Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1. Митохонлриальпый геном высших растений: структура и репликация 7
1.1.1. Физическая структура и репликация мтДНК высших растений 7
1.1.2. Последовательности митохондриального генома растений 10
1.2. Экспрессия митохондриальных генов высших растений и ее регуляция 14
1.2.1. Регуляция на уровне транскрипции 14
1.2.2. Этапы процессинга РНК в митохондриях растений. Регуляция экспрессии на этапе посттранскрипционных модификаций РНК 19
1.23. Регуляция экспрессии, опосредованная структурой митохондриального генома...24
1.2.4. Трансляция митохондриальных генов растений. Регуляция экспрессии на
трансляционном и посттрансляционном уровне 26
1.3. Признак ЦМС у высших растений 2Н
1.3.1. Источники ЦМС-форм 29
1.3.2. Система генетического контроля ЦМС 33
1.3.2.1. Ядерные гены системы генетического контроля ЦМС 33
1.3.2.2. Митохондриальные генетические факторы, вовлеченные в формирование ЦМС ..38
1.3.2.3. Митохондриальные ЦМС-ассоциированные локусы и предполагаемые молекулярные механизмы развития ЦМС 47
1.3.4. ЦМС у сахарной свеклы (Beta vulgaris) и ее молекулярные основы 50
1.3.4.1. Характеристика признака и система его генетической регуляции 50
1.3.4.2. Митохондриальный геном сахарной свеклы и особенности его структуры и экспрессии в разных типах цитоплазмы 53
ГЛАВА 2. Материалы и методы 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Реактивы, олигонуклеотиды и клонированные последовательности 57
2.1.2. Растительный материал 60
2.2. Методы 62
2.2.1. Конструирование клонотек мтДНК 62
2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот 62
2.2.3. Полимерамая цепная реакция 64
2.2.4. Лигирование, трансформация и рестрикционный анализ 66
2.2.5. Гибридизационные методы 67
2.2.6. Обратная транскрипция 69
2.2.7. Секвенирование 70
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Анализ ассоциированных с признаком ЦМС отличий структуры и транскрипции мтДНК сахарной свеклы в районах нескольких генов-кандидатов 71
3.2. Использование модифицированного RAPD-анализа мтДНК сахарной свеклы для поиска детерминант ЦМС 80
3.3. Структурные вариации митохондриалыюго генома сахарной свеклы в районах гена rps3 и ог/215, ассоциированные с признаком ЦМС 88
3.4. Вариации структуры и спектров транскрипции мтДНК в апозиготических потомствах пыльцестерильных растений сахарной свеклы 93
3.5. Оценка уровня гетероплазмии мтДНК сахарной свеклы в материалах с высокой изменчивостью признака ЦМС с помощью ПЦР в реальном времени 109
Выводы 121
Список использованной литературы j22
Приложение 146
- Этапы процессинга РНК в митохондриях растений. Регуляция экспрессии на этапе посттранскрипционных модификаций РНК
- Митохондриальные генетические факторы, вовлеченные в формирование ЦМС
- Использование модифицированного RAPD-анализа мтДНК сахарной свеклы для поиска детерминант ЦМС
- Вариации структуры и спектров транскрипции мтДНК в апозиготических потомствах пыльцестерильных растений сахарной свеклы
Введение к работе
Большая часть данных, касающихся ядерно-цитоплазматических взаимоотношений у цветковых растений, получена при изучении признака цитоплазматическои мужской стерильности (ЦМС), выражающегося в формировании пыльников с абортивной пыльцой в результате взаимодействия генов ядра и митохондрий.
У культурной сахарной свёклы {Beta vulgaris L.) с ЦМС Оуэновского типа мужскостерильный фенотип (msO) реализуется при сочетании мтДНК S-типа и рецессивных аллелей как минимум двух ядерных Л/-геиов - восстановителей фертилъности (Frj/fri, Frrfjri) в гомозиготном состоянии, мтДНК S-типа характеризуется отличиями от мтДНК нормального (N-) типа в структуре и копийности ряда последовательностей, а также наборе продуктов их экспрессии. Одинаковый набор структурных отличий мтДНК выявлен у всех независимо выделенных ЦМС-форм сахарной свеклы, промежуточные состояния цитоплазмы между N- и S-типами не охарактеризованы. Какие именно изменения мтДНК при взаимодействии с ядерными генами определяют развитие признака ЦМС у сахарной свеклы, остается неизвестным, хотя первые работы по анализу этих изменений имеют более чем 20-летнюю давность.
Экспрессия ЦМС у сахарной свеклы отличается нестабильностью. При опылении ЦМС-растений с полностью нарушеным микроспорогенезом и S-типом цитоплазмы (фенотип msO) пыльцой растений-закрепителей стерильности значительная часть потомков может иметь полустерильную, полуфертильную, и даже полностью фертильную пыльцу. Это свидетельствует о дополнительных источниках изменчивости признака, не связанных с известными Rf-генами, Одним из теоретических источников этой изменчивости может быть гетероплазматическое состояние клеток сахарной свеклы, при котором оба типа мтДНК одновременно присутствуют в тканях одного растения или даже в одной клетке.
Целями настоящей работы являлись поиск неописанных молекулярных маркеров ЦМС, относящихся к транскрибируемым последовательностям мтДНК у сахарной свеклы, а также анализ наличия и уровня гетероплазмии мтДНК в растениях, расщепляющихся по пыльцевому фенотипу. В конкретные задачи работы входило:
1) проанализировать отличия структуры и транскрипции мтДНК сахарной свеклы N-
и S-типа в районах генов cob и nadld, выявленные ранее в лаборатории структуры
генома ИЦиГ. Провести поиск новых ЦМС-ассоциированных изменений в
структуре мтДНК, соответствующих транскрибируемым последовательностям, для
выявления потенциальных детерминант ЦМС;
проанализировать у растений сахарной свеклы с разным пыльцевым фенотипом различия в транскрипционных спектрах генов-кандидатов на роль детерминант ЦМС, выбранных на основе анализа литературных данных; адаптировать метод мтРНК-дисплея для поиска неописанных изменений транскрипции в митохондриях таких растений;
выявить наличие и оценить уровень гетероплазмии по маркерным последовательностям мтДНК у растений разных линий и сортов, отличающихся по экспрессии признака ЦМС, в том числе у апозиготических потомков пыльцестерильных растений сахарной свеклы с фенотипом msO.
Этапы процессинга РНК в митохондриях растений. Регуляция экспрессии на этапе посттранскрипционных модификаций РНК
Последовательности в мтДНК растений, кодирующие белки, тРНК и рРНК. Двумерный электрофорез белков, синтезируемых в митохондриях высших растений в системах трансляции in vitro, указывает на наличие нескольких десятков работающих генов. При этом количество продуктов трансляции может быть практически одинаковым у растений, существенно отличающихся по размерам мтДНК, но в то же время спектр белков может варьировать в зависимости от ткани, стадии дифференцировки и условий роста. Интерпретация эгих данных сложна, поскольку подавляющее большинство белков, обнаруживаемых в митохондриях растений in vivo (это количество оценивается в 2000-3000), импортируется в эти органеллы из ядра (Hochholdinger et al., 2004), а для экспрессии многих митохондриальных последовательностей in organella может не хватать каких-то ядерных факторов. Фактически, ни один мультисубъединичный белок митохондрий не кодируется полностью митохондриальным геномом. При этом возможны вариации в уровне экспрессии и даже структуре зрелых мРНК, кодирующих белки, импортируемые в митохондрии растений, в зависимости от ткани и средовых условий (Handactal.,2001).
ДНК высших растений в основном содержит гены домашнего хозяйства, кодирующие несколько субъединиц комплексов дыхательной цепи, несколько белков биогенеза цитохрома с, часть белков рибосомального комплекса, а также некоторые мембранные белки транспортной системы. Недавно определена функция двух консервативных рамок ог/25 и orfB — оказалось, что они кодируют компоненты F0 комплекса растительной Р0РіАТФ-синтазьі (Heazlewood et al., 2003). На текущий момент известна лишь одна консервативная рамка считывания с неизвестной функцией в мтДНК растений - ген mat-r, расположенный в одном из интронов гена nadl и, вероятно, кодирующий матюразо-подобный белок. Существенная консервативность этого гена делает его последовательность пригодной для молекулярно-филогенетических исследований (Meng et al., 2002). Кроме этого, в мтДНК высших растений закодирована часть рРНК и тРНК митохондриального аппарата трансляции. У разных видов наблюдаются различия в наборах тРНК, как кодируемых в мтДНК, так и импортируемых из цитоплазмы (Small et al., 1999; Notsu et al., 2002). Гены митохондриальных тРНК растений, судя по всему, имеют двойное происхождение - до 98% их происходит от хлоропластной ДНК, оставшаяся часть досталась от гипотетического эубактериального предка митохондрий {Damiano et al., 2002). Белки репликативного, транскрипционного и части трансляционного аппаратов митохондрий высших растений, не считая других ферментативных комплексов, кодируются в ядре. Данные молекулярной филогении свидетельствуют, что скорость переноса ДНК из органелл в ядро на несколько порядков выше, чем обратного переноса. Это объясняют тем, что регуляторные механизмы не в состоянии обеспечить регуляцию экспрессии генов, перенесенных в органеллы из ядра, в отличие от обратного переноса (Thorsness and Weber, 1996; Palmer et al., 2000). Некоторые исследователи полагают, что гены органелл подвергаются большему риску мутировать, чем гены ядра, из-за повышенной продукции в митохондриях свободных радикалов кислорода, и это является одним из факторов, стимулирующих перенос генов из органелл в ядро (Allen and Raven, 1996).
Предполагается, что перенос генов из органелл в ядро происходит через стадию РНК-комплементарных копий (Covello and Gray, 1992; Wichmann and Schuster, 1995). Судя по данным молекулярного филогенетического анализа, эволюция мтДНК сопровождается частым переносом в ядро генов рРНК, но не генов ферментов ЦПЭ (Palmer et al., 2000). Что касается генов рибосомальных белков, то для двух из них, rps8 и rpsJ3, показана полная элиминация из генома митохондрий и замещение их функции ядерными копиями генов хлоропластного происхождения с доставкой продуктов трансляции в митохондрии (Adams et al., 2002).
Некодирующие последовательности мтДНК растений. Ряд генов митохондрий высших растений содержит интроны, большинство из которых относится к группе II и удаляется цис-сплайсингом. Транс-сплайсингом вырезаются несколько интронов в копиях генов nadl, nad2 и nad5 (Malek et al., 1997). Единственный обнаруженный интрон группы I расположен в гене сох! (Sper-Whitis et al., 1996) и филогенетически наиболее близок к интронам грибов. Исследование его распространения среди 341 вида наземных растений из 335 различных родов привело к выводу о его множественном независимом межвидовом переносе (Cho et al., 1998; Gray, 1998). В число некодирующих последовательностей мтДНК растений входят также последовательности, задействованные в сложной комплексной системе регуляции экспрессии генов митохондрий. Кроме этого, характерным свойством мтДНК высших растений является большая доля последовательностей, гомологичных хлоропластной и ядерной ДНК. Большинство их функционально неактивны (Brennicke et al., 1993; Schuster and Brennicke, 1994). Перенос ДНК между растительными клеточными органеллами показан только в одном направлении - от хлорошгастов к митохондриям (Thorsness and Weber, 1996). В эволюции геномов растений распространено и явление переноса мтДНК в ядро, предполагается даже перенос некоторых последовательностей вначале от хлоропластов в митохондрии, а затем из митохондрий - в ядро (Notsu et а]., 2002). Также в мтДНК растений обнаружены последовательности, имеющие высокую гомологию с геномами РНКовых вирусов, транспозонов и ретротранспозонов, и от нескольких десятков до нескольких сотен рамок считывания с неидентифицированными продуктами трансляции, размер которых достаточен для синтеза полипептидов более 100 ак. (Oda et al., 1992; Unseld et al., 1997; Kubo et al., 2000; Marienfeld et al., 1999; Notsu et al., 2002).
Повторенные последовательности в составе мі ДНК высших растений. Для мтДНК высших растений характерны множественные дупликации. Обычно они содержат несколько классов (от 2 до 10) повторяющихся элементов длиной до нескольких сотен пн, а также длинные (до 20 тпн) дуплицированные и триплицированные области, иногда повторенные несколько раз; в мтДНК ЦМС-форм обнаружены и повторы, превышающие 100 тпн. Короткие повторенные последовательности (от 6-7 до нескольких сотен пн) занимают значительную долю мтДНК у некоторых видов: в самых больших из известных мтДНК растений семейства тыквенных повторы могут составлять более 40% (Lilly and Havey, 2001). Именно обилием повторов могут объясняться наблюдаемые 7-8 кратные различия в размерах мтДНК в пределах этого семейства (Levings, 1983). Короткие повторы могут быть разбросаны по всему геному митохондрий, быть вырожденными и перекрываться; предполагается, что многие из них могли возникнуть с участием РНК-посредников. Во многих участках мтДНК разных видов найдены короткие повторы, аналогичные фрагментам генов тРНК, т.н. /-элементы, локализованные возле активно функционирующих генов, и, судя по всему, вовлеченные в механизмы их экспрессии (Spencer at al., 1992). Компьютерным анализом выявлены вырожденные аналоги тандемно расположенных минисателлитных последовательностей в мтДНК (VNTR-локусы) и обсуждается их возможная роль в рекомбинационных событиях. Примеры тандемного расположения повторов выявлены и в мтДНК других видов (Nishizawa et al., 2000).
Митохондриальные генетические факторы, вовлеченные в формирование ЦМС
Обнаруженные у высших растений отличия в структуре мтДНК между нормальными и ЦМС-формами могут заключаться в изменении регуляторних районов, образовании усеченных и химерных orf, изменении копийности и локализации генов и наличии последовательностей, специфичных для мтДНК ЦМС-форм. Кроме этого, с ЦМС часто ассоциированы изменения в спектре плазмидоподобных молекул, интенсивности экспрессии отдельных генов, спектрах транскрипции и трансляции митохондриального генома. Структурные изменения мтДНК, ассоциированные с ЦМС, в большинстве случаев являются множественными и разнотипными, что существенно затрудняет поиск детерминант, ответственных за развитие ЦМС-фенотипа. Исследования последних лет показали, что, за немногими исключениями, стратегия поиска таких детерминант путем сравнения структуры мтДНК нормальных и ЦМС-линий малопродуктивна. Причина этого в том, что различия между геномами в основном отражают эволюционную дивергенцию и не связаны с мужской стерильностью как таковой (Hanson and Bentolila, 2004). Более того, в некоторых случаях развернутый RFLP-анализ вообще не позволяет выявить никаких изменений в структуре мтДНК при развитии ЦМС. В частности, при анализе структуры мтДНК в аллоплазм этических линиях, сочетающих ядро Brassica г ара с цитоплазмой Diplotaxis muralis в районах генов coxll, coxIII, ШрА, Шрб, atp9, cob, nad3, nad6 и nad9 не было выявлено никакого RFLP полиморфизма, несмотря на то, что наблюдалась повышенная экспрессия и изменение спектров транскрипции митохондриальных генов в листовой ткани по сравнению с эуплазматическими линиями (Yamasaki et al., 2004).
Другой стратегией поиска ЦМС-ассоциированных районов в мтДНК является анализ сегрегации отдельных последовательностей мтДНК и пыльцевого фенотипа. Используется слияние протопластов, полученных от ЦМС-растений и нормальных растений, после которого получают соматические гибриды с рекомбинантным митохондриальным геномом: выявление корреляции наследования некоторых митохондриальных последовательностей в его составе с пыльцевой стерильностью позволяет идентифицировать ЦМС-ассоциированные локусы.
Третья стратегия основана на сравнении спектра продуктов экспрессии в ЦМС- и фертильных линиях. Ввиду особенностей транскрипции мтДНК растений, описанных в предыдущем разделе и приводящих к множественности транскриптов индивидуальных генов, спектр которых подвержен сильному влиянию внешних условий, сравнение спектров транскрипции мтДНК нормальных и ЦМС-форм не всегда может привести к успеху даже теоретически. Тем не менее, известны примеры успешного нахождения ЦМС-ассощтированньгх регионов с использованием Нозерн-гибридизации, перекрестного скринирования библиотек кДНК (Xue et al., 1994). Ждут своего применения другие методы, основанные на ОТ-ГТЦР (РНК-дисплей, чиповые технологии). Что касается сравнения белковых спектров, то в случае, если ЦМС-ассоциированный белок синтезируется т organelle в значительных количествах, он может быть идентифицирован. В ближайшем будущем, благодаря быстрому развитию методологической базы протеомики, такой метод может стать высоко эффективным, пока же успешные примеры его использования единичны (FoTde et al., 1978).
Некоторые из химерных последовательностей теоретически могут являться продуктами внутри- или межмолекулярной рекомбинации по повторенным последовательностям из состава мтДНК нормального типа. При этом исходные гены, фрагменты которых объединены в химерные or/, в мтДНК ЦМС-растений всегда представлены и в виде полностью функциональных копий. Уже это показывает, что речь идет не о классических мутациях. Различия между мтДНК нормального и ЦМС-специфичного типа у одного и того же вида могут быть настолько значительными, что крайне маловероятно происхождение ЦМС-специфичного генома от нормального посредством мутаций или перестроек, хотя известны и исключения: так, у табака развитие одной из форм ЦМС связано с делениями в мтДНК некоторых генов NADH-дегидрогеназного комплекса. Общим свойством известных ЦМС-ассоциированных генов является их физическая ассоциация и котранскрипция с функционирующими в норме митохондриальными генами; предполагается, что это необходимо для использования первыми "сигналов экспрессии" вторых. Все известные ЦМС-ассощшрованные гены транслируются с бицистронных мРНК (Budar et al., 2003). Диссоциация ЦМС-ассоцииро ванной orfl38 и котранскрибируемой с ней orfB у редиса в системе ЦМС Kosena ведет к резкому повышению частот спонтанной реверсии к фертильности благодаря утрате ЦМС-гена (Bellaoui et al., 1998). Этот пример иллюстрирует отсутствие жесткой необходимости котранскрипции, несмотря на ее важность для ЦМС-ассоциированных генов.
Химерные гены митохондрий, участвующие в формировании ЦМС, и восстановление фертильности ядерными генами.
У кукурузы (Zea mays) с Т-типом стерильности в развитии ЦМС участвует химерный ген Т-иг/13, образовавшийся в результате набора сложных рекомбинационных перестроек. Т-иг/13 является единственным известным белок-кодирутощим геном в митохондриях растений, не подвергающимся редактированию. Белок T-URF13 (молекулярный вес 13 кДа) олигомеризуется на внутренней мембране митохондрий в порообразующие рецепторы, обуславливающие чувствительность к некоторым грибным токсинам и коммерческим инсектицидам (Saumitou-Laprade et al., 1994; Rhoads et al., 1995). Наличие гена T-urfl3 и его экспрессия являются облигатными в митохондриях ЦМС-растений с Т-типом цитоплазмы. При регенерации из культуры ткани были получены делеционные мутанты, утратившие последовательность Т-иг/13 в мтДНК и восстановившие фертильность (Schnable, Wise, 1998). При восстановлении фертильности ядерньш геном rfia в комбинации с одним из генов Rfl, Rf8 или Rf происходит специфичное удаление 5 концевой части мРНК urfI3/orf221 и белок URF13 не образуется (Dill et al., 1997; Wise et al., 1999). При этом действие гена rf2a, судя по всему, не связано с взаимодействием с продуктами экспрессии T-urfl3.
С С-типом стерильности у кукурузы также связан химерный ієн, состоящий из фрагментов генов atp6, atp9, coxll, а также последовательности хлоропластного происхождения (Hanson and Folkerts, 1992). В мтДНК ЦМС-линий кукурузы S-типа содержится повторенный участок (R повтор), включающий химерные ог/355 и ог/77, а также последовательность IR, гомологичную концевым инвертированным повторам митохондриальных эписом S1 и S2. У ревертантов к фертильности рекомбинация между IR и повторами эписом приводит к делениям R-повтора. У ЦМС-растений по R-повтору синтезируется специфичная мРНК размером 1.6 тн., которая отсутствует у спонтанных ревертантов и подвергается специфичному 5 -процессингу при восстановлении фертильности ядерным геном RJ3 (Zabala et al., 1997; Wen and Chase, 1999). При этом сходному процессингу по неизвестной причине подвергаются и транскрипты генов cob и atp6. Трансляция указанного локуса до сих пор не показана. У некоторых линий кукурузы с S-типом стерильности при — восстановлении фертильности пыльцы эписомы S1 и S2 теряют самостоятельность и встраиваются в мтДНК (Levings and Brown, 1989). Система ЦМС S-типа отличается тем, что действует на гаметофитном уровне: гетерозиготы по гену R/3 являются полустерильными - половина их пыльцевых зерен стерильна, половина фертильна (Wen, Chase, 1999). Недавние исследования еще одного локуса rfl, восстанавливающего фертильность у кукурузы в системе ЦМС S-типа показали, что восстанавливающий фертильность аллель этого локуса рецессивен по отношению к альтернативному локусу Rfl и детален в гомозиготном состоянии. Это указывает на то, что аллель rfl влияет на экспрессию не только ЦМС-ассоциированного локуса orf355/orf77, но и каких-то Ф митохондриальных генов общего значения. И, действительно, показано вызванное наличием этого локуса специфическое снижение продуктов транскрипции и трансляции гена atpA (Wen et al., 2003).
Использование модифицированного RAPD-анализа мтДНК сахарной свеклы для поиска детерминант ЦМС
У В. парт изучена еще одна аллоплазматическая форма ЦМС (Tournefortii-Stiewe), также полученная с использованием цитоплазмы tour. У мс-растений в этой системе показано изменение транскрипции митохондриальных генов cob, nad2 и atp9. Одна из копий atp9, присутствующая в мтДНК ЦМС-растений, изменена с образованием orfl93, котранскрибируемой с atp9 с образованием транскрипта размером 1.58 тпн. Уровень этого траенкрипта понижен у ревертантов к фертильности. По бицистронному транскрипту orfl93/atp9 может образовываться гипотетический полипептид размером 22.7 кДа, часть которого идентична шестой субьединице FoFj -АТФазы, и химерный полипептид размером 30.2 кДа. Предполагается участие одного из этих полипептидов в формировании ЦМС за счет конкуренции с нормальными субъединицами АТФазного комплекса с нарушением АТФ-зависимых функций при формировании пыльцы (Dieterich et al., 2003).
У риса (Oiyza saliva) охарактеризовано несколько систем ЦМС (Saumitou-Laprade, 1994), из которых наиболее изучена ЦМС Ьо-тиа. В мтДНК цитоплазмы bo содержится дополнительная химерная копия гена atp6 (B-atp6), кодирующая часть которого не изменена, а 3 фланкирующая область включает ог/79, которая формируется в результате сложной межмолекулярной рекомбинации между районами генов сох}, сох2 и тРНК et (Saumitou-Laprade, 1994; Schnable and Wise, 1998). Дицистронная мРНК B-atp6lorp9 подвергается интенсивному редактированию. При восстановлении фертильности геном RJ3 происходит специфичный З -процессинг мРНК B-atp6forf79, который зависит от степени редактирования (Iwabuchi et al., 1993). Транскрипция B-atp6/or/79 также подавляется PPR-содержащим локусом Rfl (см. предыдущий раздел).
У сорго (Sorghum bicolor) в мтДНК ЦМС-индуцирующей цитоплазмы Аз содержится ог/107, различные участки которой гомологичны Шр9 и ог/79 риса orflO? кодирует белок весом 12 кДа, имеющий два трансмембранных домена (Pring et all., 1999). За восстановление фертильности в системе ЦМС Аз отвечают два ядерных гена Л/3 и Rf4. Специфичное изменение длины мРНК orflOl осуществляет продукт гена Rf3 (Tang et al., 1998). Такой процессинг необходим, но недостаточен для восстановления фертильности. В цитоплазме Аз развитие ЦМС сопровождается также специфичным подавлением редактирования транскрипта atp6, зависящего от ядерного окружения, в тканях пыльника (Howad and Kempken, 1997). Доминантные аллели гена Rf4 обеспечивают тканеспецифичное редактирование ряда сайтов мРНК гена atp6 (не влияя на интенсивность редактирования мРНК orflOT) и их действие также необходимо для формирования нормальной фертильной пыльцы (Howad and Kempken, 1997; Pring et al., 1999). Другая система ЦМС у сорго характеризуется наличием цитоплазмы 9Е, в мтДНК которой содержится удлиненная с 3 конца копия гена сох/: в результате в цитоплазме 9Е образуется удлиненная на 101 ак. субъединица COXI (Bailey-Serres et al., 1986).
Для ЦМС-форм петунии (Petunia hybrida) специфичен химерный локус S-pcf (от англ. petunia CMS-associated fused gene), который состоит из контранскрибируемых генов pcf, nad3 и rps)2 (Pruitt and Hanson, 1989; Hanson, 1991). Ген pcf содержит участок 5 области гена atp9, фрагменты гена сох2 и неидентифицированную рамку считывания urfS. Синтезируемая с локуса S-pcf мРНК детектируется как в вегетативной, так и спорогенной тканях, а также в клетках суспензионной культуры. Относительное количество разных транскриптов локуса pcf/nad3/rpsl2 варьирует у различных линий. Кроме этого, в цветочных почках выявлен специфичный транскрипт, сайт инициации которого расположен внутри urfS (Hanson et al., 1999). Преобладающий продукт экспрессии гетре/ - белок =25 кДа, который выявляется как в растворимой, так и мембранной фракциях, что характерно для белков наружней мембраны митохондрий (Conley and Hanson, 1995). Аминокислотная последовательность белка 25 кДа кодируется только urfS. При восстановлении фертильности ядерным Д/ -геном полностью элиминируется один из множественных транскриптов гена pcf, изменяется относительное содержание других транскриптов этого гена, и, несмотря на присутствие транскриптов, потенциально способных кодировать белок 25 кДа, он полностью исчезает из митохондрий. Возможно, что элиминирующаяся мРНК является единственной, которая может эффективно транслироваться, но не исключено, что Rf-ген участвует в ядерном контроле уровня трансляции белка 25 кДа (Hanson et al., 1999).
У потомков от скрещивания двух видов подсолнечника Helianthus annuus и Н. petiolaris получены ЦМС-формы с цитоплазмой Я petiolaris РЕТ1 типа. Это связано с наличием в мтДНК РЕТ1 (по сравнению с мтДНК И. annuus) инверсии фрагмента 12 тпн и инсерции 5 тпн, состоящей из фрагментов мтДНК, ядерной ДНК и последовательностей неизвестного происхождения и включающей химерный ген orf522 (Schnable and Wise, 1998). Этот ген котранскрибируется с геном atpA, что приводит к образованию у ЦМС-форм дицистронного транскрипта, дополнительного к моноцистронному транскрипту гена atpA, и кодирующего белок 16 кДа. Компьютерный анализ показал, что гидрофобный N-концевой участок белка ORF522 способен формировать петлевой домен, необходимый для "заякоривания" в мембране (Horn et al., 1996). При восстановлении фертильности Н, anrnius, за которое отвечают два доминантных гена - Rfl и RJ2, наблюдается тканеспецифичная (материнские клетки пыльцы и клетки тапетума) деградация atpA/orf522 мРНК (Smart et al., 1994). При этом никакого изменения транскрипции в вегетативных тканях не обнаружено. Как оказалось, эта тканеспецифичная деградация обеспечивается ткане- и транскрипт-специфичным полиаденилированием мРНК (Gagliardi ands Leaver, 1999).
Альтернативный тип ЦМС у подсолнечника, названный CMS3, отличается от РЕТ1 структурой ряда митохондриальных локусов (Spassova et al., 1994).
У двух видов фасоли (Phaseolus vulgaris и P. coccineus) признак ЦМС ассоциирован с pvs-orf239 (от Phaseolus vulgaris sterility). Этот фрагмент содержит две уникальные orf. pvs-orf98 и pvx-orJ239. Белок ORF239 (молекулярный вес 27 кДа), кодируемый pvs-or/239, интенсивно накапливается в репродуктивных тканях (Abad et al., 1995) и подвергается быстрой деградации в вегетативных тканях специфичными митохондриальными протеазами (Sarria et al., 1998). ORF239 концентрируется в митохондриях и на клеточных стенках развивающихся микроспор, вызывая нарушения их развития (Abad et al., 1995). Удалось добиться экспрессии последовательности pvs-orf239 в трансгенных растениях табака и петунии. Синтезирующийся полипептид ассоциировался только с клеточными стенками микроспор (в митохондриях не выявлялся) и в ряде случаев вызывал стерильность пыльцы (Не et а!., 1996).
Из результатов физического картирования мтДНК ЦМС-форм фасоли следует, что она представлена тремя частично перекрывающимися субгеномными молекулами размером 394, 257 и 210 тпн. Последовательность pvs присутствует только в молекуле 210 тпн. При восстановлении фертильности наблюдается практически полное исчезновение из митохондрий этой молекулы, после чего она сохраняется только на субстехиометрическом уровне (менее одной копии на 100 клеток) и транскрипционно неактивна (Не et al., 1995; Janska et al., 1998; Arrieta-Montiel et al., 2001).
Вариации структуры и спектров транскрипции мтДНК в апозиготических потомствах пыльцестерильных растений сахарной свеклы
Судя по всему, при восстановлении фертильносте под действием ядерных генов последовательность мтДНК остается в целом неизменной. Поскольку нет данных о спектрах субгеномных форм, нет информации и о смещении их соотношений при реверсии.
Полиморфизм мтДНК N- и S-типов. RFLP-анализом выявлены факты межлинейного полиморфизма мтДНК сахарной свеклы как N-типа (Duchenne et al., 1989), так и S-типа (Mikami et al., 1984; Mikami et al,, 1985; Saumitou-Laprade et al., 1991). Степень полиморфизма известных последовательностей мтДНК оказывается невысокой и сравнима с таковой для хпДНК. Данных о уровне межлинейного полиморфизма некодирующих последовательностей нет. Что касается числа повторов, то рестрикционное картирование мтДНК S-типа двух линий TK81-MS и 82RW181 привело к разным выводам относительно общей длины мтДНК и количества повторов, набора и размере предполагаемых субгеномных колец, в то время как порядок расположения сайтов рестрикции в участках между повторами оказался очень схожим (Brears and Lonsdale, 1988; Kubo et al, 1999). Связаны ли эти отличия с влиянием разного ядерного фона, методическими затруднениями или иными факторами, неизвестно. В любом случае, нельзя исключать возможности существования механизмов ядерного контроля над составом и копийностью субгеномных молекул мтДНК сахарной свеклы, подобного описанным примерам у других видов.
Особенности спектров транскрипции и трансляции разных типов мтДНК сахарной свеклы, коррелирующие с ЦМС. Для ряда известных генов в мтДНК S-типа (Scoxl, ScoxII, Satpl, Satp6, Srps3, tatC, nad3b rpsl2 и rpsl3), а также нескольких orf с неизвестной функцией выявлены различия в транскрипционных паттернах по сравнению с N-типом (буква S означает, что потенциальная кодирующая последовательность реорганизована по сравнению с N-типом с образованием химерных последовательностей). Также на разных линейных материалах были зарегистрированы отличия транскрипции генов cob и rps между N- и S-цитоплазмами (Duchenne et al., 1989; Dudareva et al., 1991). Напротив, лишь единственная рамка Norf246 отсутствует в мтДНК S-типа по сравнению с N-типом (Satoh et al., 2004). Поскольку основная информация на этот счет была получена японскими исследователями на одной изогенной паре линий, нельзя исключить, что в случае другого ядерного окружения могут быть выявлены различия в транскрипции других последовательностей между N- и S-цитоплазмами. Как бы то ни было, ни один из этих фактов не удалось связать с Оуэновским типом ЦМС, фенотипическая картина которой у мсО-растениЙ сахарной свеклы не зависит от ядерного фона.
При восстановлении фертильности ядерными генами в разных работах показано изменение спектров транскрипции генов coxl, cob и atpA (Dudareva et al., 1991; Kubo et al., 1999), однако, эти данные не совпадают в разных линейных материалах и не были подтверждены при развернутом анализе транскрипции у ревертантов. Авторы работы (Satoh et al., 2004) делают заключение, что ядерные Rf-геиы вообще не оказывают влияния на транскрипцию каких бы то ни было последовательностей в мтДНК S-типа.
Одномерный электрофоретический анализ in organelle меченных полипептидов не выявил никакого полиморфизма между N- и S- цитоплазмой (Hallden et al., 1992), однако, использование двумерного кислотно-основного электрофореза позволило выявить множественные различия между N и S-цитоплазмами. Тем не менее, анализ трех изогенных пар, различающихся по типу цитоплазмы, этим методом не привел к идентификации продукта трансляции, сцепленного с ЦМС-фенотипом во всех линиях, хотя и выявил сильное влияние ядерного фона на спектр белков митохондрий (Ducos et al., 2001). В предварительных экспериментах по трансляции in organelle обнаружен единственный белок размером 35 кДа, специфичный для Оуэновской S-цитоплазмы мс-растений, но неизвестна последовательность, с которой он мог бы транслироваться (Yamamoto et al., неопубликованные данные: цитировано по Satoh et al., 2004).
Таким образом, ни для одного района мтДНК сахарной свеклы не установлена причинно-следственная связь с формированием ЦМС. Неудача в выявлении такого района после двадцатилетнего поиска привела некоторых исследователей к представлениям о ЦМС у этого вида как "метаболическом дефекте", подверженном сильному влиянию разнообразных, в том числе и средовых факторов. Так, сообщается об индукции мужскостерильного фенотипа у нормальных растений сахарной свеклы продолжительной холодовой обработкой. Полная стерильность достигалась после инкубации растений при 3 С в течение 50 дней или при 5 С в течение 70 дней. Микроскопический анализ показал, что микроспоры и клетки тапетума более чувствительны к низким температурам, чем соматические клетки пыльников и клетки женских генеративных органов (Kuranouchi et al., 2000). Выяснение молекулярных и физиологических механизмов нарушения образования продуктивной пыльцы у этого вида - дело дальнейших исследований.
В работе были использованы: капроновые мембраны ("Хийу Калур", Эстония, "Millipore", США); фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, щелочная фосфатаза, ДНК-лигаза фага Т4, рестриктазы Mbol, BaraHI, NotI, HindlTI, Xhol, EcoRI ("Fermentas", Литва); ATP, dATP, dGTP, dTTP, dCTP (НПО "Вектор", Кольцове, Россия); SDS, ДНКаза I, агароза, лизоцим, р-меркапто этанол, DTT, ЭДТА, трис, спермидин, спермин, NP-40 ("Sigma", США); М-И диметилформамид, NaOH, NaCl, КС], MgCb, KJ, MgS04, NaH2P04, бутана л, фенол, хлороформ, этанол, эфир, сахароза, МпСЬ, СаСЬ, NaAc, ДМСО, КН2РО4, КгНРОд, формальдегид ("Реахим", Россия); глицерин ("Serva", Германия), Ficoll-400, сефакрил S-1000 ("Pharmacia", Швеция); Bind Silan (LKB, Швеция); бумага DE-81, ватман ЗММ ("Whatman", Великобритания); сорбент Crosiex ("Crosiex"); тритон Х-100; формамид ("Merck", Германия); рентгеновская пленка ("AGFA", Германия); бакто триптон, дрожжевой экстракт, агар бакто ("Difco", США); однокилобазный маркер МП, БСА, ампициллин, тетрациклин, X-Gal, СТАВ, СТР, ДНК-лигаза фага Т4 ("Сибэнзим", Новосибирск); a[P32]dATP ("Amershain", Великобритания), вектор pBluescriptJISK+, бактериальные клетки MRF XL Blue, JM109 ("Stratagene", США); ДНКаза Ql, набор для клонирования продуктов ПЦР T-Easy PGemI vector kit ("Promega", США); ДЕПК, ингибитор рибонуклеаз, набор для клонирования продуктов ПЦР "End-polishing Kit", протеиназа К ("Медиген", Россия); ДНКазаГ, РНКазаА (Ленинградский мясокомбинат, Россия), ДНК КРС (НПО "Биолар", Россия), сухое молоко (Новосибирская молочная фабрика).
