Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ПОВРЕЖДАЮЩИХ ФАКТОРОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ МОРФОЛОГИЮ ПОЧКИ
1.1 Структура и онтогенез почки
1.2 Закономерности эволюционной динамики выделительной системы 23
1.3 Реактивные изменения структурных компонентов почки под действием различных повреждающих факторов 28
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Структурные и морфометрические показатели почки у пренатально алкоголизированного 15-ти дневного потомства крыс и на фоне применения антиоксидантов 43
3.2 Структурные и морфометрические показатели почки у пренатально алкоголизированного 30-ти дневного потомства крыс и на фоне применения антиоксидантов 70
3.3 Структурные и морфометрические показатели почки у пренатально алкоголизированного 60-ти дневного потомства крыс и на фоне применения антиоксидантов 87
Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 102
ВЫВОДЫ 130
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Структура и онтогенез почки
- Структурные и морфометрические показатели почки у пренатально алкоголизированного 15-ти дневного потомства крыс и на фоне применения антиоксидантов
- Структурные и морфометрические показатели почки у пренатально алкоголизированного 60-ти дневного потомства крыс и на фоне применения антиоксидантов
Введение к работе
Экологически дестабилизированная среда (Лукьянова, Лукьянов, 2004) ставит перед фундаментальной и прикладной экологией конкретные задачи изучения влияния различных экзотоксикантов на организм и его системы в развитии у различных систематических групп и представителей различной экологической специализации. В последние годы уделяется внимание изучению влияния экотоксикантов на структуру и функции организма, на динамику численности популяций, функциональную морфологию репродуктивной системы, ассимиляционный и диссимиляционныи аппарат животных и растений (Моисеенко, 1987, Михайлова, 1991, Лепилина, Романов, 2005, Мазина, 2005, Граф и соавт., 2006, Михайлова и соавт., 2006).
Отчетливо выделяется онтогенетический аспект таких исследований, поскольку один и тот же повреждающий фактор химической, биологической или физической природы в организме животных разного возраста может вызвать широкий спектр изменений от компенсаторно-приспособительных адаптивных реакций до развития отчетливых патологических процессов с нарушением системогенеза, структуры, метаболизма и функций.
Изучение изменений развития почки - органа, играющего ведущую роль в обеспечении выделительной, детоксикационной функции организма, является необходимым. Это связано с тем, что большинство работ по исследованию влиянию токсических факторов опирается на анализ анаболических процессов. В то же время состояние диссимиляторного аппарата в процессе обеспечения детоксикации и выживания представляется не менее важным и существенным.
Почки являются одним из органов, регулирующих постоянство внутренней среды организма. Они играют активную роль в биотрансформации большинства токсических веществ, активно участвуют в их метаболизме и выведении из организма. В большинстве случаев выведение токсических веществ и продуктов их распада осуществляется почками посредством фильтрации, секреции и экскреции с участием
5 сложных трансферних систем. Этим объясняется выведение почками ядов, не растворимых в воде токсических веществ и накопление в структурах почки концентраций, превышающих таковые в плазме крови.
Широкое участие почек в превращении токсических веществ в организме создает условия для обширного и продолжительного контакта этих веществ с почечными структурами, В ряде случаев повышенная концентрация, изменение химического состава и физических качеств приводит к выраженному в различной степени и разнообразному поражению её структуры и возникновению патологических состояний. Непосредственное поражающее действие токсических веществ - результат собственной токсичности вредного вещества и продуктов его распада или получение в почках запредельных концентраций и контактов.
Одним из токсических веществ является этанол. Элиминация этанола осуществляется в неизменном виде и путем биотрансформации, которая происходит в печени. До 90 % принятого алкоголя окисляется в цитозоле гепатоцитов с помощью специфического фермента алкогольдегидрогеназы в присутствии НАД до ацетальдегида (Шабанов, Калишевич, 1998). Ацетальдегид является веществом более токсичным, чем этанол. Кроме того, альдегиды очень чувствительны к действию окислителей, при этом реакции окисления могут носить цепной характер с образованием в качестве промежуточных продуктов радикалов (Маркизова и соавт.,2004).
Особого внимания заслуживает способность этанола проникать через плацентарный барьер, накапливаться в околоплодной жидкости и тем самым циркулировать в крови плода, оказывая повреждающее действие на его системы и органы. Особенности биотрансформации этанола в организме плода и Ешворожденного обусловлены тем, что у эмбрионов АДГ отсутствует, а у плода его активность очень низкая, поэтому гидроксилирование этанола в их печени не происходит, либо осуществляется в незначительной степени. Таким образом, большое значение имеет исследование пренатальной алкогольной интоксикации на закономерности
постнатального органогенеза и функциональную морфологию органов и тканей.
Доказан нефротоксический и мутагенный эффект этанола (Бородий, 1986, Кирющенков, Тараховский, 1990), его тератогенное и эмбриотоксическое действие (Бариляк, 1980, Скосырева, 1982,1993, Таболин и соав., 1988). Отмечена зависимость между употреблением алкоголя матерью и увеличением внутриутробной гибели плодов, отставание в физическом развитии, нарушением морфогенеза различных органов, замедленным постнатальным развитием.
Токсичность спиртов определяется активностью их радикалов, образующихся в реакции с нормальными промежуточными продуктами метаболизма. В литературе появились сообщения о возможном образовании свободных радикалов через реакцию альдегидоксидазы с ацетальдегидом (Feihman, Lieber, 1999, Mantle, Preedy, 1999, Jokelainen, 2001,). Ацетальдегид является токсичным веществом, способным к образованию адцуктов с белками и нуклеиновыми кислотами, вызывая образование антител, инактивацию ферментов, нарушение репарации ДНК. Кроме того, он способен снижать уровень восстановленного глутатиона (Степанова и соавт., 2003). Антиоксиданты или антиокислители представляют собой биологически активные вещества различной химической природы, способные тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических веществ молекулярным кислородом. При этом изучено протективное действие некоторых антиоксидантов при алкоголизме (Паньшин и соавт., 2000, Черданцев и соавт., 2002, Polideri, Frei ,1998).
Таким образом, представляется важной проблема изучения влияния этаноловой интоксикации на развивающийся плод. В последние годы появились работы по изучению влияния алкоголя на эмбрионы крыс с целью изучения повреждающего действия этанола на становление и развитие некоторых систем органов (Самусева, 2002, Курч, 2004). Однако сведений о хроническом пренатальном воздействии алкогольной интоксикации на почки
7 пренатально алкоголизированного потомства и её коррекции недостаточно. Помимо этого, изучение протективного влияния некоторых антиоксидантов может лечь в основу разработки мер и критериев для использования данных веществ в коррекции изменений, вызванных употреблением этанола в период гестации.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Омского государственного педагогического университета» «Влияние повреждающих факторов на организм и его развитие» (№ гос. регистрации 01 9 10 011014).
Цель исследования:
Выявить влияние пренатальной хронической этаноловои интоксикации крыс на развитие потомства на примере нефроногенеза и обосновать возможность протективного действия антиоксидантов.
Задачи:
Определить влияние пренатальной хронической этаноловои интоксикации на морфометрические показатели потомства на различных стадиях постнатального развития (15,30,60 суток).
Выявить изменения закономерностей органогенеза (на примере почки) у пренатально алкоголизированного потомства.
Выявить влияние пренатальной хронической интоксикации на репродукцию эпителия нефронов.
Установить возможное протективное действие антиоксидантов в избранных экспериментальных условиях.
Научная новизна работы.
Впервые на экспериментальном материале выявлено влияние хронической этаноловои интоксикации у крыс на развитие потомства в онтогенетическом аспекте. Установлены стойкие структурные и морфометрические изменения массы тела, почки как органа и её структур с изменением характера корреляций. Показано длительное увеличение пролиферативной активности нефроцитов как часть адаптивных реакций иа повреждение. Выявлено ограниченное протективное действие аминокислот -
предшественников глутатиона и витаминов - антиоксидантов на развитие компенсаторно-приспособительных процессов Научно-практическая значимость.
Полученные экспериментальные данные углубляют и расширяют сведения о влиянии токсикантов на систему «мать-внезародышевые органы-плод», детализирует конкретные сведения о действии этанола на развитие потомства и закономерности органогенеза. Выявлено определенное протективное действие аминокислот-предшественников глутатиона и комплекса витаминов-антиоксидантов. Материалы диссертации используются в курсах «Общая экология», «Зоология позвоночных», «Цитология», «Гистология с основами эмбриологии», при выполнении студентами выпускных квалификационных работ на химико-биологическом факультете ГОУ ВПО «Омского государственного педагогического университета», на кафедре патологической анатомии Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет», на кафедре гистологии, цитологии, эмбриологии и медицинской биологии ОГМА.
Основные положения, выносимые на защиту:
Хроническая пренатальная этаноловая интоксикация у крыс вызывает длительное нарушение развития потомства: снижение массы тела, массы почки, увеличение смертности, увеличение мертворожденности.
Хроническая пренатальная этаноловая интоксикация вызывает длительные и стойкие («импринтинг», «структурный след») изменение размеров и структуры почки, её клубочкового и канальцевого аппарата, пролиферативной активности нефроцитов, что отражает нарушение закономерностей нефрогенеза.
Применение антиоксидантов на фоне хронической этаноловои интоксикации оказывает определенный и ограниченный протективный эффект.
9 Апробация работы
Материалы диссертации доложены на III конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на V межрегиональной конференции, посвященной 25-летию наркологической службы Омской области «Актуальные вопросы наркологии» (Омск, 2004), на Всероссийской научной конференции «Морфологические науки - практической медицине», посвященной памяти А.А. Никифоровой (Омск, 2004), на научном семинаре химико-биологического факультета, (Омск, 2004), на I и II Международных эмбриологических симпозиумах «Закономерности эмбриофетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийск, 2004,2006), на Всероссийской конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2006).
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 30 рисунков, 30 микрофотографий и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Библиографический указатель содержит 250 отечественных и 90 иностранных источников литературы.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура и онтогенез почки
Среди органов, обеспечивающих сохранение относительного постоянства внутренней среды, в детоксикации организма почки играют наиболее значительную роль. Удаление из организма конечных продуктов обмена веществ (клубочковая фильтрация, реабсорбция, активная секреция) осуществляется в высшей степени специализированными структурно-функциональными единицами почки - нефронами.
Огромное количество нефронов, их сложная архитектоника, гетерогенное строение и гетерохрония развития, богатое микроциркуляторное русло, обширные пути венозного и лимфатического дренажа, наличие специфического эндокринного аппарата регуляции гемодинамики, многообразие интра- и экстраренальных нервных связей изучается многими авторами (Зуфаров, Гонтмахер, Хидоятов, 1974, Маждраков, Попов, 1980, Полачек., 1980, Длоуга, Кршечек, Наточин, 1981, Наточин, 1982, Мельман, Шутка, 1983,1988, Серов, 1983, Рябов, Ракитянская, Шутко, 1989, Романенко, 1990, Цибель, Раевская, 1991, Вальковий, Соловьев, 1997, Зайцев, 1999, Вандер, 2000, Акмаев и соавт., 2001, Okada, Morikawa, 1993, Gulbis, 1996, Magras, 1997, Abrahamson, 1998).
Почки млекопитающих представляют собой парный орган бобовидной формы, который расположен забрюшинно по обеим сторонам поясничного отдела позвоночника. Вогнутая поверхность почки называется воротами почки. Через ворота проходят нервы, почечная артерия, вена и лоханка с мочеточником.
Для нормальной фиксации почек большое значение имеют окружающая их жировая капсула (capsula adiposa renis) и почечная фасция (fascia renalis). Почка одета непосредственно соединительнотканной оболочкой - capsula fibrosa renis. Ворота почки ведут в центрально расположенную полость -почечную пазуху (sinus renalis). Здесь располагаются большая часть почечной лоханки и её большие и малые чашечки, кровеносные сосуды, лимфатические сосуды и нервы.
На фронтальном разрезе в почке отчетливо выделяются 2 различных по цвету и строению вещества: наружное, корковое, cortex renis и внутреннее, мозговое, medulla renis.
Нефроны классифицируются в соответствии с расположением их почечных телец в корковом веществе. В суперфициальных корковых нефронах почечные тельца расположены в пределах 1 мм от капсулы и образуют первый слой. В интракортикальных нефронах почечные тельца расположены в средних отделах коры почки. Почечные тельца юкстамедуллярных нефронов расположены над границей между корковым и мозговым веществом (Вандер,2000).
Кровь попадает в каждую почку через почечную артерию, которая разделяется на более мелкие ветки - междольковая, дуговая, радиальные артерии коркового вещества. Каждая радиальная артерия изменяет свое направление и представляется в виде афферентных артериол. Гломерулярные капилляры сливаются и образуют эфферентные артериолы. Эфферентные артериолы разделяются на перитубулярные капилляры, которые в виде разветвленной сети распределяются вокруг канальца. Затем перитубулярные капилляры объединяются с образованием вены, по которой кровь в конечном итоге покидает почку.
Кровоснабжение мозгового вещества отличается от соответствующей системы в корковой зоне почки. Из юкстамедуллярных клубочков длинные эфферентные артериолы направляются в наружную часть мозгового вещества, где они многократно делятся с образованием сосудистых пучков. От границы пучков берет начало капиллярная сеть, которая окружает петли Генле и собирательные трубки в наружной части мозгового вещества. Из центральной части пучков нисходящие прямые сосуды направляются к внутренней части мозгового вещества, где они также образуют капиллярные сплетения. Эти капилляры внутреннего мозгового вещества дают начало восходящим прямым сосудам, которые располагаются в тесном взаимодействии с нисходящими прямыми сосудами в пределах сосудистых пучков.
Иннервация почек осуществляется из двух источников: эфферентная -симпатические нервы исходят из торако-люмбального отдела симпатической нервной системы, парасимпатическая - нервные волокна проходят в составе задних корешков спинного мозга. Симпатические и парасимпатические нервные окончания достигают почечных телец и обнаруживаются под базальной мембраной эпителия почечных канальцев, а также встречаются среди клеток ЮГА. Они иннервируют стенки артериальных сосудов. Сеть тонких нервных волокон имеются также в фиброзной капсуле почек. (Зуфаров, Гонтмахер, Хидоятов, 1975, Мельман, Шутка, 1988, Бойчук, 1997, Рябов, Наточин, 1997, Акмаев, 2001).
Согласно морфофункциональной классификации (Семченко, 1999), в нефроне выделяют следующие отделы: почечное тельце (Corpusculum renale), состоящее из клубочка (Glomerulus) и окружающей его капсулы (Capsula glomerularis), представленной наружной (Paries externus) и внутренней (Paries interims) стенкой, проксимальный извитой (Tubulus contortus proximalis) и проксимальный прямой (Tubulus rectus proximalis) канальцы; тонкий каналец (Tubulus attenuatus), включающий нисходящую часть (Pars descendens) и восходящую часть (Pars ascendens) и формирующий петлю нефрона (Ansa nephrica), дистальный прямой (Tubulus rectus distalis) и извитой (Tubulus contortus distalis) каналец. Собирательные трубки, несмотря на тесное функциональное единство с нефроном, к нему не относятся. Это связано с тем, что нефрон формируется из нефрогенной ткани, а собирательная трубка развивается из того же эмбрионального зачатка, что и эпителий мочевыводящих путей (Волкова и соавт., 1996).
Структурные и морфометрические показатели почки у пренатально алкоголизированного 15-ти дневного потомства крыс и на фоне применения антиоксидантов
К 15-ти суткам в почках у крысят обнаруживаются сформированные нефроны, хотя активные морфогенетические процессы еще продолжаются. В данный период отмечается увеличение длины нефронов, которая в суперфициальных нефронах возрастает за счет удлинения проксимального канальца, а в юкстамедуллярных - за счет большого роста тонкого сегмента .
Толщина коркового слоя у двухнедельных животных составляет 8,1 ± 0,5 мкм (рис.5), в нем наблюдаются запустевшие почечные тельца - 4,2±0,9% (рис.4). Величина почечных телец увеличивается в направлении от суперфициальной к кжстамедуллярной зоне. Эти различия количественных изменений клубочкового аппарата нефронов разных генераций связаны с гетерохронией их развития. Так, площадь почечных телец у 15-ти дневных интактных животных неодинакова в трех зонах и составляет 1432,6±113,8 мкм в суперфициальной зоне, 1740,6±138,4 мкм в интракортикальной и 2993,2±208,4 мкм2 в кжстамедуллярной зонах (табл.2).
Проксимальные канальцы интактной почки имеют площадь 501,3±48,4 мкм , выстланы однослойным призматическим эпителием, площадью 408,5 ± 112,4 мкм2, имеют узкий неровный просвет, площадь просвета канальца составляет 10,8±1,2 мкм. Проксимальные нефроциты имеют высокопризматическую форму, мутную цитоплазму и ядро, приближенное к базальному полюсу клетки (рис.7).
Площадь тонкого канальца петли нефрона значительно меньше площади проксимального канальца и составляет 101,4±5,5 мкм2. Тонкий каналец выстлан однослойным плоским эпителием, напоминающим по морфологическому строению эндотелий кровеносных сосудов. Площадь просвета тонкого канальца равна 28,1±2,9 мкм , а площадь его эпителия -73,3±3,0 мкм". Толстый прямой каналец значительно толще тонкого, его площадь составляет 305,7±16,1 мкм2. Он выстлан эпителием кубической формы, площадью 210,7±19,3 мкм . Площадь просвета толстого канальца составляет 95,0±5,8 мкм2.
По сравнению с проксимальным, дистальныЙ каналец уже (площадь канальца составляет 431,7±83,2 мкм2), имеет широкий просвет (площадь просвета канальца - 102,4±31,4 мкм2). Очертания просвета ровные, нефроциты имеют низкопризматическую форму, светлую цитоплазму и центрально расположенное ядро.
В почках интактных 15-ти дневных крысят митозы встречаются во всех генерациях канальцев; наиболее часто митозы регистрируются в проксимальных канальцах и составляют 0,70 ±0,16 %о, наиболее редко в тонком канальце - 0,20±0,08%о (рис.6).
Соединительная ткань у крысят развита слабо, в основном в мозговом слое и сосочке (рис.8).
/ экспериментальная группа животных
Пренатальная алкогольная интоксикация оказывает значительное влияние на развитие потомства в постнаталыюм онтогенезе.
Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о выраженном влиянии пренатальнои алкогольной интоксикации на показатели смертности крысят: количество плодов в этих пометах было достоверно снижено в 2,8 раза (р 0,05) по сравнению с интактным потомством.
Структурные и морфометрические показатели почки у пренатально алкоголизированного 60-ти дневного потомства крыс и на фоне применения антиоксидантов
К двум месяцам постнатального развития крысы достигают стадии половозрелости. В 4,1 раза увеличилась масса тела и в 3,7 раза - масса почек по сравнению с двухнедельными животными и в 1,5 раза и в 1,3 раза соответственно по сравнению с 30-ти суточным возрастом (рис. 36,37). Увеличение массы почек происходит за счет продолжающегося увеличения размеров сосудистых и канальцевых структур: площадь почечных телец увеличилась на 56,2%; площадь проксимальных и дистальных канальцев - на 29,9%о и на 32,2% соответственно по сравнению с двухнедельным возрастом (рис.42,43). Площадь канальцев петли нефрона значительно возросла и превысила таковые показатели в двухнедельном возрасте в тонком отделе на 41,5%о, в толстом - на 37,6% (табл.4). Толщина коркового слоя увеличилась в 2,0 раза по сравнению с двухнедельным и в 1,3 раза по сравнению с 30-ти суточным возрастом (рис. 38). 92
У пренатально алкоголизированных животных масса тела и абсолютная масса почек достоверно ниже контрольных значений на 25,1% и на 20,9% соответственно (р 0,05), несмотря на то, что прирост массы тела в сравнении с 30-дневным возрастом составил 36%, а массы почек - на 35,8% (рис.36,37).
Толщина коркового слоя почки снижена на 14,4% по сравнению с контрольными показателями, в то время как в двухнедельном возрасте это снижение составляло 34,5%, а в возрасте 30 суток- 6,5%(рис.38). Количество почечных телец на тестовую площадь у данной группы животных в этом возрасте достоверно уменьшилось на 25,6% (р 0,001), при этом количество запустевших почечных телец остается высоким и составляет 13,6%, что в 5,3 раза выше нормы (рис.39,40).
Отмечается расширение мочевого пространства почечных телец, отсутствие содержимого в нем. Характерной особенностью морфологической картины почек в этом возрасте являются стойкие изменения канальцевого аппарата нефрона. Наблюдаются очаговые некрозы проксимальных и дистальных нефроцитов, десквамация эпителия в просвет канальца, кариопикноз и кариолизис. Отмечена дилатация канальцев петли нефрона. Имеются очаги скопления интерстициальных клеток вокруг канальцев и почечных телец (рис.44,45,46).
Морфометрические показатели почечных телец подчиняются той же закономерной динамике, которая прослеживалась на протяжении всего постнатального онтогенеза у пренатально алкоголизированного потомства крыс.
Во всех зонах коркового вещества почки площадь почечных телец достоверно (р 0,05) уменьшается: в суперфициальной зоне - на 11,6%, в интракортикальной - на 18,8%, в юкстамедуллярной - на 26,1%. В целом площадь почечных телец в этой группе уменьшилась на 20,3%.
