Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ФИЗИКО-ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНА ИССЛЕДОВАНИЯ И ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ВОПРОСА 10
1.1. Расположение и рельеф Камчатского полуострова 10
1.2. Климат 11
1.3. Основные ландшафтно-географические зоны 13
1.4. Гидролого-гидрохимический режим 14
1.5. Характеристика гидрографической сети территории и реки Большая 16
1.6. Особенности распространения вирусных заболеваний и питание молоди тихоокеанских лососей 20
1.7. Характеристика лососевых рыбоводных заводов 23
1.8. История изучения вирусных болезней рыб 25
1.9. Краткая характеристика особо опасных вирусных болезней лососевых рыб 28
1.10. Геофафическое распространение и основные направления изучения вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани 31
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА 37
2.1. Вирусологические исследования на перевиваемых линиях клеток 40
2.2. Исследования образцов крови 43
2.3. Электронно-микроскопические исследования 43
2.4. Определение генетического различия и построение филогенетического дерева для изолятов IHNV 44
ГЛАВА 3. ИНФЕКЦИОННЫЙ НЕКРОЗ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ (IHN) И ЕГО
ВЛИЯНИЕ НА ПОПУЛЯЦИИ НЕРКИ В БАССЕЙНЕ Р. БОЛЬШОЙ 47
3.1. Вирусоносительство у половозрелых тихоокеанских лососей на нерестилищах 47
3.2. Течение эпизоотии у заводской молоди 63
3.3. Возможность обнаружения вирусной инфекции у дикой молоди 74
ГЛАВА 4. ПАТОГЕНЕЗ И ВЛИЯНИЕ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ НА ОРГАНИЗМ РЫБ 82
4.1. Признаки патологии во время естественной эпизоотии и при искусственном заражении IHNV 82
4.2. Изменение гематологических показателей в течение болезни 86
4.3. Механизм инфицирования и патогенное воздействие IHNV на организм рыб 90
ГЛАВА 5. МОРФОЛОГИЯ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ (IHNV) 99
5.1. Морфология рабдовирусов 99
5.2. Морфология IHNV 100
5.3. Генетическое типирование камчатских изолятов вируса некроза гемопоэтической ткани 102
ГЛАВА 6. ПУТИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ IHN ЭПИЗООТИИ НА РЫБОВОДНЫХ ЗАВОДАХ 119
6.1. Источник водоснабжения 121
6.2. Отбор производителей 122
6.3. Оплодотворение и дезинфекция икры 123
6.4. Инкубация оплодотворенной икры 126
6.5. Выдерживание личинок и подращивание молоди 128
6.6. Выявление и локализация IHNV 130
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 135
ВЫВОДЫ 138
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 140
- Гидролого-гидрохимический режим
- Вирусологические исследования на перевиваемых линиях клеток
- Течение эпизоотии у заводской молоди
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время исследования в области экологии, связанные с изучением здоровья популяций гидробионтов, являются одним из наиболее перспективных направлений мирового рыбного хозяйства. Эти знания позволяют предупредить развитие заболеваний, предотвратить распространения инфекций и способствуют сохранению ценных промысловых видов рыб.
Одной из наиболее сложных экологических задач общей вирусологии является оценка влияния вирусов на гомеостаз экосистем в целом. Под гомеостазом мы понимаем, способность биологических систем противостоять изменениям и сохранять динамическое постоянство состава и свойств, а также поддерживать устойчивость экосистем вследствие сохранения постоянства видового состава и численности особей в биоценозах (Patten, 1961; Федоров, Соколова, 1972).
Вместе с тем, учитывая мощное влияние паразитических организмов (в частности вирусов) на структуру и численность популяций партнеров по паразитарным цепям, можно предположить их серьезное воздействие на состояние экосистемы в целом. Это влияние совсем не обязательно отрицательное, но оно может становиться таковым при мощном воздействии дестабилизирующих факторов, связанных с нерациональными действиями человека в условиях осуществляемой им хозяйственной деятельности (например, в аквакультуре, при акклиматизации и т.п.) (Беэр, 2002).
Учитывая все вышеизложенное, мониторинговые исследования, направленные на изучение распространения вирусов в популяциях рыб являются весьма актуальными для оценки состояния и прогноза изменения экосистемных трансформаций.
В последнее время большое внимание уделяется филогенетическому анализу различных изолятов вируса инфекционного некроза гемопоэтическои ткани (IHNV), выделенных в разные годы, от разных видов рыб и в различных областях распространения (Arakawa et al., 1990; Nichol et at., 1995; Emmenegger et a!., 2000; Emmenegger, Kurath, 2002; Batts, Winton, 2002; Kurath et al., 2003 и др.). Всестороннее изучение этого вопроса позволит определить, где находится резервуар инфекции, как происходит распространение и эволюция IHNV.
У рыб обнаружено более 250 вирусов, из которых основная часть — в странах с высокоразвитой аквакультурой (США, Франция, Германия, Великобритания, Италия, Норвегия, Япония и др.). Наиболее опасными и экономически значимыми вирусными болезнями лососевых рыб являются: инфекционный некроз гемопоэтическои ткани (IHN); инфекционный некроз поджелудочной железы (IPN) и вирусная геморрагическая септицемия (VHS).
В силу сравнительно невысокого уровня развития аквакультуры и продолжительного экономического кризиса вирусологическое обследование рыб в России не развито. По этой причине эпизоотическая обстановка в отношении вирусных инфекций в нашей стране выглядит относительно благополучно. Однако это благополучие кажущееся, и мы можем наблюдать ухудшение ситуации на примере водоемов и лососевых рыбоводных хозяйств Камчатки.
В исследуемом регионе лососевые рыбы являются ценным объект промысла. Чтобы восполнить их запасы и увеличить вылов, на полуострове стали развивать искусственное воспроизводство. В настоящее время здесь функционируют пять лососевых рыбоводных заводов (ЛРЗ), из которых два занимаются воспроизводством нерки (бассейн реки Большой). Успешная деятельность этих предприятий была осложнена вирусом инфекционного некроза гемопоэтическои ткани, который впервые был выделен на Камчатке в 2001 г. от
производителей нерки, вернувшихся на нерест в водотоки, на которых расположены Малкинский ЛРЗ и ЛРЗ Озерки (Рудакова, 2003). Позднее на первом
Ф заводе у молоди нерки произошла вспышка заболевания, вызванная IHNV
(Рудакова, 2004). Поэтому накопление новых данных о вирусных патогенах всегда представляет большой научный и практический интерес.
Работа посвящена изучению вируса некроза гемопоэтической ткани, его распространению и влиянию на естественные популяции лососей в водоемах
Камчатки, течению эпизоотии на лососевых рыбоводных заводах и генетическому
типированию камчатских изолятов этого агента. Кроме того, в работе представлены мероприятия, направленные на недопущение проникновения IHNV на ЛРЗ. До этого на Камчатке подобных исследований не проводили.
Цель работы - дать оценку состоянию здоровья популяций лососей
^ Камчатки в отношении особо опасных вирусных инфекций, выявить особенности
камчатских изолятов вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани и определить его воздействие на организм рыб в естественных и заводских условиях.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
/v 1. Провести анализ современного научного представления о IHNV;
Выявить распространение IHNV в популяциях половозрелых лососей на нерестилищах;
Определить возможность обнаружения эпизоотии инфекционного некроза гемопоэтическйо ткани (IHN) у молоди в естественных водоемах;
. 4. Изучить течение эпизоотии IHN на лососевом рыбоводном заводе;
Изучить патогенез IHN и оценить его влияние на организм рыб;
Провести генетическое типирование камчатских изолятов и определить степень их отличия от американских изолятов IHNV;
7. Разработать рекомендации, направленные на предотвращение проникновения IHNV на Камчатские ЛРЗ.
Научная новизна. Впервые для России представлены данные по распространению IHNV в естественных популяциях половозрелых тихоокеанских лососей в некоторых водоемах Камчатки, дана оценка их зараженности, вероятности возникновения заболевания и выделения вируса у молоди. Проведен анализ развития и причин эпизоотии IHN у мальков нерки на одном из ЛРЗ Камчатки. Описан патогенез заболевания при искусственном и естественном заражении молоди. Совместно с американскими учеными проведено филогенетическое типирование камчатских изолятов вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани и сравнение их с изолятами, выделенными во всех известных местах его распространения. Представлены дополнения к действующим инструкциям по профилактике и контролю IHNV при искусственном разведении молоди.
Практическая значимость. Результаты настоящих исследований позволяют дать оценку распространению 1HNV в бассейне р. Большой и степени его воздействия на состояние гомеостаза биоценозов. В условиях все возрастающего интереса государственных и частных предприятий к искусственному воспроизводству лососей, оценка эпизоотической обстановки в естественных водоемах позволяет разработать рекомендации по выбору источника водоснабжения и заранее предпринять меры по предотвращению попадания опасных вирусных патогенов на рыбоводные заводы и, следовательно, избежать экономических потерь.
Полученная информация о носительстве вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани, вызывающего одно из наиболее опасных заболеваний лососевых рыб, поможет не допустить его распространения в другие водоемы
России и зарубежья при перевозке икры и живой рыбы для искусственного воспроизводства или акклиматизации.
Представленные меры профилактики и контроля IHNV позволят ограничить проникновение этого патогена на рыбоводные заводы, и сократить связанные с эпизоотиями экономические потери.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы и содержит 10 таблиц, 18 рисунков. Библиографический список использованной литературы включает 199 источников, втом числе иностранных 151.
Общий объем работы 161 страница.
Благодарности. Автор благодарит за помощь при выполнении работы сотрудников КамчатНИРО - Сазонова А.А. Карманову И.В., Карпенко В.И., Бочкову Е.В, Кольцову Н.Н., а также всех коллег, принимавших участие в сборах и первичной обработке биологических материалов во время экспедиционных работ; директора, Сахаровскую Л.В., и работников Малкинского лососевого рыбоводного завода за помощь в описании клинических признаков патологии и предоставленную информацию о квартальном и суммарном отходе мальков нерки во время вспышки IHN. Выражаю благодарность и признательность Щелкунову И.С. (ВНИИПРХ, п. Рыбное, Московской области), Орешковой С.Ф. и Рябчиковой Е.И. (ВГЦиБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область). Отдельно хотелось бы поблагодарить Гэл Кюрат (Западный научно-исследовательский центра по изучению рыб г. Сиэтл, США), помогавшей в освоении метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и генетического типирования изолятов IHNV.
Гидролого-гидрохимический режим
Реки Камчатки относятся к бассейнам Охотского, Берингова морей и Тихого океана. Хребты Срединный и Восточный, простирающиеся почти меридионально вдоль полуострова, обусловили ориентировку рек с внешних склонов в широтном направлении. Исключение составляют главные водные артерии - реки Камчатка и Быстрая, которые берут начало с внутренних склонов этих хребтов и текут по Центрально-Камчатской депрессии, впадая соответственно в Тихий океан и Охотское море. Всего на полуострове насчитывается более 1400 рек и ручьев. Площади водосбора крупных рек составляют 1000-5000 км2. Только несколько рек имеют площадь бассейна свыше 5000 км2 (р. Камчатка - 55700 км2, р. Тигиль -17800 км2, р. Быстрая - 10100 км2, р. Озерная - 7300 км2, р. Еловка - 8200 км2) (Гидрогеология..., 1972).
Большинство рек Камчатки начинается вблизи водоразделов. В хребтах реки протекают в узких каньонообразных либо широких троговых долинах. Русла их изобилуют перекатами и водопадами. Ширина рек обычно не превышает нескольких десятков метров, глубина до 0,5-1,0 м, скорость течения 2,5-3,5 м/сек. Продольные уклоны крупных горных рек достигают 2%, а малых 5%.
В питании рек принимают участие подземные воды, высокогорные снеговые и дождевые воды, в меньшей степени - талые воды равнинных участков. Сезонное подземное питание происходит только в теплый период и достигает максимума преимущественно в октябре. Характерной особенностью региона является наличие больших запасов воды (снега) к концу зимы. В течение 1-2 месяцев реки непрерывно питаются талыми водами с гор (от 10 до 40-50% в общем питании рек). Дождевое питание имеет существенное значение в основном для рек западного побережья Камчатки, где его доля в отдельные годы составляет 20-30%.
В течение 6-8 месяцев в году реки скованы льдом, в теплое время среднемесячная температура воды в них только в июле и августе поднимается выше 10 С. Низкая температура воды в реках обусловлена летними заморозками, поступлением в русла воды из деятельного слоя, поздним таянием снега в горах и наледей, выпадением снега весной и осенью. В реках Камчатки с ледниковым питанием (р. Авача и др.) температура воды вообще не поднимается выше 10 С. Наибольшего прогревания речная вода достигает во второй половине июля; суточные максимумы температуры большей частью лежат в пределах 15-19С. Начиная с августа, температура воды в реках быстро понижается и к концу сентября - началу октября достигает нулевых значений, начинается процесс льдообразования. Замерзают реки в ноябре-декабре. Продолжительность ледостава от 100 дней на крайнем юге Камчатки до 180-200 дней на севере.
Химический состав речных вод Камчатки довольно однообразен. Их общая минерализация обычно составляет 50-120, реже 150-200 мг/л и более. Наличие хорошо промытых почв и фунтов, распространение в северной области многолетнемерзлых пород, замедленный процесс химического выветривания из-за продолжительных низких температур воздуха, обилие выпадающих осадков -все эти факторы обусловливают очень малую минерализацию речных вод Камчатки. Исключение составляют лишь отдельные районы, где поверхностные воды имеют повышенную минерализацию и своеобразный химический состав вследствие выхода минеральных и термальных источников (Ресурсы..., 1973).
По соотношению главных ионов поверхностные воды региона относятся к гидрокарбонатно-кальциевому типу. Внутригодовое изменение минерализации вод - 40-70 мг/л. Минимум отмечается во время весеннее-летнего половодья, а максимум - в зимнюю межень перед вскрытием рек. В период летней межени минерализация остается невысокой. В целом по всей территории содержание ионов в воде рек изменяется: Са - 5,6-10,0 мг/л, Мд - 1,6-7,5 мг/л, Na+K- 2,8-12,8 мг/л, НСО - 24,9-56,6 мг/л, S04 - 6,6-21,4 мг/л, CI — 2,1-11,6 мг/л (Гидрогеология..., 1972).
Воды рек Камчатки характеризуются небольшой общей жесткостью: 2-6 мгхэкв. Реакция воды близка к нейтральной (рН=6,2-8,2, обычно до 7). Окисляемость составляет 1-10 мг Ог/л. Содержание нитритов - от тысячных долей до 2 мг/л с повышением до 5 мг/л во время нереста рыбы. Содержание фосфора во время нереста рыбы в р. Плотникова около 0,12 мг/л (Гидрогеология..., 1972).
Вирусологические исследования на перевиваемых линиях клеток
Отбор материала из популяции рыб осуществляли по лотам (партиям). Под лотом (партией рыб) понимали группу рыб в популяции, имеющих одинаковое происхождение и общий источник водоснабжения.
Для оценки эпизоотической ситуации по вирусным инфекциям объем выборки рыб, отбираемых на исследование из каждого лота, зависит от размера лота и предполагаемого уровня вирусоносительства в нем. Минимальный объем выборки, при котором достигается 95%-«ая вероятность того, что одна или более рыб-вирусоносителей окажутся включенными в состав выборки при уровне вирусоносительства не ниже 2% или 5% рыб, указан в таблице 2.3 (Сборник инструкций..., 1998).
При вспышке болезни на ЛРЗ, отбор проб для вирусологического исследования проводили в начальный период и в разгар заболевания, когда вероятность выделения вируса наиболее высока. При этом, если клинические, патолого-анатомические и эпизоотологические данные позволяли подозревать конкретную вирусную болезнь, на исследование брали не менее 10 живых рыб с выраженными признаками заболевания.
На заводах и в естественных водоемах мальков лососей отбирали методом случайных выборок, доставляли в лабораторию живыми в контейнерах с подачей воздуха из специального кислородного баллона. До исследований их содержали в аквариумах при температуре б-8С, с подачей воздуха компрессором.
Пробы подготавливали в зависимости от размера рыб. Личинок и мальков до 4 см готовили целиком. У первых удаляли желточный мешок. У мальков более 4 см в стерильных условиях вынимали селезенку, почку, печень (Amos, 1985; Fried, 1984). Собранный материал объединяли в пулы по 5 рыб (или их внутренних органов) в каждый. У половозрелых рыб органы (почка, селезенка, головной мозг) и овариальную жидкость отбирали непосредственно на месте вылова и доставляли в лабораторию в пробирках наполненных средой Эрла с добавлением антибиотиков и 10% эмбриональной сыворотки.
Для выделения вирусных агентов использовали линии клеток CHSE-214, СНН-1, RTG-2 и ЕРС. Они чувствительны к наиболее опасным вирусам, таким как: вирус инфекционного некроза поджелудочной железы, вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани, вирус геморрагической септицемии (Yoshimizu et al., 1987).
Культивирование используемых линий клеток проводили по общепринятой методике (Amos, 1985). Использовали основную питательную среду Игла МЭМ с добавлением 10 % сыворотки эмбрионов коров. В среду добавляли антибиотик гентамицин 50 мкг/мл.
Для заражения клеточных культур использовали модифицированную методику, разработанную в вирусологической лаборатории ВНИИПРХ (Сборник инструкций..., 1998). При этом использовали 96-луночные планшеты, в которых клетки образовывали приблизительно 90 % клеточный монослой. Планшеты с зараженными клетками помещали в инкубаторы с температурой 15 С. Наблюдение за состоянием культур клеток проводили ежедневно в течение 14 сут., а затем делали еще 2 пассажа (интервал около двух недель) на свежую культуру клеток той же линии. Результат считали негативным при отсутствии признаков цитопатического эффекта (ЦПЭ) во втором "слепом" пассаже.
Для расчета титра и идентификации вирусов использовали традиционные вирусологические методы - реакцию титрования и реакцию нейтрализации (Сборник инструкций..., 1998). Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся в единице объема суспензии вируса. За инфекционную единицу вируса принимается такая его доза, которая вызывает инфекцию у 50% зараженных ею чувствительных объектов. Такая доза вируса называется инфекционной дозой и обозначается ИДю Титрование на культуре клеток осуществляется по цитопатагенному действию вирусов. В этом случае ИДБО называют тканевой цитопатическои дозой (ТЦДбо), а титр вируса выражают количеством ТЦД50 в 1 мл вирусной суспензии (Лабораторный практикум..., 1983).
class3 ИНФЕКЦИОННЫЙ НЕКРОЗ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ (IHN) И ЕГО
ВЛИЯНИЕ НА ПОПУЛЯЦИИ НЕРКИ В БАССЕЙНЕ Р. БОЛЬШОЙ class3
Течение эпизоотии у заводской молоди
Носительство вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани было обнаружено в 2001 г. у производителей нерки, используемых для заводского воспроизводства на ЛРЗ Малкинский и Озерки (Рудакова, 2003). После выявления вирусоносительства, руководство заводов и главный рыбовод
А Севвострыбвода были предупреждены о возможности эпизоотии у молоди нерки,
выращиваемой на этих ЛРЗ. Так как это был первый случай выделения IHNV на Камчатке, мы руководствовались литературными данными при разработке рекомендуемых профилактических мероприятий.
Во время первого отбора мальков нерки (12.02.02) на МЛРЗ (цех №1) в выростных бассейнах у рыб реакция на раздражители была слабой, отдельные особи плавали на боку. При внешнем осмотре у последних наблюдали потемнение кожных покровов, белые или сероватые тяжи из анального отверстия. У некоторых особей обнаружили кровоизлияния в мускулатуре, у основания грудных, брюшных и анального плавников. При вскрытии отмечали: бледность внутренних органов, кишечник не содержал пищевых масс и был заполнен беловатым содержимым.
По данным рыбоводов, за день до отбора проб, на водозаборе произошла авария, в результате чего в один час ночи прекратилась подача воды в цех №2, а в цех №1 шла сильно загрязненная (заиленная) вода со дна колодца. Утром ситуация стабилизировалась, но после этого увеличился отход нерки в цехе №1.
Регулярное обследование молоди нерки и чавычи из цеха №2 не показали клинических отклонений в развитии этих рыб на протяжении всего периода выращивания. При инокуляции перевиваемых линий клеток ЕРС, CHSE-214 патологическим материалом, отобранным от мальков чавычи и нерки из цеха №2, цитопатического эффекта не выявили, что свидетельствовало об отсутствий вирусных агентов. После инокуляции клеточных культур материалами от нерки из цеха № 1 уже на второй день обнаружили первые признаки разрушения клеточного монослоя.
Развитие ЦПЭ проходило также как и при выделении IHNV у производителей нерки (см. рис. 3.1.2) и начаналось с появления скоплений округлых клеток в форме гроздьев винограда. Через 8 дней после заражения разрушение монослоя в вышеперечисленных пулах достигало 100 % при всех разведениях материала (10й, 10"2, 103). В результате следующего пассажа образцов на вторые сутки цитопатический эффект был обнаружен в тех же пулах, что и в первом пассаже. При последующих отборах нерки из цеха №1 картина поражения клеточного монослоя была аналогичной. Первоначальный диагноз вирусного некроза гемопоэтической ткани на
Малкинском ЛРЗ установили сразу же после появления первых клинических признаков заболевания, так как осенью 2001 г. у производителей нерки, отобранных для заводского воспроизводства, было обнаружено носительство этого вируса (Рудакова, 2003). Позднее диагноз подтвердили реакцией нейтрализации и электронно-микроскопическими исследованиями.
Идентификацию выделенного агента осуществляли в реакции нейтрализации кроличьей сывороткой с антителами к вирусам: инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб (IHNV) и инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV). После 14 дней наблюдения выяснили, что нейтрализация вируса происходила только с антителами к первому вирусу. Индекс нейтрализации 70,79. Провели количественное определение содержания Р- вируса путем титрования на культуре клеток. Титры вируса, выделенного при всех отборах проб, представлены в таблице 3.2.1. Материалом для электронной микроскопии служили монослои клеток из пулов, в которых поражение ЦПЭ составляло не менее 70 %. При просмотре приготовленных образцов с помощью электронного микроскопа обнаружили вирусные частицы пулевидной формы размером 60-80 х 150-220 нм (рис. 3.2.1. А, Б). Сравнение частиц, обнаруженных ранее у производителей нерки из МЛРЗ показало их полную идентичность с частицами, выделенными от молоди (Рудакова, 2003). По морфологическим признакам вирус отнесен к семейству рабдовирусов (Rhabdoviridae). Это РНК-содержащий вирус, окруженный липидной оболочкой, проникает в клетку в основном с помощью эндоцитоза. Синтез и сборка вирусных частиц осуществляется в цитоплазме клетки-хозяина. Затем зрелые частицы отпочковываются от клеточной мембраны (рис. 3.2.1. Б) и скапливаются в межклеточном пространстве (если все клетки разрушены) или поражают новые клетки (Вирусология, 1989).
