Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Внутривидовая изменчивость растений 8
1.2. Адаптация растений 11
1.3. Физиологические адаптации 17
1.3.1 Всхожесть - как адаптация к выживанию вида 19
1.4. Биохимические адаптации 21
1.4.1. Системы обеспечения надежности ДНК и репарация генетических повреждений 21
1.4.2. Состав и функциональная активность хроматина и уровень нуклеиновых кислот в растениях 23
1.4.3. Роль антиоксидантных систем при действии стресса на растения 24
1.4.4. Ферментативные антиоксиданты 26
1.4.5. Естественные антиоксиданты 29
1.5. Адаптация растений при действии радиации 31
1.6. Влияние внутривидового адаптационного потенциала на радиочувствительность растений 36
2. Материал и методики 40
2.1. Описание растений, которые использованы в работе 40
2.2. Лабораторный посев семян 41
2.3. Облучение семян 41
2.4. Анализ кривых «доза-эффект» 42
2.5. Метод флуктуирующей асимметрии (ФА) 43
2.6. Определение количества низкомолекулярных антиоксидантов в проростках (НМАО) 45
2.7. Комплексный цитолого-биохимический метод дифференциальной оценки активности генома в процессах репликации, трансляции, репарации и его общей устойчивости 47
2.8. Определение активности пероксидазы 51
2.9. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) 52
2.10. Цитологический анализ 53
2.11. Дозиметрирование 55
2.12. Статистическая обработка результатов 55
3. Результаты и обсуждение 56
3.1. Изменения годовой и индивидуальной всхожести семян резухи вислоплодной, полыни чернобыльник и лебеды раскидистой и влияние их вариабельности на радиочувствительность 56
3.1.1. Всхожесть семян по сезонам и деление на группы 56
3.1.2. Суммарное содержание низкомолекулярных и активность ферментативных антиоксидантов в проростках полыни чернобыльник, лебеды раскидистой и резухи вислоплодной 64
3.1.3. Вариабельность всхожести семян и содержания низкомолекулярных антиоксидантов в клетках проростков резухи вислоплодной, полыни чернобыльники лебеды раскидистой 67
3.1.4. Радиочувствительность семян полыни чернобыльник, лебеды обыкновенной и резухи вислоплодной 69
3.2. Внутривидовые изменения физиолого-биохимических пара метров проростков березы растопыренной и влияние их на радиочувствительность 76
3.2.1. Внутривидовые изменения физиолого-биохимических параметров проростков березы растопыренной 76
3.2.2. Значения расчетных коэффициентов (каоз, крсп, кош, ку|) клеток корневой меристемы проростков березы растопыренной 79
3.2.3. Радиочувствительность березы растопыренной 81
3.3. Влияние вариабельности физиологических и цитолого- биохимических характеристик на радиочувствительность экоформ лебеды раскидистой и полыни чернобыльник 85
3.3.1. Характеристика среды обитания экоформ лебеды раскидистой и полыни чернобыльник
3.3.2. Выживаемость проростков, антиоксидантная защита, общая активность генома клеток разных экоформ лебеды раскидистой и полыни чернобыльник
3.3.3. Вариабельность ряда признаков и цитолого-биохимических характеристик экоформ лебеды раскидистой и полыни чернобыльник
3.3.4. Радиочувствительность экоформ лебеды раскидистой и полыни чернобыльник
3.4. Влияние вариабельности физиологических и цитолого-биохимических характеристик на радиочувствительность ольхи кустарниковой, произрастающей в условиях повышенного естественного радиационного фона
3.4.1. Влияние повышенного естественного радиационного фона на массу семян и их всхожесть
3.4.2. Физиологические и цитолого-биохимические характеристики семенного потомства ольхи кустарниковой, произрастающей в условиях ПЕРФ 107
3.4.3. Вариабельность коэффициентов антиоксидантной защиты, общей активности генома, репарации, общей относительной устойчивости генома клеток и радиочувствительность ольхи кустарниковой
Выводы 123
Использованная литература ] 25
- Внутривидовая изменчивость растений
- Метод флуктуирующей асимметрии (ФА)
- Суммарное содержание низкомолекулярных и активность ферментативных антиоксидантов в проростках полыни чернобыльник, лебеды раскидистой и резухи вислоплодной
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время в радиобиологии накоплен достаточно большой материал по влиянию экзогенных и эндогенных факторов среды и свойств самой биологической системы на радиочувствительность организмов [Кудряшов, Беренфельд, 1982; Кузин, 1987; Гродзинский,1989; Бурлакова,1994]. Известно также, что радиоустойчивость вида зависит от предшествующей адаптации к действующим стресс-факторам среды. При этом установлено, что ответ биологических систем на относительно невысокие дозы облучения обусловлен активацией защитных систем: антиоксидантных и/или ДНК-репарационных, а на высокие дозы - уязвимостью генома, связанной со степенью его конформационной диспергированности, пропорциональной, в свою очередь, общей активности генома в процессах репликативного и репаративного синтеза ДНК и направленных на трансляцию [Журавская, 2001]. Однако не все факты, выявленные экспериментально, объясняются этой моделью.
Влияние факторов среды на внутривидовое разнообразие изучается давно [Шварц, 1963; Мамаев, 1972; Семкина, 1985], но большая часть работ посвящена исследованию реакций отдельных организмов на действие температур, различных солей и других раздражителей, на морфологическом и анатомическом уровнях [Веселова и др., 1993; Захаров, 2000]. Вариабельность (гетерогенность) биологической системы - результат изменчивости (лабильности) биологических подсистем - является важнейшим фактором обеспечения устойчивости биосистемы, её способности к самоорганизации и адаптации [Чернавский, 2004]. Однако исследований, посвященных изучению влияния внутрипопуляционной вариабельности растений (на уровне физиологических, биохимических и др. свойств), существующих в экстремальных условиях среды, на их радиочувствительность, очень мало [Журавская и др., 2003; 2005].
Цель исследования: выявить влияние вариабельности физиолого-биохимических свойств дикорастущих растений, сформированных в результате адаптационного процесса в условиях криолитозоны, на радиочувствительность их семенного потомства.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучить, в сезонной динамике, вариабельность индивидуальной
всхожести семян, активности низкомолекулярных и ферментативных
антиоксидантов проростков резухи вислоплодной (Arabis pendula L.), полыни
чернобыльник {Artemisia vulgaris L.) и лебеды раскидистой (Atriplex patala),
произрастающих в Центральной Якутии, и связь вариабельности этих
свойств с радиочувствительностью семян.
2. Определить внутривидовое разнообразие всхожести семян,
активности антиоксидантных систем и генома клеток проростков березы
растопыренной (Betula divaricata Ledrb.) и связь вариабельности этих свойств
с радиочувствительностью семян.
Установить связь вариабельности выживаемости проростков, активности антиоксидантных защитных систем и генома клеток проростков различных экоформ лебеды раскидистой и полыни чернобыльник с радиочувствительностью их семян.
Установить связь вариабельности всхожести и массы семян, выживаемости проростков, активностей антиоксидантных и геномных систем клеток с радиочувствительностью семян ольхи кустарниковой (Duschekia fruticosa Rupr), произрастающей в условиях ПЕРФ.
Рабочая гипотеза. Радиоустойчивость дикорастущих растений, произрастающих на протяжении нескольких поколений в условиях интенсивного действия определённого (климатического, радиационного) стресс-фактора среды, определяется не только адаптивными изменениями их антиоксидантных и геномных систем, но и вариабельностью этих защитных систем. В этом, по-видимому, заключается экологическое
7 радиобиологическое значение внутрипопуляционного разнообразия организмов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Высокие амплитуда колебаний сезонных изменений всхожести семян
дикорастущих растений, внутрипопуляционная вариабельность их
индивидуальной всхожести семян и выживаемости проростков являются
показателями их большей популяционной радиоустойчивости.
2. Внутрипопуляционная вариабельность систем антиоксидантной
(ферментативной и низкомолекулярной) защиты, общей устойчивости и
дифференциальной активности генома в процессах репликации, репарации
ДНК и направленных на трансляцию, определяет радиоустойчивость
популяций дикорастущих растений, адаптированных к разным
экологическим условиям произрастания.
Научная новизна работы. Доказано фундаментальное значение внутрипопуляционной вариабельности физиологических и биохимических свойств дикорастущих растений в формировании радиоустойчивости популяции.
Практическая значимость работы. Полученные в работе закономерности по связи радиоустойчивости популяций дикорастущих растений с вариабельностью физиолого-биохимических признаков могут быть использованы при проведении экологической экспертизы в целях оценки состояния биоты и выдачи прогноза ее жизнеспособности при действии физических стресс-факторов.
Внутривидовая изменчивость растений
Изменчивость - ключ к эволюции. Изменчивость - один из основных атрибутов живых организмов, принципиально отличающих их от однообразных неживых объектов, причем атрибутов такого же значения и масштаба, как "обмен веществ", "размножение", "наследственность" и т. д. Эволюционный процесс может идти только в том случае, если в данной популяции имеются особи с самыми различными характеристиками. Пока в популяции есть животные и растения, наделенные различными свойствами, некоторые из них будут приспосабливаться к среде обитания лучше остальных. Существует два типа подобной изменчивости - наследственная и ненаследственная. Ненаследственную изменчивость вызывает воздействие окружающей среды -например, отсутствие достаточного количества пищи у животного или света у растения. Наследственная изменчивость определяется некими врожденными свойствами, передающимися от поколения к поколению [Шварц, 1963; Мамаев, 1969; Семкина, 1969].
Само понятие " изменчивость " достаточно расплывчато и понимается по - разному. Великий Дарвин [1859], говоря об изменчивости и рассматривая ее как один из двух важнейших факторов эволюции, тем не менее не дал классификации ее явлений, поскольку нечетко представлял все их разнообразие. Он оперировал общим термином "вариация".
Сейчас чаще всего под изменчивостью понимают индивидуальную изменчивость, т. е. различия между отдельными особями в пределах вида. С другой стороны, выделяют групповую изменчивость, точнее внутривидовой полиморфизм, когда в пределах вида имеются значительно отличающиеся друг от друга группы особей (породы, сорта, подвиды, формы, клоны и пр.). Именно в этом смысле, как отмечал советский генетик Ю. А. Филипченко [1978], говорят, что куры изменчивее павлинов или индеек, собаки изменчивее кошек и т. п. Ю. А. Филипченко справедливо утверждал, что в понятие изменчивости входит два различных элемента - статический (изменчивость как состояние) и динамический (изменчивость как процесс возникновения различий). Он говорил также, что "изучение изменчивости идет от статики, требующей применения вариационно - статистического метода, к групповой, а затем к изменчивости как процессу". В 1972 г. на основе литературных данных и собственных исследований свердловский ботаник, директор Ботанического сада УрО РАН, член - корреспондент РАН С. А. Мамаев выделил 6 основных форм изменчивости, а именно индивидуальную, половую, временную (хронографическую, экологическую, географическую и гибридогенную. Несколько позднее им была выделена и эндогенная изменчивость, понимаемая как изменчивость одновозрастных структур в пределах одного организма. По мнению некоторых исследователей, именно с эндогенной изменчивости и должно начинаться изучение изменчивости вообще, поскольку она позволяет "в чистом виде" выявить те различия между генетически однородными и одновозрастными структурами (тканями, органами и т. д.) одного растения, которые обусловлены исключительно различным действием внешних факторов, но никак не связаны ни с фактором времени, ни с генотипически-ми различиями. По сути дела, эндогенная изменчивость весьма близка к экологической, так как вызвана большей частью действием именно факторов внешней среды на генетически однородный материал. Изучение эндогенной изменчивости, другими словами, позволяет в известной степени смоделировать экологическую [Мамаев, 1969; Конина, 1979; Ветчинникова, 1980; Сем-кина, 1985; Махнев, 1987].
На примере фотосинтетических пигментов у кактуса была установлена их эндогенная изменчивость, связанной с различиями в возрасте тканей растения. Например, в детках содержание пигментов выше, чем в молодых тканях материнского растения, а в них, соответственно, в 2 - 3 (до 5-6) раз выше, чем в нижележащих старых тканях 4 - 5 - летнего возраста [Скулкин, 1995].
Изучение внутривидовой изменчивости растений ex situ позволило установить значительно возрастающую скорость мутационного процесса в условиях культуры. В интродукционных популяциях по сравнению с естественными устойчивыми популяциями все факторы эволюционного процесса (кроме естественного отбора) действуют во много раз интенсивнее, вследствие чего геномы интродукционных популяций значительно отличаются от исходных видов, что приводит к ускорению процесса видообразования растений (ГБС РАН). Важным фактором служат почвенные условия. Например, солянка Рихтера, растущая на песках, дает около 1 % алкалоидов, а выросшая на глинистой почве содержит лишь их следы. У культивируемых растений отмечается повышение содержания алкалоидов при внесении азотсодержащих удобрений. Имеет значение и внутривидовая (индивидуальная) изменчивость. Наблюдается значительная разница в содержании алкалоидов у растений одного вида, растущих в одинаковых условиях, зависящая от индивидуальных свойств растений. У 19 образцов из второго модального класса нитрогеназная активность изменяется в интервале 100 - 200 мкг Ы2/кгЧ ч.
Метод флуктуирующей асимметрии (ФА)
Для определения НМАО отбирали определенную навеску массы проростков (0,3-0,5 г.) и гомогенизировали ее в ступке. Экстракцию проводили 3-6 мл 50%-ного водного раствора этанола. При этом экстрагировались как гидрофильные (аскорбат, мочевая кислота, тиомочевина, SH-аминокислоты, белки-акцепторы 02 и др.) так и липофильные (сс-токоферол, убихиноны, каротиноиды и др.) антиоксиданты. Экстракты центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g.
Метод определения суммы антиоксидантов основан на окислении антиоксидантов хлоридом железа (III). При этом хлорид железа (III) восстанавливается до хлорида железа (II), количество которого определяется по интенсивности окраски при добавлении о-фенантролина при длине волны 490-510 нм. Однако методика определения суммы НМАО не учитывает реакцию комплексообразования некоторых НМАО (например, фенолов) с ионами Fe +, которая вносит свой вклад в величину оптической плотности, что приводит к искажению результатов определения суммарного содержания АО. В связи с этим была применена модифицированная методика [Журавская и др., 2001; Шаройко и др., 2002]. Для более точного определения концентрации НМАО, ввели наряду с раствором сравнения №1, содержащего избытки хлорида железа (III) и о-фенантролина, раствор сравнения (№2), содержащий избыток хлорида железа (III) и анализируемый раствор антиоксидантов. Раствор сравнения № 2 учитывает процесс комплексообразования фенольных антиоксидантов с ионами Fe3+. Раствор сравнения №1 готовили один раз перед серией измерений и вводят в память процессора спектрофотометра, так как он учитывает оптическую плотность комплекса, образованного реактивами - [о-фенантролин]з Fe , постоянную на протяжении всех измерений. Раствор сравнения №2 готовили перед каждым измерением оптической плотности, так как в каждой пробе содержатся различные концентрации АО.
Раствор сравнения №1 готовили следующим образом. В кварцевую кювету (L=l см) вносили 0,2 мл 0,2%-ного раствора хлорида железа (III) в 96%-ном этаноле, 0,2 мл 0,5%-ного раствора о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 2,6 мл 96%-ного этанола. Перемешивали содержимое кюветы и измеряли величину оптической плотности при А-=510 нм на спектрофотометре DU-650 фирмы Beckman (США).
Измерение /\D5io опытной пробы совмещали с измерением ADSIO раствора сравнения №2. В кювету (L = 1 см) вносили 0,2 мл 0,2%-ного раствора хлорида железа (III) в 96%-ном этаноле, 0,2 мл раствора анализируемого экстракта и 2,4 мл 96%-ного этанола. Содержимое кюветы перемешивали. Через 2 минуты измеряли AD5IO (AD5]0 раствора сравнения №2). Затем в кювету добавляли 0,2 мл 0,5%-ного раствора о-фенантролина в 96%-ном этаноле, выдерживали в темноте 10 минут и вновь измеряли AD5I0 (AD5IO опытной пробы). Разведение анализируемой пробы должно быть таким, чтобы измеренная величина /\D510 опытной пробы находилась в интервале от 0,6 до 1,3 AD510, Т.К. В ЭТОМ интервале сохраняется прямолинейность зависимости AD5IO ОТ концентрации антиоксидантов.
Суммарное содержание низкомолекулярных и активность ферментативных антиоксидантов в проростках полыни чернобыльник, лебеды раскидистой и резухи вислоплодной
Показано, что вариабельность всхожести семян полыни чернобыльник снижается в ряду: зима-весна-лето-осень, с максимумом в зимний период, минимум - осенний (рис.4 А). Вариабельность содержания НМАО в проростках также снижается в этом ряду, за исключением летнего сезона, когда этот показатель увеличивается на 11%, относительно среднесезонного значения.
В отличие от полыни чернобыльник вариабельность рассматриваемых признаков у лебеды раскидистой носит иной характер (рис.4 Б). Наблюдается повышение вариабельности суммарного содержания НМАО в проростках в ряду: зима-весна-лето-осень. Можно отметить небольшое снижение на 6-18%, относительно среднего значения по сезону, вариабельности всхожести семян в зимний и весенний периоды, и повышение на 18% - осенью.
У резухи вислоплодной вариабельность изученных нами показателей так же, как у полыни чернобыльник, снижается в ряду: зима-весна-лето-осень. Следует отметить значительное снижение (в 3,2 раза) вариабельности всхожести семян весной (рис.4 Г).
На рис.3 показана взаимосвязь вариабельности всхожести семян и суммарного содержания НМАО проростков полыни чернобыльник, лебеды раскидистой, резухи вислоплодной по сезонам. Установлено, что между вариабельностью всхожести семян и вариабельностью суммарного содержания НМАО в клетках проростков полыни чернобыльник и резухи вислоплодной есть прямая положительная корреляция (рис.5 А и Г). Значения коэффициента корреляции г равны 0,4 и 0,8, соответственно. А у лебеды раскидистой -отрицательная корреляция: г = - 0,6, что статистически достоверно (рис.5 Б). Таким образом, установлено, что вариабельность всхожести семян и вариабельность содержания НМАО в проростках у исследованных нами 3-х видов растений носит видоспецифический характер. Установлена прямая корреляционная зависимость между вариабельностью суммарного содержания НМАО в клетках проростков полыни чернобыльник и резухи вислоплоднои и вариабельностью всхожести семян этих растений, и обратная корреляция этих признаков - у лебеды раскидистой.
