Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ПОНЯТИЕ ОБ АДАПТАЦИИ 10
1.1. Общие представления об адаптации 10
1.1.1. Поведенческая адаптация 10
1.1.2. Защитное поведение 15
1.2. Влияние условий среды на поведенческую адаптацию крыс 18
1.3. Эндогенные факторы и механизмы поведенческой адаптации крыс 19
1.3.1. Нейрофизиологические механизмы 22
1.3.2. Роль нейромедиаторов в регуляции поведения 25
1.4. Серотонинергическая система мозга и поведение 28
1.4.1. Нейроанатомическая организация серотонинергической системы мозга млекопитающих 28
1.4.2. Роль серотонина в регуляции интегративной деятельности мозга животных 32
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 39
2.1. Экспериментальные животные 39
2.2. Методы поведенческих экспериментов 39
2.3. Направленное фармакологическое вмешательство в активность серотонинергической системы 43
2.4. Статистическая обработка данных 47
ГЛАВА 3. АКТИВНАЯ ПОВЕДЕНЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ МЕДИАННОГО ЯДРА ШВА 50
3.1. Оборонительное поведение 50
3.2. Поведенческие и вегетативные показатели, определяющие характер оборонительного поведения 54
3.2.1. Двигательная активность 54
3.2.2. Уровень тревоги и эмоциональная реактивность 56
3.3. Сопряженные изменения активности холинергической системы 60
3.3.1. Амнезия навыка пассивного избегания 60
3.3.2. Тревожность и эмоциональная реактивность у животных с амнезией 64
3.3.3. Снижение эффективности напоминания 69
ГЛАВА 4. ПАССИВНАЯ ПОВЕДЕНЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ ПОСЛЕ ДЕСТРУКЦИИ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ МЕДИАННОГО ЯДРА ШВА 75
4.1. Общая характеристика поведения крыс в условиях «открытого поля» 75
4.1.1. Реакция на действие новизны окружения 75
4.1.2. Привыкание к условиям «открытого поля» 79
4.1.3. Стрессоустойчивость крыс с разными стратегиями поведения в «открытом поле» 81
4.2. Поведение крыс в условиях «открытого поля» после разрушения
5 НТ нейронов MNR 85
4.2.1. Устойчивость к умеренному эмоциональному стрессу 85
4.2.2. Габитуация в «открытом поле» 88
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ПОВЕДЕНИЕ КРЫС В «ОТКРЫТОМ ПОЛЕ» 91
5.1. Устойчивость к умеренному эмоциональному стрессу 91
5.2. Габитуация в условиях «открытого поля» 98
5.3. Особенности реагирования животных с деструкцией 5-НТ нейронов MNR на действие среды измененной адаптивным поведением других особей 101
5.4. Обучение условной реакции пассивного избегания крыс с разными стратегиями поведения в «открытом поле» 105
ВЫВОДЫ 109
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 111
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 149
Введение к работе
Актуальность исследования. Проблема поведенческой адаптации -одна из основных в экологии, поскольку именно этот процесс определяет возможности организма или популяции по обеспечению жизнедеятельности и выживания в изменяющихся условиях внешней среды (Уоддингтон, 1970; Майр, 1974; Грант, 1980). Приспособительное поведение тесно связано с освоением информационного ресурса среды (Владимирова, Мозговой, 2006), в связи с чем, комплексный анализ приспособительного поведения, формируемого млекопитающими в ответ на получение ими сведений о состоянии среды обитания, является важнейшей задачей современной экологии.
Поведенческая адаптация, являясь наиболее гибкой и разнообразной по форме, предохраняет организм от неблагоприятных последствий периода разрушения старых программ. По мнению В.П. Казначеева (1980), её элементы присутствуют на всех этапах адаптационного процесса. Однако механизмы поведенческой адаптации остаются не достаточно изученными. Их исследование тесно связано с представлениями о тревоге, как одном из факторов изменяющих характер поведения и разрушающих недостаточно адаптивные поведенческие стереотипы, замещая их более адекватными формамим (Астапов, 1992; Dixon, 1998; Калуев, 2003). Фактором, запускающим любой вид защитного поведения, является страх (Попова, 1999).
В результате многочисленных исследований направленных на понимание нейронной основы поведенческой адаптации стала очевидной роль ряда нейромедиаторов, в том числе серотонина (5-НТ). Он вовлекается в формирование различных компонентов адаптивного поведения: мотивационных, эмоциональных, двигательных, механизмов подкрепления (Молодцова, 2002; Базян, 2003; Морозова, 2003; Вишнивецкая, Скринская, 2005; Науменко с соавт., 2005; Томиленко, 2005; Graef, 1980; Peck,
7 Vanderwolf, 1991; Jhou, 2005), тревожного состояния и обучаемости (Миковская, 2001; Castellano, 1996; Micheu, 1999; Andrade, 2004), а также стресс-реагирования (Пшенникова, 2003; Семенова и др., 2000; Lown, 1980; Chaouloff, 1993; Inoue, 1994; Chung, 1994; Andrade, 2005; Storey et al., 2006). Однако, имеющиеся в литературе данные о роли отдельных компонентов серотонинергической системы крайне противоречивы, особенно это касается роли медианного ядра шва (MNR) (Tanaka, 1972; Lorens, 1976; Ogren, Ross, 1977; Andrade, 2005; Jhou, 2005). В этом случае еще более очевидной становится важность исследования роли 5-НТ нейронов MNR в реализации механизмов поведенческой адаптации.
Цель исследования. Основной целью работы является изучение влияния условий среды и повреждения серотонинергических нейронов медианного ядра шва на поведенческую адаптацию. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
изучить влияние повреждения серотонинергических нейронов медианного ядра шва на ассоциативное обучение крыс;
исследовать воздействие умеренного стресса на поведение крыс с повреждением и без повреждения серотонинергических нейронов медианного ядра шва;
установить влияние повреждения серотонинергических нейронов медианного ядра шва на габитуацию;
выявить влияние условий экспериментальной среды на поведение крыс с повреждением и без повреждения серотонинергических нейронов медианного ядра шва.
Научная новизна работы. Впервые показано разнонаправленное влияние разрушения серотонинергических нейронов медианного ядра шва на активную и пассивную формы поведенческой адаптации. Продемонстрировано изменение активности холинергической системы в результате деструкции серотонинергических нейронов медианного ядра шва. Установлено, модулирующее влияние разрушения серотонинергических
8 нейронов медианного ядра шва на чувствительность крыс к действию экспериментальной среды. Выявлены особенности обучения животных с разными стратегиями поведения в «открытом поле», а также влияние среды измененной адаптивным поведением других особей на адаптивные реакции крыс в условиях умеренного стресса и габитуацию в «открытом поле».
Научно-практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о нейрофизиологических механизмах формирования поведенческой адаптации и являются важными для фундаментальных исследований адаптивных возможностей организма. Результаты исследования могут учитываться для понимания патогенеза дезадаптации и тревожных расстройств. Поведение животных с повреждением серотонинергических нейронов медианного ядра шва в указанных условиях может служить экспериментальной моделью для тестирования новых анксиолитических препаратов. Результаты работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических и лабораторных занятий по курсам «Физиология человека и животных», «Физиология центральной нервной системы», «Физиология высшей нервной деятельности», «Психофизиология», «Экологическая физиология», «Экология человека» для студентов биологического факультета АлтГУ. Результаты исследования внедрены в учебный процесс Московского психолого-социального института, используются в лекционном материале и практических занятиях по курсам «Зоопсихология», «Этология». Положения, выносимые на защиту:
Разрушение серотонинергических нейронов медианного ядра шва оказывает разнонаправленное влияние на активную и пассивную формы поведенческой адаптации.
Дефицит функции серотонинергических нейронов приводит к усилению стрессорного воздействия новизны, а также снижает чувствительность животных к действию среды, содержащей ольфакторные следы адаптивного поведения других особей.
3. Пребывание в среде, измененной адаптивным поведением других особей, изменяет реакцию на умеренный стресс и облегчает габитуацию.
Личный вклад соискателя. Соискателем были выполнены анализ литературы по теме исследования, планирование и проведение экспериментов, статистическая обработка и анализ полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты были доложены и обсуждались на XIX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004; V Сибирском физиологическом съезде, Томск, 2005; XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии, посвященного памяти академика Л.А. Орбели и 50-летию Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, Санкт-Петербург, 2006.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 общим объемом 0,2 печ. л. в рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и 21 таблицей, включает введение, 5 глав, выводы, приложения, список цитированной литературы из 359 наименования, из которых 180 иностранных.
Поведенческая адаптация
Процесс адаптации строго индивидуален, поскольку каждый организм обладает своим генетически детерминированным, филогенетически приобретенным, уникальным физиологическим диапазоном толерантности, определяющим переносимость действующих на него факторов (Меерсон, 1981; Unger, 1982; Шуберт, 1988; Тушмалова, 2000; Кулаковский, 2004).
В основе процесса адаптации высокоорганизованного организма к любой деятельности лежит формирование целостной и абсолютно специфичной функциональной системы (Павлов, Кузнецова, 1998; 2000; Павлов, 1999; 2000 Павлов с соавт., 2001). Неспецифическое звено адаптации (Селье, 1960; Гаркави с соавт., 1977; 1979; Goring, 1982; Hecht, 1982; Павлов, 2000), являясь неотъемлемым компонентом любой функциональной системы, также определяет специфику его реагирования (Павлов, 2000). Обязательным условием полноценного формирования функциональной системы является постоянство или периодичность действия на организм относительно стандартного, неизменного комплекса средовых факторов (Шуберт, 1988).
Приспособление к повторяющимся экстремальным условиям среды осуществляется либо путем изменения активности, ведущего к толерантности, либо уклонением от воздействия при помощи специфических приспособлений - избегание стресса. Что в совокупности создает устойчивость к стрессу упругого (обратимого) и пластического (необратимого) характера (Шуберт, 1988). При адаптации к продолжительно действующим экстремальным условиям среды в ответ на воздействие стрессора, развивается избыточная реакция, которая становится стабильной и ведет к состоянию устойчивой приспособленности (Schiewer, 1982). Таким образом, проблема адаптации - одна из основных в экологии, поскольку именно этот процесс определяет возможности организма или популяции по обеспечению деятельности и выживания в изменяющихся условиях внешней среды.
Все множество адаптационных механизмов может быть условно подразделено на филогенетическую, популяционную, онтогенетическую, физиологическую, биохимическую и поведенческую адаптации (Лабутин, 1970). Поведенческая адаптация, являясь наиболее гибкой и разнообразной по форме, привлекает пристальное внимание исследователей, однако механизмы поведенческой адаптации остаются не достаточно изученными.
Важнейшим компонентом комплекса адаптационных реакций, является поведенческая адаптация, предохраняющая организм от неблагоприятных последствий периода разрушения старых программ (Лабутин, 1970). Мысль о приспособительной роли поведенческих актов животных в новых условиях существования, была высказана еще в 1882 г. Д. Романесом в книге «Ум животных» (Дьюсбери, 1981). Попытки установления соответствия между усложнением поведения и морфологией мозга в филогенезе были предприняты еще в первой половине XIX века Ф. Кювьером. Позже А.Н. Северцов (Северцов, 1939) рассматривал поведение, как высший тип адаптации к внешним условиям, связанный с прогрессивным развитием ЦНС. По мнению А.Н. Северцова с появлением высокоразвитой психики возросли темпы эволюции, и главную роль в приспособлении стала играть поведенческая адаптация (Северцов, 1961), имеющая много форм, элементы которой присутствуют на всех этапах адаптационного процесса. Детально представления об адаптивном поведении разработаны А.Д. Слонимом (Слоним, 1986). Изучение широкого ряда форм взаимодействия в системе организм - среда, привело А.Л. Черняховского к мысли о том, что реакции привыкания и адаптации, являются разными стадиями единого процесса (Черняховский, 1983). Это совпадает с мнением В.И. Медведева о том, что поведенческую адаптацию нельзя выделять из общей структуры адаптационного процесса, т.к. она является одним из звеньев единой системы приспособления регуляторных механизмов гомеостаза (Медведев, 2003).
С экологической точки зрения различные формы индивидуального и коллективного поведения могут рассматриваться как адаптации, дающие результаты, не имеющие аналогов в комплексе морфо-физиологических адаптации, которые, оказывая влияние на вероятность выживания особи и оставления ею потомства в данных условиях, поставляют материал для действия факторов эволюции (Уоддингтон, 1970; Майр, 1974; Грант, 1980), расширяя тем самым спектр адаптации вида, особенно на уровне популяции. Поведенческие адаптации проявляются в случаях избегания неблагоприятных условий, при поиске и добывании пищи, бегстве и защите от врагов. При этом врожденное поведение реализуется быстро, стереотипно и безошибочно, приобретенные формы лабильны и могут модифицироваться при изменении условий среды.
Поведенческие адаптации доминируют в начальный период адаптационного процесса (стадия превентивной адаптации) выполняя защитную функцию, общий смысл и направленность которой заключается в ограничении всех форм воздействия неблагоприятного адаптогенного фактора (Медведев, 1982), с учетом дальнейшего развития событий, то есть работают в режиме прогнозирования. Причем, чем раньше особь распознает назревающую ситуацию, тем более совершенно ее поведение. П.К. Анохин назвал такую способность предвидения «опережающим отражением действительности» реализуемым в механизме условного рефлекса (Анохин, 1968). Это согласуется с точкой зрения В.К. Лабутина (1970), о важной роли ориентировочного рефлекса в формировании целенаправленного поведения у высших животных.
На основании поведенческих и физиологических исследований, проведенных на крысах и мышах (Bonus, 1987), а также на осьминогах, форели, цыплятах, телятах, свиньях, макаках резусах и человеке (Koolhaas, 1999) было сформулировано представление об активной и пассивной стратегии адаптации, обладающих равным приспособительным потенциалом. Еще в первой половине века было показано доминантное наследование пассивно-оборонительных реакций у собак, что принято считать показателем его адаптивного значения (Дьюсбери, 1981), и независимость типа оборонительной реакции от силы нервной системы (по Павлову) (Крушинский, 1991).
Методы поведенческих экспериментов
В качестве метода, дающего возможность оценить поведение крыс на основе его ориентировочно-исследовательского компонента, широко используется тест «открытого поля» (ОП) (Забродин, 1983, 1989). В этом тесте различные уровни двигательной активности (горизонтальной и вертикальной) и эмоциональности (элементы вегетативной активности и формы замещенного поведения) отражают определенное функциональное состояние тех или иных отделов нервной системы, что может быть довольно тесно связано с другими формами поведения (Гуляева, 1997). Впервые данная методика была предложена Холлом (Hall) в 1934 году. Животных по одному высаживали на огороженную площадку размером 100 х 100 см, разделенную на квадраты 10x10 см. Площадка освещалась лампой, находящейся над центром площадки на высоте 70 см. Высадка производилась ежедневно в течение трех дней, на 3 мин.
Для исключения возможности ориентации животных в момент высадки, их предварительно помещали в деревянную коробку размером 15 х 15x20 см, открытую с одной стороны и опускали в центр экспериментальной площадки открытой стороной вниз, через 30 секунд коробку снимали, одновременно пускали секундомер. После тестирования каждого животного делалась уборка экспериментальной площадки, так как животные легко ориентируются по запаху, что могло отразиться на их исследовательском поведении.
При тестировании в «открытом поле» регистрировались следующие показатели: количество пересеченных квадратов (горизонтальная двигательная активность), количество переходов в стойку на задних конечностях (вертикальная двигательная активность), высокий и низкий уровень эмоциональности определяли по высокому (4-5) и низкому уровню дефекации (0-1) (Корочкин, Михайлов, 2000). Также отмечался латентный период выхода из центра экспериментальной площадки, куда первоначально помещалось животное.
Исследование ассоциативного научения. Учитывая, что важной характеристикой адаптивных возможностей животных является их способность к обучению, изучение условно-рефлекторной деятельности животных стало основным приемом при исследовании поведенческой адаптации. Удобной моделью для изучения активной адаптации служит условная реакция пассивного избегания (УРПИ), вырабатываемая на основе однократного подкрепления. Она обладает достаточной прочностью и позволяет точно установить время введения в мозг информации. Поэтому данная методика широко применяется для изучения временных параметров развития устойчивости условной связи к амнезирующим воздействиям.
Выработка УРПИ производилась по методике модифицированной для крыс (Jarvik, Корр, 1967). Обучение с первой попытки возможно благодаря особенностям эмоциональной памяти, главными из которых являются: быстрота формирования, особая прочность и непроизвольность воспроизведения. Реакция пассивного избегания связана с торможением какой-либо активности (безусловной или условной) путем включения «наказующего» раздражения мозга. Возможность выработки УРПИ основывалась на естественном стремлении грызунов к темноте. Экспериментальная камера трапециевидной формы состояла из двух отделений: освещенного «безопасного», выполненного из оргстекла (размеры 6,5 см у основания и 26 см у верхнего края; длина 21 см), и темного «опасного», выполненного из непрозрачного материала, с такими же размерами, но длиной 30 см. Темный отсек закрывался светонепроницаемой крышкой. Светлый освещался лампой, находящейся в центре на высоте 55 см. Пол в обоих отделениях был выполнен из металлических пластин, на которые в опасном отделении мог подаваться электрический ток. Отделения соединялись между собой отверстием.
Животное высаживалось в безопасное отделение хвостом к отверстию. Регистрировалось время пребывания в светлом отделении до перехода в темное «опасное» отделение, а также время поворота головой к входному отверстию, количество побежек из темного в светлый отсек и обратно, дефекация и уринация. В течение первых трех дней переход животного в темный отсек не сопровождался наказанием. На четвертый день освоения пространства экспериментальной камеры (фамилиризации), после того как крыса полностью осуществила переход в «опасное» отделение, на пол подавался электрический ток (0,75 мА), действовавший до обратной побежки в «безопасное» отделение (1,5-3,5 с). Следует отметить, что побежка у животных сопровождалась голосовыми реакциями, а в некоторых случаях дефекацией и уринацией. Выработка условной реакции избегания на этом заканчивалась, и крыса сразу удалялась из камеры. Для проверки выработки и сохранения УРПИ животные через 24 и 48 часов вновь помещались в безопасное отделение камеры и наблюдались в течение 180 секунд. Критерием обучения служил латентный период перехода (ЛП) из «безопасного» отделения в «опасное». Условную реакцию считали выработанной, если ЛП перехода составлял не менее 180 с, необучившимися считались животные с ЛП перехода от 2 -30 с (Молодцова, 2002). Формирование ретроградной амнезии. Амнезия навыка УРПИ достигалась изменением активности холинергической системы путем снижения активности АХЭ, для чего животным за 20 мин до обучения УРПИ вводили галантамин (пр-во «Гедеон Рихтер», ВНР) в дозе 10мг/кг, внутрибрюшинно (Мартынов, Бессонова, 1982). Для инъекций препарат растворяли в дистиллированной воде.
Оборонительное поведение
Способность к запоминанию информации при ее однократном предъявлении является важнейшим показателем приспособительной деятельности живых организмов.
Успешность этого процесса определяется возможностями особи в ранжировании информации и формировании адекватной ответной реакции (Лоскутова, 2003). Выработка у экспериментальных животных условной реакции пассивного избегания (УРПИ) сопряжена со стрессовым воздействием новизны окружения и болевого раздражителя. Результат такого обучения во многом может зависеть от индивидуальной стрессоустойчивое и базовой тревожности животных.
Нужно отметить, что попытки исследования роли отдельных компонентов серотонинергической системы в процессах обучения предпринимались неоднократно. Однако, имеющиеся в литературе данные крайне противоречивы, особенно это касается роли MNR (Tanaka, 1972; Lorens, 1976; Ogren, Ross, 1977; Andrade, 2005; Jhou, 2005). В этом случае еще более очевидной становится важность получения собственных данных о роли 5-НТ нейронов MNR в реализации механизмов активной поведенческой адаптации.
С этой целью нами использован метод локальной микроинъекции специфического нейротоксина 5,7-DHT, вызывающего обратимую функциональную дегенерацию 5-НТ нейронов и снижение уровеня 5-НТ на 59-97% (Gatelly, 1986; Chung et al., 1999; Graeff, 2002; LeMaitre, 2005; Romano, 2006). Для защиты НА нейронов животным предварительно вводили ингибитор обратного захвата норадреналина — ДМИ.
Основываясь на литературных данных, обучение животных начинали на 14 день после введения токсина, т.к. именно в этот период наблюдается наиболее полная дегенерация 5-НТ нейронов (Anden et al., 1966; Andrade et al, 2004).
Известно, что крысы Wistar отличаются нарушением ассоциативной способности при однократном обучении (Лоскутова, Колосова, 2000). В наших исследованиях снижение уровня 5-НТ введением 5,7-DHT в MNR улучшает способность крыс к ассоциативному научению, облегчая выработку условно-оборонительной реакции. Сопоставление степени обученности оперированных и контрольных животных приведены на рис. 4.
В группе с деструкцией 5-НТ нейронов MNR наблюдается увеличение доли обучившихся животных.
Особенности выработки условной реакции пассивного избегания у периода (ЛП) перехода в опасное отделение экспериментальной камеры при тестировании через 24 ч. после обучения в группе оперированных животных (229,06±25,82) в сравнении с контролем (185,08±36,13, р 0,01), что позволяет сделать вывод об улучшении способности к ассоциативному научению у крыс с разрушенными 5-НТ нейронами MNR. Достоверность различий оценивалась при помощи непараметрического критерия Мана-Уитни (U-тест), поскольку применение одновыборочного теста Колмогорова-Смирнова продемонстрировало достоверное отличие характера распределения данного показателя от нормального (р 0,05).
Данная тенденция обнаруживается и при тестировании сохранения УРПИ через 48 часов. Значимые коэффициенты корреляции ЛПі с ЛП24, ЛП48 (г = + 0,33; г = + 0,33), и ЛП,ИП (г = + 0,32), а также ЛП2 с ЛП48 (г = + 0,24) и ЛПнал (г = + 0,22) при р 0,05 также свидетельствуют о сохранении стратегии поведения после выработки УРПИ, т.е. животные, изначально реагировавшие на помещение в экспериментальную камеру замиранием и длительным латентным периодом перехода в безопасный, на данном этапе, темный отсек характеризуются лучшим обучением, у них лучше как воспроизведение, так и сохранение УРПИ.
Наблюдаемое нами облегчение выработки навыка пассивного избегания, не связано с изменением чувствительности к электрическому току, т. к. согласно литературным данным снижение уровня мозгового серотонина не изменяет у крыс порога неприятных ощущений при периферическом раздражении электрическим током, но усиливает реактивность на стимуляцию шокового характера, (Fibiger et al., 1972; Hole, Lorens, 1975).
