция к более быстрому «блокированию», по сравнению с самками (Hinnebusch et al., 1998а).
Как следует из приведенных примеров, половые различия у блох в бло-кообразовании и трансмиссии чумного микроба не являлись предметом самостоятельного изучения.
Нами проведен анализ результатов многолетних экспериментальных исследований с блохами из природных очагов, а также с X cheopis - классическим объектом опытов по изучению взаимоотношений чумного микроба и переносчика. Для анализа взяты данные 23 опытов. Объем исследованного материала приведен в табл. 4-5. Половые различия во взаимоотношениях самок и самцов блох с чумным микробом определяли по трем показателям: частоте и динамике блокообразования, частоте передачи возбудителя животным.
3.2.1. Частота и динамика образования «блока» нреджелудка Опыты с инсектарной культурой X. cheopis выполнены на базе ЛЭЖ института с использованием белых мышей в качестве прокормителей. В опытах с алтайскими (И-3160 и И-3321) и тувинским (И-2638) штаммами чумного микроба блох заражали и кормили в смешанных группах (самок и самцов вместе), с забайкальским штаммом (И-1986) группы формировали раздельно по полу. Результаты опытов с X. cheopis представлены на рисунке 6.
Первый и второй опыты с X cheopis продолжались с третьей декады июня по первую декаду августа. Для заражения использованы два штамма Y. pestis: И-3160 (инфицировано 70 $ и 26 S) и И-3321 (207 $ и 181 в)- При инфицировании блох штаммом чумного микроба И-3160 частота возникновения «блока» у самок составила 12,9, у самцов — 23,1 %, а штаммом И-3321 — 10,1 и 40,9 % соответственно. У зараженных штаммом И-3160 среди самцов отмечено почти вдвое больше особей с «блоком», но различия не достигали достоверного уровня (t=l,23, Р 0,05). Доля самцов, «блокированных» возбудителем чумы штамма И-3321, достоверно превышала долю таких самок (t=7,03, Р 0,001). В обоих опытах первые самки со сформировавшимся «блоком» преджелудка отмечены на пятые, самцы - на седьмые сутки. Последние «блокированные» особи обоих полов выявлены на 21 сутки (конец опыта). Наибольшая доля самцов с «блоком» отмечена на 7-10, самок - на 21 сутки от начала эксперимента. Совместно в двух опытах (без учета штамма) у самцов формирование «блоков» преджелудка регистрировали чаще, чем у самок (t=7,23, Р 0,001).
Третий опыт с раздельным содержанием самок и самцов J cheopis (161 $ и 171 $), инфицированных штаммом чумного микроба И-1986, поставлен в тот же период. Самок с «блоком» преджелудка регистрировали, начиная с 16 суток, до конца опыта (43-и сутки), самцов — с восьмых по 22 сутки. Доля «блокированных» самок составила 7,5 %, самцов - 9,9 %. Достоверных половых различий в частоте блокообразования не установлено, однако некоторое увеличение этого показателя прослеживается в группе, состоящей из самцов.
Четвертый опыт по заражению X cheopis (105 $ и 104 с ) штаммом И-2638 провели в марте. «Блокированных» самцов начали выявлять уже после первой подкормки. В дальнейшем блох с «блоком» преджелудка отмечали после каждой подкормки. Последние «блокированные» самцы зарегистрированы после пятой подкормки (18 сутки), самок с «блоком» преджелудка выявляли до конца эксперимента (25 сутки). Всего таких особей отмечено 40 (38,1 %) среди самок и 52 (50 %) среди самцов. Количество самцов с «бло 102 ком» превышало количество самок, но различия между ними по данному показателю недостоверны (t=l,73; Р 0,05).
Таким образом, в опытах с X. cheopis формирование «блока» предже-лудка у самцов происходило или достоверно чаще, чем у самок, или отмечалась тенденция к повышению среди них доли «блокированных» особей.
В опытах с A. primaris primaris (табл. 8, 15), как уже упоминалось, весной у самцов процесс блокообразования начинался и заканчивался немного раньше (8 и 20 сутки после заражения), чем у самок (11 и 26 сутки); самцов с «блоком» выявлено 7,5 %, самок-4,5 % (t=l,19; Р 0,05).
Заражение носителя при контакте с субстратом гнезда, инфицированным трупами и экскрементами блох
Такое заражение возможно при раздавливании на теле животного инфицированных насекомых или попадании их выделений. Количество вносимых при этом микробов увеличивается при расчесах, так как создается большая, чем при укусах зона нарушения поверхности кожи. Расчесы у животного может провоцировать введенный блохами в ранку укуса секрет слюнных желез, который обладает аллергенными свойствами (Ващенок, 1988).
В проведенных нами опытах перед заражением сусликов накожным методом у зверьков выщипывали небольшой (диаметром до 1,0 см) участок кожи на брюшке и слегка скарифицировали его. Для инфицирования использовали насекомых с зараженностью 80 %. Всего в опыт взято 40 грызунов: 20-ти из них втирали в кожу суспензию двух или трех раздавленных эктопаразитов, а 20 заразили экскрементами, собранными при содержании инфицированных блох в стеклянной пробирке в течение суток после подкормки.
При заражении сусликов втиранием в кожу раздавленных насекомых с одной блохой вносили около 100 тысяч микробных клеток. Из 20 зверьков, инфицированных подобным способом, у десяти зарегистрирована генерализованная форма инфекции, закончившаяся гибелью животных на четвертые -седьмые сутки. У четырех сусликов отмечена затяжная форма чумы. Зверьки пали на 12-13 сутки с выделением возбудителя из какого-либо одного органа: селезенки, печени или легких. У одного из них зарегистрирована неинтенсивная бактериемия. Существенной разницы в гибели грызунов при втирании инфекционного материала от двух или трех блох не выявлено.
Во втором опыте использовали для заражения экскременты, полученные после первой и второй подкормок блох. В первом случае в инфицированном материале содержалось около 800 микробных клеток, во втором - около 400. Из 10 сусликов, зараженных экскрементами, собранными после первой подкормки имаго, шесть грызунов погибли на четвертые - девятые сутки от генерализованной формы чумы. У двух, павших на девятые сутки, зарегистрирована неинтенсивная бактериемия: возбудитель чумы выделен у одного из печени и крови, у другого - из легких и крови. Во втором случае из 10 зверьков два пали от генерализованной инфекции на седьмые сутки; у трех отмечена затяжная форма инфекции с неинтенсивной бактериемией; возбудитель чумы выделен из легких, селезенки, печени и крови. Из 20 грызунов, инфицированных втиранием в кожу экскрементов блох, заболели чумой 13.
Таким образом, в опытах при проникновении возбудителя через поврежденную кожу из раздавленных насекомых передача инфекции зарегистрирована 14 сусликам из 20 (70 %), а из выделений имаго - 13 из 20 (65 %). У заболевших зверьков отмечена как затяжная форма инфекции с неинтенсивной бактериемией, так и генерализованная, с атональной септицемией, что позволяет предположить вероятность инфицирования питающихся на таких особях насекомых. Генерализация инфекционного процесса отмечена у 10 (71,4 %) сусликов, заболевших после втирания в кожу раздавленных блох и у восьми (61,5 %) - после втирания выделений блох; частота генерализации инфекции в данном случае не различалась (t=0,54, Р 0,05).
Полученные данные свидетельствуют, что второстепенные способы передачи чумного микроба с участием блох могут вызывать заболевание чумой у сусликов с частотой, не отличающейся от передачи через укусы этих эктопаразитов, причем как «неблокированных», так и «блокированных»:
Наиболее вероятным субстратом для сохранения чумного микроба в почве нор являются экскременты инфицированных блох и трупы этих насекомых. Изучению этого вопроса посвящены работы К.И. Кондрашкиной и Л.Н. Величко (1976, 1980, 1981, 1984, 1994). Возможный механизм заражения грызунов при контакте с инфицированным субстратом - через дыхательные пути при рытье нор. Н.П. Коннов с соавт. (1984а, 19846) подчеркивают роль блох - «здоровых» носителей, - которые во время дефекации выделяют во внешнюю среду бактериальные «глыбки» и тем самым обсеменяют ее живы 138 ми, защищенными от неблагоприятных воздействий внешней среды бактериями. Таким способом инфицированные имаго могут заражать как шерсть зверька - хозяина, так и его убежище — гнездо. Отмечен факт заболевания белой мыши при контакте с сухим инфицированным субстратом, содержащим зараженные чумой трупы и экскременты блох (Величко, 1981).
Возможность заражения длиннохвостого суслика из Тувы при контакте зверька с субстратом гнезда, инфицированным экскрементами и трупами чумных С. tesquorum altaicus, ранее не исследовалась.
Заражающее кормление имаго, использованных в дальнейшем для инфицирования субстрата гнезда, проводили на больных экспериментальной чумой сусликах в период интенсивной бактериемии. После заражения насекомых неоднократно подкармливали на здоровых зверьках и в период между подкормками содержали в субстрате, состоящем из равных частей песка и мелких опилок. Затем оставляли трупы блох и сухие фекалии насекомых в субстрате, на котором содержались зараженные эктопаразиты, на длительное хранение. Сухой, инфицированный возбудителем чумы субстрат, был использован для заражения сусликов. Он служил животным подстилкой в 10-литровой стеклянной банке. В банке с инфицированным субстратом грызунов оставляли на сутки, а затем пересаживали в другую — с чистой подстилкой, где содержали до гибели. Поставлено три опыта.
Первый опыт проведен весной, в мае. Блохи, инфицировавшие субстрат, заражены в сентябре предыдущего года. Субстрат, использованный для исследования на наличие чумного микроба и заражения сусликов, хранился в бункере (подвале экспериментальной лаборатории) в течение 240 суток. Суспензией из субстрата заразили 30 мышей, из них 12 - внутрибрюшинно и 18 — подкожно. Для заражения через контакт с субстратом использовали девять сусликов. Субкультура выделена от одной мыши, инфицированной внутрибрюшинно. Мышь захлороформирована на девятые сутки. Возбудитель чумы выделен из печени и селезенки. Заражения сусликов весной не произошло.
Второй опыт проведен в июле. Блох, содержавшихся в субстрате, заражали в июне предыдущего года. Субстрат, инфицированный экскрементами и трупами имаго, сохранялся в условиях искусственной норы длиннохвостого суслика в течение 402 суток. Суспензией субстрата инфицировали подкожно пять белых мышей, две мыши пали на третьи-седьмые сутки от септической чумы. При контакте с субстратом заразились чумой два суслика из шести. Один из них пал на 10 сутки от генерализованной формы инфекции. Суспензией органов второго суслика инфицировали белую мышь, у которой с помощью ППН зарегистрирована иммуноаллергическая перестройка.
Третий опыт проведен в августе. Блохи, находившиеся в субстрате, инфицированы в июне предыдущего года. Субстрат хранился в условиях искусственной норы 427 суток. При заражении подкожно суспензией субстрата пяти мышей получены отрицательные результаты бактериологического и серологического исследования. Для заражения через контакт с субстратом использовано 10 сусликов. У одного из них, павшего на шестые сутки, возбудитель чумы обнаружен в легких и крови. У биопробы (белая мышь), инфицированной суспензией органов второго суслика и убитой хлороформом на 14 сутки после заражения, выявлена в РНАт фракция I чумного микроба.
В результате проведенного исследования выявлено, что возбудитель чумы после длительного пребывания вне живого организма (в наших экспериментах 240-427 суток) сохранил свою вирулентность. Об этом свидетельствует заражение сусликов при контакте с инфицированным субстратом.
Необходимо отметить, что во время проведения весеннего опыта (в мае), при наличии возбудителя чумы в субстрате, о чем свидетельствуют заражение биопробы и получение 42 культур от трупов блох, инфицирования сусликов не произошло. В летнее время (июль-август), в период активизации эпизоотического процесса в природном очаге, через контакт с субстратом гнезда заразились чумой четыре из 16 зверьков, взятых в опыт в данный период. У двух из них зарегистрирована генерализованная форма инфекции. При этом зараженность трупов насекомых чумным микробом была гораздо ниже, чем весной (11,9 % против 21,4%). Этот факт может свидетельствовать о сезонной чувствительности длиннохвостого суслика к заражению чумным микробом аспирационным путем.
